CN113667638B - 一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用。其制备方法为：将anti‑RBC与红细胞混合，于40～50℃反应1～2h后，再进行活化，活化结束后加入核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的适配体修饰。本发明以天然生物材料红细胞为基础，构建了能够不借助超速离心、外泌体抗体和复杂提取试剂的外泌体分离体系和方法。

Description

一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，具体涉及一种基于表面修饰的功能化红细胞制备方法和在分离外泌体中的应用。

背景技术

细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是由机体多种细胞主动分泌的纳米级脂质双层膜囊泡，根据其合成、尺寸和生物学特性，胞外囊泡又可进一步分类为外泌体(exosomes)和微小囊泡(microvesicles)。其中，直径约为40～150nm的外泌体广泛存在并分布于血液及各种体液中；通过携带的信号分子，外泌体构成了机体内全新的细胞间信息通讯***，不仅影响细胞的正常生理功能，而且参与多种疾病的发生发展。特别是肿瘤细胞来源的外泌体，其自身以及内含丰富且稳定的多种生物学物质(如：蛋白质、mRNA、miRNA和DNA等)。外泌体具有独特的生物学特性，为肿瘤的液体活检提供了非侵袭性的分子信息。但是现有的外泌体分离技术手段多需要特定的仪器设备(超速离心机)、分离纯度低(亲和吸附)、依赖制备过程复杂的抗体(外泌体分离磁珠)，这些方法难以满足临床对肿瘤来源外泌体研究的需求，极大地限制了其临床应用。因此，发展简单、快速和高效的外泌体离心分离和富集技术，已成为液体活检中实现外泌体检测亟待解决的首要问题。

红细胞是一种天然易得的生物材料，由于膜结构的脂质和表面丰富负电荷，在循环中的红细胞能够互相独立而不聚集在一起，呈现出较好的悬浮稳定性。红细胞具有良好的可塑变形性，在离心力等外力的作用下能产生形变从而减少机械力对其结构的破坏，在分离外泌体的过程中可充当“海绵垫”保护外泌体结构的完整。成熟的红细胞没有细胞核，不需要洗脱就可以随着外泌体一起裂解提取核酸，从而最大程度保存外泌体捕获数量，进而用于下游对外泌体来源DNA、miRNA等核酸分子的分析。而且红细胞膜上有丰富的糖蛋白、简单蛋白及膜收缩蛋白，这些蛋白有些突出在细胞表面，好像伸出在地面上的树枝，如ABH抗原；有些镶嵌在细胞膜内，如Rh抗原，这些丰富的红细胞膜蛋白使其具有大量的修饰位点，便于利用生物分子对红细胞进行功能化改造。

另一方面，传统的外泌体分离磁珠利用抗体捕获外泌体，但蛋白质作为探针分子易受pH、温度等环境因素影响而变性且合成价格昂贵，适配体由DNA或RNA构成(主要是DNA)，比蛋白质体积更小，经筛选富集后，可以拥有与抗原-抗体反应相匹敌的灵敏度，同时合成更容易，稳定性更好。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，基于功能化核酸代替抗体特异性识别靶物质也为该领域研究带来了新的动力。有研究已经利用对外泌体膜表面簇分化抗原CD63具有特异识别功能的适体(aptamer)成功的识别肿瘤外泌体。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用，本发明以天然生物材料红细胞为基础，构建了能够不借助超速离心、外泌体抗体和复杂提取试剂的外泌体分离体系和方法。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于表面修饰的功能化红细胞的制备方法，将anti-RBC与红细胞混合，于40～50℃反应1～2h后，再进行活化，活化结束后加入外泌体的特异性适配体进行修饰。

进一步地，特异性适配体为Apt-CD63，适配体的具体序列如下：CACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTATTTTTTTTTT(SEQ ID NO.1)。

进一步地，适配体还可以是其余能够与外泌体特异性结合的适配体。

进一步地，包括以下步骤：

(1)配制MES缓冲液

(2)分离洗涤红细胞；

(3)将红细胞与anti-RBC以体积比为1:5～50的比例混合，于40～50℃反应1～2h，反应期间翻转反应容器5～6次；

(4)将步骤(3)所得红细胞/anti-RBC复合物、EDC、NHS、MES混合均匀，于室温静置活化15～20min，然后加入适配体，于4℃放置10～12h，期间每15min混匀一次；

