KR101928620B1 - 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브 - Google Patents

표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브 Download PDF

Info

Publication number
KR101928620B1
KR101928620B1 KR1020160083261A KR20160083261A KR101928620B1 KR 101928620 B1 KR101928620 B1 KR 101928620B1 KR 1020160083261 A KR1020160083261 A KR 1020160083261A KR 20160083261 A KR20160083261 A KR 20160083261A KR 101928620 B1 KR101928620 B1 KR 101928620B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bioprobe
cells
pbmc
cell
protein
Prior art date
Application number
KR1020160083261A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180004342A (ko
Inventor
최종훈
황장선
Original Assignee
중앙대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 중앙대학교 산학협력단 filed Critical 중앙대학교 산학협력단
Priority to KR1020160083261A priority Critical patent/KR101928620B1/ko
Priority to PCT/KR2017/006834 priority patent/WO2018004253A2/ko
Publication of KR20180004342A publication Critical patent/KR20180004342A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101928620B1 publication Critical patent/KR101928620B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/205—Aptamer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4737—C-reactive protein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/495—Transforming growth factor [TGF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/58—Atrial natriuretic factor complex; Atriopeptin; Atrial natriuretic peptide [ANP]; Brain natriuretic peptide [BNP, proBNP]; Cardionatrin; Cardiodilatin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 및 상기 압타머와 링커(linker)를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브(bioprobe)에 관한 것으로서, 단백질을 표적화하는 압타머가 살아있는 면역세포가 결합되어 제조된 실시간으로 체내외 단백질을 검출할 수 있는 바이오프로브를 제공한다. 또한, 상기 바이오프로브를 포함하는 단백질 검출용 진단 시약을 제공한다.

Description

표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브{APTAMER-IMMUNE CELL BIOPROBE FOR DETECTING TARGETED PROTEINS}
본 발명은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer)-면역세포 바이오프로브에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 단백질을 표적화하는 압타머가 살아있는 면역세포가 결합되어 제조된, 실시간으로 체내외 표적 단백질을 검출할 수 있는 바이오프로브에 관한 것이다.
압타머란 그 자체로 안정된 삼차구조를 가지면서 표적분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 갖는 단일가닥(single strand) DNA, RNA, 폴리펩타이드 또는 변형핵산을 이르는 것으로, 항체에 비하여 결합력은 비슷하거나 큰 반면, 외부 환경, 즉, 열, pH, 압력 등에 보다 안정적이다. 목적 단백질 및 분자의 특이 도메인에 붙는 압타머의 성질은 형광이나 마커의 도입으로 마이크로어레이(microarray)를 기반으로 하는 바이오센싱에 활용된다.
탐지자(probe)를 통한 목적 단백질의 검출은 여러 방면으로 사용되어 왔으나, 기존 대부분의 검출은 분자 수준의 검출법을 지니고 있다. 항체 또는 형광 입자들을 이용하여 어레이 상에서 표적 단백질이나 세포를 검출하는 방법은 이미 널리 사용되고 있으나, 이러한 방법들은 체외 검출법으로, 체외로 배출된 시료에서 검출이 수행되므로 세포가 속해있는 미세환경의 변화에 대응하기 어렵고 제약이 많이 따르고 있다. 이에 발명자들은 살아있는 면역세포를 이용하여 특정 단백질을 탐지할 수 있는 동시에, 면역세포 본연의 기능을 그대로 유지하고 있는 단백질 검출용 바이오프로브를 제안한다. 그 대표적인 예로서, C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP)에 특이적으로 결합하는 압타머와 말초혈액단핵구(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 결합시킨 바이오프로브를 제공한다.
C 반응성 단백(CRP)은 5개의 원형 서브 구조가 집합하여 이루어진 단백질이다. 혈청 내에 존재하고 간에서 생성되며, 감염이나 염증성 반응에서 혈액 내 증가를 관찰할 수 있고, 특히, 심혈관 질환(cardiovascular disease, CVD)에서 급격히 증가하는 것으로 알려져 있다.
말초혈액단핵구(PBMC)는 부유 세포로서 자극이 없이는 분화하지 않고 독립적이며 선·후천적 면역 반응에 있어 중요한 역할을 담당하고 있다. 특히, 림프구는 혈액 내에서 세포간 면역 반응에 관여하며, 염증성 반응에서 호밍(homing) 메커니즘을 보인다. 이러한 면역 세포에 압타머의 도입은 말초혈액단핵구의 호밍 메커니즘 및 체내에서의 역할을 이미지로 확인할 수 있도록 해준다.