(5)于4℃，4000～5000rpm离心步骤(4)所得溶液，然后收集下层的功能化红细胞即可。

进一步地，步骤(4)中红细胞/anti-RBC复合物、EDC、NHS以及适配体的体积比为15～20:1～2:1～2:1。

进一步地，EDC的浓度为5mM；NHS的浓度为12.5mM；适配体的浓度为100μM；红细胞/anti-RBC复合物的浓度为5×10¹²/L。

上述方法制备得到的功能化红细胞。

采用上述功能化红细胞分离外泌体的方法，包括以下步骤：

(1)将血浆用等体积的PBS稀释混匀；

(2)将功能化红细胞与血浆混匀后，4℃，3000～4000rpm离心1～5min后收集固相产物；

(3)用PBS将固相产物吹打混匀，然后加入核酸酶，于4℃，3000～4000rpm离心5～10min，收集离心液相即可获得外泌体。

一种用于进行外泌体分离的试剂盒，包括上述功能化红细胞。

本发明的设计原理如下：

结合天然生物材料红细胞和核酸适配体的优势，利用适配体功能化红细胞，实现对肿瘤细胞来源外泌体的高效富集和分离。首先通过抗红细胞的抗体特异性结合红细胞，抗体的多肽在红细胞表面提供了足够多羧基以作为修饰氨基的适体结合位点；通过氨基羧基的交联反应可将针对外泌体的特异性适体固定在红细胞表面，组成红细胞/抗体/适体的外泌体捕获平台。仅需要将功能化的红细胞与取自病人的体液标本混合，便可通过适体结合游离的外泌体，随后通过简单的离心可将附着在红细胞表面的外泌体一起分离达到外泌体的高效分离富集。外泌体的核酸提取可以直接使用裂解液分解红细胞外泌体结合物，而毋须担心来自红细胞的干扰；而如需得到完整的外泌体，则可以使用核酸酶水解适体链释放捕获的外泌体，此时红细胞随着离心沉积在管底，外泌体由于密度较小则存在于上清液当中。

本发明的有益效果：

1、本发明构建的新型“适配体功能化红细胞”能简单、快速分离并富集外泌体。

2、本发明可以不需要洗脱、超速离心等复杂步骤，将分离的外泌体直接用于后续DNA、mRNA、miRNA等生物分子的分析，使外泌体的研究更加简便、快捷。

3、对于需要保持外泌体结构独立完整的研究，本发明也能达到最大程度保持所获得外泌体的完整和高纯度。

4、比免疫磁珠等其他方法的生物相容性更佳、且原材料易取得，具有成本低、分离效果佳的优势。

附图说明

图1为本发明所述方法的功能化红细胞制备原理图；

图2为适体功能化红细胞表征；

图3为适体功能化红细胞捕获的外泌体；

图4为红色荧光染料标记的适体功能化红细胞捕获的外泌体；

图5为从功能化红细胞上分离被捕获的外泌体。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。

实施例1

构建能够用于外泌体分离的功能化红细胞，其原理如图1所示，具体过程如下：

1、配制MES缓冲液

(1)将0.5325g MES粉末(分子量195.28)加入20mLH₂O中；

(2)用NaOH溶液将上述溶液的pH调至6.0；

(3)加入0.225g NaCl溶液中；

(4)用H₂O调整总体积至50mL。

2、RBC(红细胞)的分离和洗涤

(1)以3500rpm的转速低速离心5Min(枸橼酸钠)抗凝全血，吸掉上层血浆留下红细胞；

(2)向剩余的红细胞当中加入等体积的PBS(0.01M)，并充分颠倒混匀，再次按照步骤(1)当中的转速离心并弃上清、留下红细胞。重复该操作三次；

(3)最后剩下的红细胞重悬在等体积的PBS中。(此时的RBC浓度约为5×10¹²/L)。

3、anti-RBC(抗红细胞抗体)与RBC的反应

将RBC与anti-RBC混合，其中，RBC体积为20μL，anti-RBC体积为1μL；在40℃环境中反应1h，期间翻转混匀容器5次。

4、将Apt-CD63修饰在RBC上

(1)原料

步骤3当中得到的RBC/anti-RBC，用量多少根据需要来定；

EDC(2μL，1mg+1mLH₂O配成5mM)

NHS(2μL，1mg+1mLH₂O配成12.5mM)

MES缓冲液(450μL或400μL)

DNA(Apt-CD63)1μL，100μM。

(2)修饰过程

a、将RBC/anti-RBC复合物、EDC、NHS、MES混合均匀，在室温放置15min以活化“-COOH”；再将Apt-CD63加入以上混合体系中，在4℃环境中放置12h,每15min混匀一次；

b、将溶液在4℃环境下，以4000rpm的转速离心10min，留下层的功能化RBC，并用2倍体积的PBS清洗1次；

c、将剩余的F-RBC(功能化红细胞)存放在4℃冰箱，加入200μL PBS保存。

对制备得到的功能化红细胞进行检测，并以未添加anti-RBC抗体的制备过程所获红细胞作为对照，其表征结果见图2。

如图2所示，图2中A图可以看到直径在7μm左右(红细胞尺寸)的发绿色荧光圆形结构(附图为黑白图片，所以附图中荧光未显，下同)。这是由于红细胞先结合了anti-RBC抗体，以抗体上的“-COOH”为锚定点，再共价连接3’端修饰“-NH₂”的适体。由于适体的5’端还标记了FAM荧光基团，因此在荧光显微镜下看到发绿色荧光的功能化红细胞。

B图中基本没有荧光，这是因为在制备功能化红细胞的过程中未加入anti-RBC抗体，虽然随后加入修饰了“-NH₂”的适体，但是由于缺乏抗体作为桥梁，红细胞表面没能修饰上适体。这说明以anti-RBC抗体结合红细胞作为锚定点，然后连接适体的策略是成功的。

实施例2

采用实施例1构建的功能化红细胞分离外泌体，具体过程如下：

(1)先将血浆(500μL)用等体积PBS稀释，将制备的F-RBC 200μL加入其中振摇混匀30min；

(2)静置5min，离心4℃3000rpm 1min，吸上清留沉淀，此时外泌体存在于管底分离的沉淀中；

(3)用200μL PBS将管底沉积物吹打混匀，加入1μL，0.1U/μL的DNaseⅠ混匀静置十分钟；

(4)在4℃环境以3000rpm离心五分钟，用移液枪吸取上清。此时外泌体即存在于上清当中。

实施例3

1、采用染色技术和荧光显微镜表征功能化红细胞捕获外泌体特性

使用PKH67绿色荧光染料首先将已经分离成功的外泌体染色标记，利用超速离心分离荧光标记的外泌体。随后将功能化的红细胞加入外泌体悬液中，混匀并以于3500rpm离心5min，取沉淀于荧光显微镜下成像。图3A中显示外泌体被绿色荧光的亲脂染料PKH67成功标记，在荧光显微镜下呈现绿色光点。图3B中是功能化红细胞捕获了绿色荧光标记的外泌体，这些附着在红细胞表面的外泌体形成了“圆形光圈”，相反图3C的红细胞在没有修饰适体的情况下，不能捕获外泌体因此没有任何荧光出现。

为了进一步证明外泌体由功能化红细胞捕获，将功能化红细胞和未功能化红细胞用红色荧光染料PKH26染色，再次进行捕获绿色荧光标记外泌体并进行成像。图4A清晰地显示出红色荧光的功能化红细胞捕获绿色荧光标记的外泌体，而图4B的红细胞在没有修饰适体的情况下，不能捕获外泌体因此仅仅只见到红色荧光标记的红细胞。

2、为了获得更纯更完整的外泌体，用核酸酶DNaseⅠ水解了适体链，取上清用荧光成像。图5A清晰地显示出红色荧光的功能化红细胞捕获绿色荧光标记的外泌体，而图5B的是被核酸酶处理后的功能化红细胞，几乎没有任何外泌体附着残留在红细胞表面，证明外泌体已经被成功洗脱。图5C是取上清液成像，可见散布如星点一样的绿色荧光标记的外泌体，证明已经获得完整的外泌体。

序列表

<110> 川北医学院附属医院

重庆市中医院

<120> 一种基于表面修饰的功能化红细胞及其制备方法和在分离外泌体中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccccacct cgctcccgtg acactaatgc tatttttttt tt 42

Claims (4)

1.一种基于表面修饰的功能化红细胞的制备方法，其特征在于，将anti-RBC与红细胞混合，于40~50℃反应1~2h后，再进行活化，活化结束后加入外泌体的特异性适配体进行修饰；所述特异性适配体为Apt-CD63，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；具体制备过程如下：

（1）配制MES缓冲液

（2）分离洗涤红细胞；

（3）将红细胞与anti-RBC以体积比为1:5~50的比例混合，于40~50℃反应1~2h，反应期间翻转反应容器5~6次；

（4）将步骤（3）所得红细胞/anti-RBC复合物、EDC、NHS、MES混合均匀，于室温静置活化15~20min，然后加入特异性适配体，于4℃放置10~12h，期间每15min混匀一次；其中，红细胞/anti-RBC复合物、EDC、NHS以及适配体的体积比为15~20:1~2:1~2:1；

所述EDC的浓度为5mM；NHS的浓度为12.5mM；适配体的浓度为100μM；红细胞/anti-RBC复合物的浓度为5×10¹²/L

（5）于4℃，4000~5000rpm离心步骤（4）所得溶液，然后收集下层的功能化红细胞即可。

2.权利要求1所述方法制备得到的功能化红细胞。

3.采用权利要求2所述的功能化红细胞分离外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将血浆用等体积的PBS稀释混匀；

（2）将功能化红细胞与血浆混匀后，4℃，3000~4000rpm离心1~5min后收集固相产物；

（3）用PBS将固相产物吹打混匀，然后加入核酸酶，于4℃，3000~4000rpm离心5~10min，收集离心液相即可获得外泌体。

4.一种用于进行外泌体分离的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的功能化红细胞。

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