대한민국 특허등록 제10-1402316호 대한민국 특허등록 제10-1502204호
표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 및 상기 압타머와 링커(linker)를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브(bioprobe)를 제공함으로써, 살아있어 본연의 기능을 유지하고 있는 면역세포와 결합된 압타머를 통하여 실시간으로 체내외 단백질을 검출을 가능케 한다.
본 발명의 일 양상은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머, 및 상기 압타머와 링커를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 압타머는 15 내지 250개, 바람직하게는 40 내지 150개, 보다 바람직하게는 70 내지 72개의 뉴클레오타이드를 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 압타머는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 말초혈액단핵구(PBMC), T 세포, B 세포, 호중성구(neutrophil), 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil) 및 단핵구(monocyte)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 검체인 환자의 혈액으로부터 분리되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 링커는 설포-NHS-바이오틴, EDC/NHS-바이오틴, 아민-PEG2-바이오틴, 설포-NHS-LC-바이오틴 및 아비딘(Avidin)으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 단백질은 C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP), 혈관표피성장인자(Vascular endothelial growth factor, VEGF), 인테그린(integrin), BNP2, TGF-β 및 CK-BM으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양상은 상기 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 포함하는 단백질 검출용 진단 시약을 제공한다.
본 발명에 따른 압타커-면역세포 바이오프로브는 살아있는 세포 센서로서, 체내에서 직접 표적 단백질의 존부 및 농도를 검출하여 실시간으로 모니터링을 가능하게 한다. 이러한 검출과 동시에, 면역 매개 세포로서의 기능 또한 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명의 바이오프로브는 약물의 스크리닝, 약물의 효과 판정 등에서도 직접적으로 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 압타머-면역세포 바이오프로브(Apt-PBMC 바이오프로브)를 통한 CRP의 검출과 그 이동상 관찰 모식도를 나타낸다.
도 2는 Apt-PBMC 바이오프로브의 형성 단계별 형광이미지를 나타낸다: 명시야(Bright Field) 이미지(a 및 A), DAPI를 이용한 Apt-PBMC 바이오프로브의 핵 염색 이미지(b 및 B), 스트렙타비딘 PE를 이용한 세포와 링커 사이의 결합 확인 이미지(c 및 C), 5-FAM이 부착된 압타머의 형광 이미지(d 및 D), 및 병합(merge) 이미지(e 및 E).
도 3은 각 농도에서 CRP를 탐지한 Apt-PBMC 바이오프로브의 이미지를 나타내며, 농도에 따라 형광의 세기가 증가하는 것을 확인하였다: 위에서부터 명시야 이미지, DAPI를 이용한 Apt-PBMC 바이오프로브의 핵 염색 이미지, 항-hCRP 항체를 이용한 형광 이미지, 및 병합 이미지.
도 4는 Apt-PBMC 바이오프로브의 TNF-α 분비 확인 실험 결과(A), Apt-PBMC 바이오프로브와 PBMC의 시간에 따른 생존율 확인 시험 결과(B), 및 CRP 농도에 따른 Apt-PBMC 바이오프로브의 검출 그래프(C)를 나타낸다.
도 5는 Apt-PBMC 바이오프로브의 CRP 농도 구배에 따른 이동상 실험 결과를 나타낸다.
본 발명의 일 양상은 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머(aptamer), 및 상기 압타머와 링커(linker)를 통하여 연결된 면역세포를 포함하는 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "압타머"는 특정 단백질 등 물질에 대하여 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA，RNA，폴리펩타이드 또는 변형핵산이다. 이미 특정 단백질에 특이적인 다양한 압타머가 공지되어 있으며，본 발명의 바이오프로브의 검출 목적인 표적 단백질에 따라 그 표적 단백질 등에 특이적인 알맞은 공지된 압타머 또는 신규의 합성 압타머를 선택하여 사용할 수 있으며, 이의 교체로서 다양한 센서로서의 역할을 수행할 수 있다. 상기 압타머는 15 개 내지 250개, 바람직하게는 40 내지 150개, 보다 바람직하게는 70 내지 72개의 뉴클레오타이드를 갖는 것일 수 있다. 뉴클레오타이드의 농도는 50pM인 것이 바람직하며, 50pM 미만인 경우에는 검출능력 감소의 문제가 발생할 수 있다. 상기 압타머는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 압타머는 당해 바이오프로브에 사용되는 링커에 상호결합하는 무기 또는 유기입자, 구체적으로는 비타민, 단백질, 폴리펩타이드 등에 결합된 형태로 사용된다. 예를 들어, 압타머에 연결되는 링커가 스트렙타비딘인 경우, 압타머는 상기 스트렙타비딘과 연결되는 5' 말단에 바이오틴이 부착된 형태로 제조되어 링커에 결합된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역세포(immune cell)"는 자극 없이는 부착되지 않고 자라거나 분화하지 않으며, 혈류를 따라 이동함으로써 표적 물질인 단백질 등이 존재하는 특정 부위, 예를 들어 염증부위나 조직괴사부위에 도달하여 표적 물질인 단백질 등을 직접 포획할 수 있는 것이 바람직하다. 상기 면역세포는 말초혈액단핵구(PBMC), 항원에 노출된 T-세포, B-세포, 호중성구(neutrophil), 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil) 및 단핵구(monocyte)로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 면역세포는 혈액 등 액체 중에서 우수한 이동성 및 특정 물질로의 귀환(homing) 작용을 나타내는 것을 특징으로 하며, 상기 면역세포를 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC)로 대체하는 것도 가능하다.
상기 면역세포는 검체인 환자의 혈액으로부터 분리되는 것일 수 있다. 상기 혈액의 채혈방법은 종래의 공지된 방법을 사용한다. 채혈방법으로서는 질환 또는 건강한 상태 때의 검체인 환자의 말초혈액을 팔의 정맥에서 채혈을 하여　면역세포를 얻는 것이 바람직하나, 면역세포를 함유하는 것이라면 어느 것도 재료로 사용할 수 있다. 채혈한 말초혈액에는 응고가 일어나지 않도록 헤파린, EDTA 또는 구연산을 첨가할 수 있다.
상기 면역세포와 압타머는 8x106/mL:50pM 내지 1x107/mL:50pM의 비율로 포함될 수 있다. 면역세포가 1x105/mL 미만 또는 압타머가 100pM 초과인 경우 세포독성, 세포소실의 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 바이오프로브의 면역세포는 살아있는 상태를 유지하면서 센서로 작용하므로, 혈중에 투여된 후 표적 단백질이 많은 곳으로 이동하여 직접 단백질을 검출하는 한편, 동시에 면역 매개 활동을 수행할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "링커(linker)"는 압타머와 면역세포를 결합시키기 위한 매개체로, 링커의 한 쪽 끝은 압타머와, 다른 한 쪽 끝은 면역세포와 공유결합, 수소결합 등에 의하여 결합을 이루어 두 물질을 연결한다. 상기 링커는 1 또는 2종 이상의 물질이 사용될 수 있으며, 설포-NHS-바이오틴, 스트렙타비딘, EDC/NHS-바이오틴, 아민-PEG2-바이오틴, 설포-NHS-LC-바이오틴 및 아비딘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, Apt-PBMC 바이오프로브를 제조하는 경우, 링커인 설포-NHS-바이오틴은 바이오틴-스트렙타비틴의 상호 결합력을 이용하여 세포 독성이 적은 환경을 유지하며 안정적으로 압타머와 PBMC를 연결한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단백질" 또는 ＂표적 단백질＂은 검체의 혈중에 존재하는 단백질로서 검체의 질병 또는 건강 상태의 변화에 따라 존부 또는 농도가 변화하며，그 단백질의 검출로서 검체의 질병 또는 건강 상태를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 단백질 또는 표적 단백질은 당해 단백질에 특이적인 압타머가 공지되어 있거나 당해 단백질에 특이적인 신규한 압타머를 합성 또는 발견할 수 있다면 본 발명의 단백질 또는 표적 단백질에 포함될 수 있으며，C 반응성 단백, 혈관표피성장인자, 인테그린, BNP2, TGF-β 및 CK-BM으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용되는 용어 "TNF-α"는 염증성 반응에 관여하는 사이토카인으로서, 마크로파지(macrophage) 또는 T 세포로부터 분비되어 IL-1 및 IL-6의 분비를 조절하거나 아포토시스(apoptosis) 등을 통하여 세포 매개 면역반응을 조절하는 물질을 의미한다.
본 발명의 바이오프로브는 생체 내에서 표적 물질들을 직접 검출 가능하도록 하지만, 면역 반응과 항체 등의 간접 영향을 받을 수 있어 제약이 존재할 수 있다. 그러나, 생체 외에서는 특히 미세유체 또는 3D 세포 배양 상에 살아 있는 세포나 여러 분자들을 탑재한 실험에서의 관찰에의 활용이 가능하다.
본 명세서 사용되는 용어 "진단 시약"은 형광이미지를 통하여 체내외에서 표적 단백질의 유무 및 농도를 확인하는 것을 가능하도록 하는 시약을 의미하며, 진단 시약은 제약상 허용되는 담체, 부형제 및/또는 희석제의 제제를 포함할 것이나, 추가로 멸균될 것이고 적합한 장성을 가진다.
상기 진단 시약은 체내에서 사용되는 경우 비경구로 투여되며, 비경구 투여는 혈관주사 주입방식에 의한다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 투여시간, 투여방법 및 진단목적에 따라 그 범위가 다양하다.
상기 진단 시약은 체외에서 사용되는 것도 가능하다. 표적 단백질의 검출을 위한 어세이, 이를 용이하게 하는 키트 형태로 사용가능하며, 이에 한정되지 않는다.
이하 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 입자가 부착된 압타머의 제조
실시예에서 사용된 압타머는 총 72mer의 단일가닥 DNA(서열번호 1 참조)로서, Bioneer사(한국)에서 주문제작하여 사용하였으며, 상기 서열의 5’ 말단에 바이오틴을 붙인 것과, 본 압타머가 세포, 특히 설포-NHS-바이오틴 링커의 도입 부위와 스트렙타비딘이 순차적으로 붙은 부위에 결합 되는지 확인하기 위하여 3’말단에 5-FAM 형광 표지자를 도입한 것을 준비하였다:
(서열 1.1) 5'-바이오틴-GGCAGGAAGACAAACACACAAGCGGGTGGGTGTGTACTATTGCA GTATCTATTCTGTGGTCTGTGGTGCTGT-3’; 및
(서열 1.2) 5’-바이오틴-GGCAGGAAGACAAACACACAAGCGGGTGGGTGTGTACTATTGCA GTATCTATTCTGTGGTCTGTGGTGCTGT-FAM-3’.
실시예 2. 압타머- 면역세포 바이오프로브의 제조
2.1. 면역세포의 준비
배지는 1% 페니실린/스트렙토마이신 첨가 10% 소태아혈청(FBS)을 첨가한 RPMI 1640을 공경 0.2㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 여과한 후 사용하였다. 세포(PBMC)는 해동시킨 후 5% CO2, 37℃에서 16시간 동안 배양하여 컨디션을 회복시킨 후 사용하였다.
2.2. 면역세포에 설포-NHS-바이오틴의 도입
먼저, 16시간 동안 배양된 PBMC를 원심분리(x200g, 7분)하고, 펠렛을 인산완충용액(DPBS(-))으로 세척한 후, PBMC의 세포생존율을 계수하여 1x107개 90% 이상의 세포 생존율을 확보하였다. 세척한 PBMC를 한 번 더 원심분리한 후, 그 펠렛에 1mM 설포-NHS-바이오틴 400㎕를 첨가하고 혼합시켜 실온에서 30분 동안 반응시킴으로써, PBMC의 표면 단밸질의 아민 그룹과의 공유결합을 유도하였으며, 칼슘 이온 등과 같은 잠재적 물질에 의한 세포 독성을 최소화하기 위하여 총 반응시간은 30분 이내로 하였다. 반응시킨 세포를 무혈청 RPMI 1640으로 원심분리(x200g, 7분)하여 상청액을 제거하고, DPBS 400㎕를 첨가하여 2회 세척하였다. 무혈청 RPMI 1640은 PBMC에의 링커 도입에 있어 세포를 보호하게 해주며 환경적 조건을 제공하였다.
본 단계가 잘 이루어졌는지 확인하기 위하여, 1/200로 희석된 스트렙타비딘 피코에리트린(Phycoerythrin, PE) 5㎕/튜브를 첨가하여 세포를 형광염색하여 관찰하였으며, 관찰 결과 피코에리트린에 의하여 세포벽이 적색으로 염색된 것을 확인하였다.
2.3. 압타머의 도입
상기 세포 펠렛에 50㎍/㎖ 스트렙타비딘 400㎕를 첨가한 후, 실온에서 15분 동안 반응시키고 원심분리하여 RPMI 1640으로 2회 세척하였다.
PBS(Ca2 + 및 Mg2 + 포함) 중의 5’말단에 바이오틴이 부착된 압타머(서열 1.1) 100pM와 멸균수를 1:10의 부피비로 혼합한 후, 95℃에서 5분 동안 열처리하여 DNA를 CRP와 결합할 수 있는 초기 조건, 즉 단일가닥으로 분리하고, 4℃에서 10분 동안 급속냉각시켜 그 상태를 유지하였다. 스트렙타비딘-PBMC 바이오프로브가 형성되었는지 여부는 형광염색으로 확인하였다.
상기 세포 펠렛에 바이오틴이 부착된 압타머 10㎕ 및 무혈청 배지 RPMI 1640 390㎖를 첨가하여 실온에서 15분 동안 반응시킨 후, 원심분리하여 상청액을 제거하고 세척하였다. 바이오틴이 부착된 압타머가 세포에 확실히 부착되는지 확인하기 위하여, 같은 방법으로 3’말단에 5-FAM(5-Carboxyfluorescein)이 붙어있는 단일가닥 DNA(서열1.2)를 이용하여 형광이미지를 확인하였다. 형광이미지를 분석한 결과, 바이오틴화 DNA(압타머)는 스트렙타비딘과 마찬가지로 PBMC 표면에 결합되는 것을 확인하였다. 또한, 단계별 에탄올로 세포고정 후 DAPI를 도입하여 PBMC를 염색하여 핵을 확인함으로써, 스트렙타비딘과 압타머가 세포질에 결합됨을 통하여 Apt-PBMC 바이오프로브가 형성되는 과정을 파악 할 수 있었다.
실험예 1. 압타머- 면역세포 바이오프로브의 형광이미지화
이렇게 조합된 Apt-PBMC 바이오프로브의 CRP 포획능을 확인하기 위하여, CRP를 농도별로 준비하여 반응시킨 후 형광 표지자로 라벨링된 항-CRP 항체를 이용하여 이미지화하였다.
세포를 각각 4x105개/㎖씩 튜브에 나누어 담고, CRP를 각 튜브에 0, 0.01, 0.1, 1, 2.5, 5, 10 및 30㎍/㎖이 되도록 첨가한 후 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 이후 원심분리(x200g, 7분)한 후, 2회 세척하여 세포 펠렛을 수거하였다. 여기에 라벨링된 항-CRP 항체를 1:200으로 희석되도록 첨가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 원심분리기를 이용하여 DPBS(-)로 세척하였다.
CRP가 첨가되지 않은 대조군에서는 노이즈 상태의 형광세기가 관찰되었고, CRP의 농도가 진할수록 이미지 상에서 적색 형광의 세기 값은 증가하는 것을 관찰하였다.
10mM CaCl2를 첨가하여 CRP와 반응시킨 후, 잔존하는 칼슘 이온과 BSA, 안정제 등을 여과하여 순수 CRP/Ca2 +를 표준 시료로 이용하였다. Apt-PBMC 바이오프로브에 의해 포획된 CRP/Ca2 +에 동량의 항-CRP 항체를 이용하여 포획을 확인한 결과, 칼슘 이온이 부재하는 것보다 10배 이상의 형광 세기를 확인하였다. CRP 농도에 따른 형광세기 값의 변화는 하기 표로 나타내었으며, image J 소프트웨어를 통하여 15개 이상의 세포의 형광세기 값을 각각 평균으로 나타내었다. 최저 검출한계치(LOD)는 0.05㎍/㎖로 high-sensitivity CRP(hs-CRP)의 0.04㎎/㎖와 비슷한 감도를 나타내므로, 생세포를 기반으로한 고감도 세포 센서로서의 가능성을 확인하였다.
실험예 2. 압타머- 면역세포 바이오프로브의 핵 염색 및 세포 고정
세포고정은 CRP를 포획한 Apt-PBMC 바이오프로브 펠렛에 에탄올을 각각 50%, 70% 및 100%가 되도록 첨가하여 순차적으로 탈수 및 고정되도록 수행하였다. 완전히 고정된 세포를 공기로 건조시킨 후, PBST(-, 0.05% Tween-20)로 2회 세척하였다.
여기에, DAPI 작동 용액(working solution)(4',6-다이아미디노-2-페닐인돌) 1㎖를 첨가하여 5분 동안 핵 염색을 실시하였다. 이후 이를 PBST(-)로 2회 세척한 후 완전히 건조시켰다. 형광 마운팅 배지(fluorescence mounting medium, Dako사) 20㎕를 첨가하고 커버슬립(coverslip)으로 덮어 봉입(매니큐어 처리)한 후 4℃에서 보관하였다.
실험예 3. TNF- α의 정량화
Apt-PBMC가 검출 중에 살아있는 상태를 유지하며 세포 매개 면역반응 조절 세포로서의 기능을 수행함을 확인하기 위하여, PBMC 및 Apt-PBMC를 1.5x105개/웰로 24웰에 분주한 후, 자극제인 리포다당류(lipopolysaccharide, LPS) 0.2㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 총 24시간의 배양 기간 동안 PBMC 내 T 세포를 자극시켜 TNF-α의 분비량을 효소 면역 측정법(ELISA)를 이용하여 TNF-α를 정량화하였다(인간 TNF-α ELISA 키트, R&D 시스템). LPS에 의하여 자극된 PBMC에 비하여, Apt-PBMC 바이오프로브는 대조군 대비 90% 이하의 TNF-α 분비량을 나타내어, 생세포 센서 또는 세포 매개체로서의 역할을 수행하는 것을 확인하였다.
실험예 4. 세포 생존율의 판별
트립판 블루 분석방법(Trypan Blue assay)을 이용하여 세포 생존율을 판별하였다. Apt-PBMC를 제조하고, 해동시킨 PBMC를 16시간 동안 배양하여 안정화시킨 후, 같은 조건(5% CO2, 37℃) 하에서 3일 동안 배양하였다. 12시간마다 세포를 원심분리 및 세척하고, 0.4% 트립판 블루 용액을 첨가한 후, 세포 계수기를 이용하여 세포 생존율을 관찰하였다.
본 발명에서 사용한 설포-NHS-바이오틴 또는 스트렙타비딘의 농도는 세포 표면의 리간드 및 리셉터들에 방해가 적음을 단적으로 확인시켜주고 있다. 이러한 생세포 센서로서의 가능성은 세포생존율의 적은 변화와 형광탐지자를 이용한 이미지 제작 등에 의하여 확인되었으나, 면역세포인 PBMC의 특성에 영향을 미칠 수 있다. TNF-α의 감소는 어떤 의미에서든 첨가된 분자에 의해 세포가 영향을 받고 있음을 증명하기도 하지만, 면역세포로서의 기능적 수행에 있어 제약을 많이 받지 않는 것을 확인시켜주고, 세포 센서에서 세포 생존율은 가장 중요한 조건이 된다. 따라서, Apt-PBMC 바이오프로브를 제조한 후 대조군 PBMC와의 세포 생존율을 72시간 동안 비교하였는데, Apt-PBMC 바이오프로브는 36시간까지 대조군 대비 큰 차이가 없었으며, 이후 조금씩 생존율이 감소하는 것을 확인하였다. 그러나, 3일 이후에도 생존율이 65%이상으로 관찰되어 링커 및 다른 분자들이 세포의 생존율에 크게 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 이는 PBMC를 이용한 생세포 센서가 생체 내외로 사용될 가능성이 있음을 시사하였다.
또한, 트립판 블루 염색법에 의해 염색되지 않은 세포는 트립판 블루를 배출 하는 것으로 이해되며, 세포막 능동수송과 세포 소기관에 첨가된 분자들이 침투하거나 영향을 최소한으로 미치는 것으로도 이해할 수 있었다.
실험예 5. 압타머- 면역세포 바이오프로브의 이동상 확인
DPBS에 용해시킨 CRP(pH 8.0, 0.2% BSA 함유) 용액 50㎕에 염화칼슘(CaCl2)을 10mM가 되도록 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 잔류하는 칼슘 이온을 원심분리(14000rpm, 5분)하여 초미세여과(ultrafiltration)하여 제거하였다(CRP 표준용액).
Apt-PBMC 바이오프로브는 면역세포로서의 역할뿐만 아니라 호밍 분자(homing molecule을 탑재한 세포 센서로서의 역할과 이동이 가능하다. 이것을 증명하기 위하여, 사인펜으로 폭 3mm의 채널을 만들어 소수성 장벽을 만든 에폭시 글래스(epoxy glass) 위에 CRP 표준 용액을 각각 0, 4 및 4㎍/㎖이 되도록 분리하여 첨가하고 4℃에서 반응시켰다. 2% BSA를 이용하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹한 후, PBST로 2회 세척하였다. DAPI 로 염색된 Apt-PBMC 20㎕(1x107개/㎖)를 채널 위에 올리고, 2시간 동안 반응시킨 후, PBS 및 물로 세척하여 Apt-PBMC의 표면 CRP에 부착되는 패턴(이동상)을 확인하였다.
관찰 결과, CRP의 농도가 높은 영역에서 보다 많은 세포(~2x106개/슬라이드)가 관찰되었으며, 나머지 두 영역에서는 각각 ~1.6x105개/슬라이드, ~6x104/슬라이드로 관찰되어 Apt-PBMC 바이오프로브가 CRP의 농도에 의존적으로 이동한다는 것을 확인하였다.
비교예 1. Apt-자성 비드 바이오프로브의 제조
압타머의 존재여부 및 전체 가설의 증명을 위하여, 세포를 산화철 비드로 대체로 하여 Apt-자성 비드(Magnetic bead) 바이오프로브를 제조하였다.
CRP의 농도를 각각 8.4, 16.8 및 25.2ng/㎖로 하여 스트렙타비딘 PE에 의한 형광세기 값(λex/λem = 500/580nm)을 측정하였다. 또한, 카르복시기가 부착된 산화철 비드(M270)를 기반으로 EDC/NHS를 도입하여 바이오틴이 부착된 항-CRP 항체를 결합시킨 후, Apt-자성 비드 바이오프로브를 만들어 직접적인 PBMC를 이용하는 생 세포센서로서의 성능을 평가하였다.
세포를 대체한 산화철 입자가 그 작용 메커니즘에 사용되어, EDS/NHS에 의하여 산화철 비드 표면에 있는 카르복시기를 바이오틴화된 항-CRP 항체의 아민기와 반응하게 하여 두 물질을 결합시킴을 확인하였다.
항체를 산화철 비드에 결합시킨 후, 각각 8.4, 16.8 및 25.2ng/㎖의 CRP 용액을 도입하여, 압타머가 올바르게 작동하는지 여부를 판별하였다. PE가 부착된 스트렙타비딘을 첨가하여 이미지를 확인하였고, 이를 통하여 CRP 농도가 증가함에 따라 PE에 의한 형광세기 값이 증가함을 관찰하였다(p값 < 0.0001). 압타머가 존재하지 않는 대조군에서도 형광세기 값이 관찰되었는데, 이는 산화철/CRP의 바이오틴 부분에 스트렙타비딘 PE가 부착되어 발생한 것으로 판단되었다.
비드에 의한 CRP 검출이기 때문에, 이 방법을 먼저 실험하여 항체의 성능을 검증하였다. CRP 농도에 따라 형광세기 값이 스트렙타비딘 PE에 의하여 증가하는 것을 확인하였고, 대조군에서는 큰 폭의 형광세기 값의 감소를 확인 하였다. 이런 결과들로 인하여, 각각의 생체 분자(biomolecule)의 도입 및 링커의 도입이 가능함을 확인하였고, 또한 CRP 농도에 따른 형광세기 변화도 함께 확인함으로써 세포 센서로서의 기능을 수행할 수 있음을 확인하였다. 또한, 산화철 비드를 코어로 하는 압타머 산화철 비드는 체외에서 탐지자로 이용될 수 있음도 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로, 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CHUNGANG UNIVERSITY INDUSTRY ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> APTAMER-IMMUNE CELL BIOPROBE FOR DETECTING TARGETED PROTEINS <130> PN160132 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial <400> 1 ggcaggaaga caaacacaca agcgggtggg tgtgtactat tgcagtatct attctgtggt 60 ctgtggtgct gt 72

Claims (8)

  1. 말초혈액단핵구(PBMC)에 링커(linker)를 혼합하여 20 내지 30분 동안 반응시키는 단계; 반응시킨 말초혈액단핵구를 무혈청 RPMI 1640 배지로 세척하는 단계; 및 세척된 말초혈액단핵구에, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 압타머(aptamer)를 반응시키는 단계를 포함하여 제조된 표적 단백질 검출용 바이오프로브(bioprobe).
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 말초혈액단핵구는 검체인 환자의 혈액으로부터 분리되는 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 링커는 설포-NHS-바이오틴, EDC/NHS-바이오틴, 아민-PEG2-바이오틴, 설포-NHS-LC-바이오틴 및 아비딘(Avidin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 단백질은 C 반응성 단백(C-reactive protein, CRP)인 것인 표적 단백질 검출용 바이오프로브.
  8. 제 1 항 및 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 표적 단백질 검출용 바이오프로브를 포함하는 표적 단백질 검출용 진단 시약.
KR1020160083261A 2016-07-01 2016-07-01 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브 KR101928620B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160083261A KR101928620B1 (ko) 2016-07-01 2016-07-01 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브
PCT/KR2017/006834 WO2018004253A2 (ko) 2016-07-01 2017-06-28 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020160083261A KR101928620B1 (ko) 2016-07-01 2016-07-01 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180004342A KR20180004342A (ko) 2018-01-11
KR101928620B1 true KR101928620B1 (ko) 2018-12-12

Family

ID=60787370

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020160083261A KR101928620B1 (ko) 2016-07-01 2016-07-01 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101928620B1 (ko)
WO (1) WO2018004253A2 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200095144A (ko) 2019-01-31 2020-08-10 한국기술교육대학교 산학협력단 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108866063A (zh) * 2018-06-28 2018-11-23 中国水产科学研究院珠江水产研究所 一种peg修饰的核酸适配体及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011068909A2 (en) * 2009-12-01 2011-06-09 Brigham And Women's Hospital, Inc. Aptamer cell compositions
US20110318846A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 National Cheng-Kung University Aptamer and detection method for C-reactive protein

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050250094A1 (en) * 2003-05-30 2005-11-10 Nanosphere, Inc. Method for detecting analytes based on evanescent illumination and scatter-based detection of nanoparticle probe complexes
US9283184B2 (en) * 2008-11-24 2016-03-15 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for localized agent delivery
KR101088885B1 (ko) * 2008-12-23 2011-12-07 연세대학교 산학협력단 바이오프로브, 그 제조방법, 상기를 사용한 분석 장치 및 분석 방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011068909A2 (en) * 2009-12-01 2011-06-09 Brigham And Women's Hospital, Inc. Aptamer cell compositions
US20110318846A1 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 National Cheng-Kung University Aptamer and detection method for C-reactive protein

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
2015 한국공업화학회 추계 총회 및 학술대회 초록집, 2P-324, p. 322. (2015.11.04.)*

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200095144A (ko) 2019-01-31 2020-08-10 한국기술교육대학교 산학협력단 표적단백질 검출용 바이오프로브, 이의 제조 방법, 이를 갖는 분석장치 및 그 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180004342A (ko) 2018-01-11
WO2018004253A2 (ko) 2018-01-04
WO2018004253A3 (ko) 2018-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhou et al. Development of an aptasensor for electrochemical detection of exosomes
KR101352222B1 (ko) 의료용 제품에서 비-내독소 발열성 오염물을 보다 잘검출할 수 있는 개선된 단핵구 활성화 시험
JP2021036915A (ja) ダイナミックｂｈ３プロファイリングを使用する毒性を評価するための組成物および方法
KR101878749B1 (ko) 표적 세포의 분리 방법 및 키트
US8900843B2 (en) Kit and method for the capture of tumor cells
KR101341538B1 (ko) 전혈 시료를 이용한 nk 세포의 활성 측정 방법 및 측정 키트
Xu et al. Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research
Liu et al. On-chip structure-switching aptamer-modified magnetic nanobeads for the continuous monitoring of interferon-gamma ex vivo
CN110988364A (zh) 一种应用流式细胞术检测移植后gvhd相关细胞因子的方法及检测试剂盒
Müller Novel tools for the study of cell type-specific exosomes and microvesicles
KR101928620B1 (ko) 표적 단백질 검출을 위한 압타머-면역세포 바이오프로브
Liu et al. A nanoparticle-based affinity sensor that identifies and selects highly cytokine-secreting cells
KR20170102344A (ko) 활동성 결핵의 표시자를 검출하는 방법
Hwang et al. Aptamer-conjugated live human immune cell based biosensors for the accurate detection of C-reactive protein
JP2023100770A (ja) エクソソーム液体生検サンプルの製造装置、及びその製造方法
KR20140080504A (ko) 스크리닝 방법 및 이의 용도
Su et al. High-contrast luminescent immunohistochemistry using PEGylated lanthanide complexes
CN106198962A (zh) 用于封闭生物磁珠的方法
CN107942066A (zh) 白介素‑6检测试剂盒及其制备方法
KR101704828B1 (ko) 체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통한 염증성 질환 진단 방법
KR20140008608A (ko) 입자 복합체 및 이를 이용한 표적 세포 분리 방법
JP2017079635A (ja) 腫瘍細胞を捕捉するためのキャリアー
CN115125287A (zh) 受试者中的心血管疾病发病风险和血管钙化的判定方法及检查试剂盒
KR102323360B1 (ko) 엑소좀 차아집단 액체생검 샘플 제조장치 및 제조방법
WO2020219557A1 (en) Magnetic platelet probes to detect circulating tumor cells

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant