CN115372522A - 一种检测醋酸阿比特龙含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，醋酸阿比特龙样品中醋酸阿比特龙含量按照以下公式计算，y＝14980274.7783x‑420064.5034；式中，x为样品中醋酸阿比特龙的含量，单位为mg/mL，y为液相色谱检测的峰面积。本发明大大缩短了分析时间，节约了时间和试剂成本，流动相更加简便，配制易操作。
Description
技术领域
本发明属于药物分析检测领域，涉及一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，具体涉及一种液相色谱检测醋酸阿比特龙含量的方法。
背景技术
醋酸阿比特龙可抑制CYP17酶，主要用于治疗转移性去势抵抗***癌(mCRPC)，相比于其他药物，该药物使患者生存率提高了36％，中位总生存期增加到14.8个月。而且它还显著增加了疾病进展时间和PSA反应率。
关于醋酸阿比特龙片含量的检测方法，进口药品标准JX20130141美国药典42版有记载，检测时间约70分钟。
杜超公开发表了HPLC测定醋酸阿比特龙的含量与有关物质，该方法建立HPLC测定醋酸阿比特龙的含量与有关物质，为醋酸阿比特龙质量综合评价和控制提供参考。采用Eclipse plus C18(5μm，4.6mm×250mm)，流动相A:乙腈溶液(含2％异丙醇)B:0.01mol/L的醋酸铵溶液，流速:1.0mL/min，波长:254nm，梯度洗脱。适用于醋酸阿比特龙含量与有关物质测定。
杨治国公开发表了高效液相色谱法测定醋酸阿比特龙原料药中有关物质的含量该方法采用高效液相色谱法。色谱柱为Waters XTerra Phenyl，流动相为10mM乙酸铵水溶液-乙腈-甲醇＝(45:45:10，V/V)，稀释剂为乙腈-甲醇-水(70:20:10，V/V)，波长为210nm，进样量20μl，柱温为45℃，流速为1.0mL/min。可以用于醋酸阿比特龙有关物质的测定。
现有技术的检测方法检测时间长，流动相消耗大，检测成本高；流动相配制较为复杂，流动相含盐类物质易析出造成高效液相色谱仪管路堵塞，给检验的操作带来诸多不便；梯度洗脱基线波动较大，液相色谱***稳定性较差；故需要探索更为经济快捷的检测方法。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，大大缩短了分析时间，节约了时间和试剂成本；采用等度洗脱，基线平稳，液相色谱***稳定性更好；流动相更加简单，配制易操作。
本发明采用的技术方案是：本发明提供了一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，该方法为：醋酸阿比特龙样品中醋酸阿比特龙含量按照以下公式计算，
y＝14980274.7783x-420064.5034；
式中，x为样品中醋酸阿比特龙的含量，单位为mg/mL，y为液相色谱检测的峰面积。
进一步地，所述公式按照以下步骤所得：
S1醋酸阿比特龙对照品贮备液的配置：取醋酸阿比特龙标准品125mg，置20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；
S2系列醋酸阿比特龙溶液浓度的配制：分别量取醋酸阿比特龙对照品贮备液0.5mL、0.8mL、1mL、1.2mL和1.5mL，分别置10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀；
S3使用液相色谱检测峰面积：设置液相色谱检测条件，然后将步骤S2中所得到的不同浓度醋酸阿比特龙溶液分别进样10uL进行液相色谱检测，记录峰面积；
S4绘制标准曲线：根据记录的峰面积和对应的进样浓度进行线性回归，绘制出标准工作曲线，得出线性回归方程，列出公式。
进一步地，对醋酸阿比特龙样品进行高效液相色谱检测，将检测得到的峰面积(y)代入线性回归方程计算即可得到该醋酸阿比特龙样品中的醋酸阿比特龙含量(x)。
进一步地，所述步骤S3中，液相色谱检测的条件为，色谱柱为以下三种色谱柱中的一种：
色谱柱1，型号为Agilent Eclipse Plus C18，内径×长度为4.6×100mm，粒径为3.5μm；
色谱柱2，型号为TYPE MGII，内径×长度为3.0×100mm，粒径为3μm；
色谱柱3，型号为AgelaVenusil XBP C18，内径×长度为4.6×150mm，粒径为5μm。
优选地，色谱柱为色谱柱1，型号为Agilent Eclipse Plus C18，内径×长度为4.6×100mm，粒径为3.5μm。
进一步地，液相色谱检测中流动相为乙腈和水，二者体积比为80:20；
进一步地，液相色谱检测中，洗脱方式为等度洗脱。
进一步地，液相色谱检测中，流速为1.0mL/min。
进一步地，液相色谱检测中，柱温为50℃。
进一步地，液相色谱检测中，检测波长为254nm。
本发明的有益效果是：
1.本方法检测时间约10分钟，大大缩短了检测时间；优化了流动相的种类，减少了醋酸铵的使用，操作更加简单方便。
2、采用等度洗脱，提升了液相色谱检测的稳定性。
3.本发明建立液相色谱法测定醋酸阿比特龙含量的方法，灵敏度高，重复性好，且简单易操作，适合用于醋酸阿比特龙片含量的测定，为该药物的质量控制提供参考。
4.本发明创造性的给出了色谱柱的设计，与本发明方法相匹配。
附图说明
图1为本发明定位与分离度测试中得到的空白图谱；
图2为本发明定位与分离度测试中得到的辅料空白图谱；
图3为本发明定位与分离度测试中得到的混合杂质溶液；
图4为本发明定位与分离度测试中得到的醋酸阿比特龙定位；
图5为本发明强降解试验测试中得到的酸破坏样品图谱；
图6为本发明强降解试验测试中得到的碱破坏样品图谱；
图7为本发明强降解试验测试中得到的氧化破坏样品图谱；
图8为本发明强降解试验测试中得到的光照破坏样品图谱；
图9为本发明强降解试验测试中得到的高温破坏样品图谱；
图10为本发明线性与范围测试中得到的线性关系图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本申请及其应用或使用的任何限制。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本申请的范围。同时，应当明白，为了便于描述，附图中所示出的各个部分的尺寸并不是按照实际的比例关系绘制的。对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。应注意到：相似的标号和字母在下面的附图中表示类似项，因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
实施例1
本发明提供了一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，采用液相色谱法，按外标法，以峰面积计算醋酸阿比特龙的含量。
醋酸阿比特龙样品中醋酸阿比特龙含量按照以下公式计算，
y＝14980274.7783x-420064.5034；
式中，x为样品中醋酸阿比特龙的含量，单位为mg/mL，y为液相色谱检测的峰面积。
所述公式按照以下步骤所得：
S1醋酸阿比特龙对照品贮备液的配置：取醋酸阿比特龙标准品125mg，置20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；
S2系列醋酸阿比特龙溶液浓度的配制：分别量取醋酸阿比特龙对照品贮备液0.5mL、0.8mL、1mL、1.2mL和1.5mL，分别置10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀；
S3使用液相色谱检测峰面积：设置液相色谱检测条件，然后将步骤b中所得到的不同浓度醋酸阿比特龙溶液分别进样10μl进行液相色谱检测，记录峰面积；
仪器与试剂
0仪器：高效液相色谱仪(岛津LC-20AT)；
德国梅特勒XS105电子分析天平；
试剂：醋酸阿比特龙片也就是本实施例的醋酸阿比特龙样品(来源：药厂1，批号A)。醋酸阿比特龙对照品也就是本实施例的醋酸阿比特龙标准品，来源：LGC，批号：W1001450，含量：100.17％。乙腈为色谱纯(德国默克股份有限公司)；超纯水为自制。
液相色谱检测的条件为：
色谱柱为以下三种色谱柱中的一种：
色谱柱1，型号为Agilent Eclipse Plus C18，内径×长度为4.6×100mm，粒径为3.5μm；
色谱柱2，型号为TYPE MGII，内径×长度为3.0×100mm，粒径为3μm；
色谱柱3，型号为AgelaVenusil XBP C18，内径×长度为4.6×150mm，粒径为5μm。
本实施例中，色谱柱为色谱柱1。
液相色谱检测中流动相：乙腈-水，乙腈和水的体积比为80:20；本发明流动相只有乙腈和水两个组分，不含盐类物质，使用时不易析出，大大减少了高效液相色谱仪管路堵塞的问题产生。
洗脱方式：等度洗脱；
流速：1.0mL/min；
柱温：50℃；
检测波长：254nm。
S4绘制标准曲线：根据记录的峰面积和对应的进样浓度进行线性回归，绘制出标准工作曲线，得出线性回归方程，列出公式。
按照线性回归方程计算醋酸阿比特龙样品中醋酸阿比特龙含量。将待测定的醋酸阿比特龙样品通过高效液相色谱检测得到的峰面积(x)直接代入线性回归方程计算即可得到相应的醋酸阿比特龙含量(y)。
实施例2
本实施例和实施例1区别在于，本实施例中，色谱柱为色谱柱2。
实施例3
本实施例和实施例1区别在于，本实施例中，色谱柱为色谱柱3。
对本发明的方法进行方法学验证
试剂：醋酸阿比特龙片(来源：药厂1，批号A)。醋酸阿比特龙对照品，来源：LGC，批号：W1001450，含量：100.17％。乙腈为色谱纯(德国默克股份有限公司)；超纯水为自制。
溶液配制
供试品溶液：取醋酸阿比特龙片20片，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于醋酸阿比特龙125mg)，置200mL量瓶中，加乙腈100mL，超声30分钟，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，取续滤液。
对照品溶液：精密称取醋酸阿比特龙对照品12.5mg，置20mL量瓶中，加乙腈适量，超声使溶解，放冷，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
1专属性-定位与分离度
空白：乙腈
辅料贮备液：按厂家提供的处方组成，分别称取各适量，置100mL容量瓶中，加乙腈超声5分钟，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
辅料空白：量取2.5mL滤液置10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。
混合杂质溶液：取厂家提供的混合杂质样品6.25mg置10mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品贮备液：取醋酸阿比特龙对照品125mg，置20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
对照品溶液：精密量取对照品贮备液1mL，置10mL容量瓶中，加乙腈稀释至刻度，摇匀。
分别取上述溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。试验结果见下表，色谱图见图1。
表1专属性试验结果表
试验结论：在选定色谱条件下，空白及辅料不干扰醋酸阿比特龙的检测，醋酸阿比特龙峰的理论塔板数为9191，峰型良好，且与已知杂质可有效分离，专属性较好。
2专属性-强降解试验
取醋酸阿比特龙片细粉适量，采用下述条件，分别进行强酸、强碱、高温、氧化、光照破坏。取破坏后的样品制备成样品溶液，注入液相色谱仪，采用DAD检测器进行检测，考察主峰纯度及主峰与杂质分离度。
酸破坏：取醋酸阿比特龙片细粉适量(含醋酸阿比特龙约为62.5mg)，置100mL容量中，加入1mol/L盐酸溶液2mL，于60℃破坏70min后，加入2mL 1mol/L氢氧化钠溶液中和，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
碱破坏：取醋酸阿比特龙片细粉适量，加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL，于60℃破坏70min后，加入2mL 1mol/L盐酸溶液中和，加乙腈溶解并稀释制成每1mL含醋酸阿比特龙约为0.625mg的溶液。
高温破坏：取醋酸阿比特龙片细粉于105℃下放置4小时，放冷至室温，加乙腈溶解并稀释制成每1mL含醋酸阿比特龙约为0.625mg的溶液。
氧化破坏：取本品适量，加3％双氧水2mL，40℃保温24小时，加乙腈溶解并稀释制成每1mL含醋酸阿比特龙约为0.625mg的溶液。
专属性-强制降解实验结果见表2以及图5-9。
表2专属性-强制降解实验结果
实验结论：醋酸阿比特龙在强酸、强碱、强氧化、高温、光照等极端条件下进行实验，各条件下醋酸阿比特龙峰的纯度角均小于纯度阈值，说明主峰纯度较高，无杂质与主峰重合。醋酸阿比特龙峰与相邻杂质分离度均大于1.5，与杂质分离良好。以上结果说明拟定方法对醋酸阿比特龙含量检测是准确的。
3进样精密度
取专属性项下对照品溶液连续进样6针，考察保留时间及峰面积的重复性。试验结果见下表。
表3精密度试验结果表
试验结论：醋酸阿比特龙峰保留时间RSD为0.05％，峰面积RSD为0.03％，进样精密度良好。
4线性与范围
线性系列溶液：取专属性项下对照品贮备液，分别取0.5mL、0.8mL、1mL、1.2mL、1.5mL置不同10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀。
取线性系列溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归。试验结果见下表和图10。
表4线性试验结果表
试验结论：醋酸阿比特龙在0.3132～0.9395mg/mL范围内，线性方程为y＝14980274.7783x-420064.5034，相关系数为0.9994，线性关系良好。x为样品中醋酸阿比特龙的含量，单位为mg/mL，y为液相色谱检测的峰面积。
5准确度
对照品溶液2：取醋酸阿比特龙对照品约12.5mg，精密称定，置20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀。
按下述方法分别制备80％、100％、120％的准确度测试溶液，每种溶液制备3份。
80％准确度测试溶液：取专属性下辅料贮备液2.5mL，置10mL容量瓶中，精密加入0.8mL对照品贮备液，加乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤。
100％准确度测试溶液：取专属性下辅料贮备液2.5mL，置10mL容量瓶中，精密加入1.0mL对照品贮备液，加乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤。
120％准确度测试溶液：取专属性下辅料贮备液2.5mL，置10mL容量瓶中，精密加入1.2mL对照品贮备液，加乙腈稀释至刻度，摇匀，过滤。
分别取对照溶液、对照溶液2及各测试溶液进样，记录色谱图，计算回收率。
准确度测试结果见表5。
表5准确度测试结果表
试验结论：准确度测试溶液回收率为98.55％-102.25％，平均回收率为100.7％，RSD为1.1％，准确度良好。
6重复性
样品溶液：取醋酸阿比特龙片研成细粉，称取适量(约含醋酸阿比特龙62.5mg)，置100mL容量瓶中，加乙腈超声后稀释至刻度，摇匀，过滤。
重复制备6份样品溶液，取续滤液注入液相色谱仪，记录色谱图，计算样品含量，并考察6份样品含量的重复性。试验结果见下表。
表6重复性试验结果表
试验结论：重复配制6份样品，含量为100.71％-101.1％，平均值为101.0％，RSD为0.2％，重复性良好。
7中间精密度
照重复性项下试验方法，在不同时间，由不同实验员配制6份样品溶液，采用不同的液相色谱仪进行检测，记录色谱图并计算6份样品的含量，并对两次的试验结果进行对比。试验结果见下表。
表7中间精密度试验结果-第二次检测结果
表8中间精密度试验结果-两次检测结果对比
试验结论：第二个实验员于不同日期，在不同仪器配制6份样品，含量为98.98％-100.34％，平均值为99.7％，RSD为0.6％；两人测试同一批样品含量RD为0.6％，中间精密度良好。
8溶液稳定性
取专属性项下对照品溶液，在室温条件下放置，于不同时间点取样注入液相色谱仪，记录色谱图。按峰面积与0小时数据计算回收率。试验结果见下表。
表9溶液稳定性试验结果
试验结论：对照品溶液在室温下放置24小时，期间回收率为99.9％-100.6％，说明醋酸阿比特龙溶液稳定性良好。
9耐用性
分别改变流速(±0.2mL/min)、柱温(±5℃)、乙腈比例(±5％)，并采用同填料不同品牌规格色谱柱，对样品进行检测，考察不同色谱条件下醋酸阿比特龙理论塔板数及样品含量的变化。
其中色谱柱1，型号为Agilent Eclipse Plus C18，内径×长度为4.6×100mm，粒径为3.5μm；
色谱柱2，型号为TYPE MGII，内径×长度为3.0×100mm，粒径为3μm；
色谱柱3，型号为AgelaVenusil XBP C18，内径×长度为4.6×150mm，粒径为5μm。
试验结果见下表。
表10耐用性试验结果
试验结论：改变流速(±0.2mL/min)、柱温(±5℃)、乙腈比例(±5％)及更换同填料不同品牌规格色谱柱，样品含量与选定条件结果均一致，醋酸阿比特龙峰的理论塔板数均大于2000。色谱条件改变对醋酸阿比特龙含量检测影响不明显，此色谱条件耐用性良好。
通过对专属性(杂质定位及破坏试验)、精密度(进样精密度及中间精密度)、准确度、线性与范围、溶液稳定性及耐用性的考察，各项结果均符合验证要求，证明了拟定含量检测方法对醋酸阿比特龙检测的准确性。可按照线性回归方程计算样品中醋酸阿比特龙的含量。
本发明对其它醋酸阿比特龙样品即醋酸阿比特龙片(来源：来源：药厂1，批号B，批号C；药厂2，批号D，批号E，批号F；药厂3，批号G，批号H，批号I)进行了上述方法学验证，各项结果均符合验证要求。可按照线性回归方程计算样品中醋酸阿比特龙的含量。
综上所述，本专利建立了液相色谱法测定醋酸阿比特龙片含量的方法，方法简单、准确、灵敏度高，符合检测要求，适用于醋酸阿比特龙片含量的测定，同时为本品质量标准中含量测定项的修订提供参考和依据，有效提高药物质量，降低临床用药风险。
目前，本发明的技术方案已经进行了中试，即产品在大规模量产前的小规模实验；中试完成后，在小范围内开展了用户使用调研，调研结果表明用户满意度较高；现在已经着手准备产品正式投产进行产业化(包括知识产权风险预警调研)。
以上所述实施方式为本发明的优选实施例，而非本发明可行实施的穷举。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，做出的各种改进，都应当被认为包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，醋酸阿比特龙样品中醋酸阿比特龙含量按照以下公式计算，
y＝14980274.7783x-420064.5034；
式中，x为样品中醋酸阿比特龙的含量，单位为mg/mL，y为液相色谱检测的峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，所述公式按照以下步骤所得：
S1醋酸阿比特龙对照品贮备液的配置：取醋酸阿比特龙标准品125mg，置20mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；
S2系列醋酸阿比特龙溶液浓度的配制：分别量取醋酸阿比特龙对照品贮备液0.5mL、0.8mL、1mL、1.2mL和1.5mL，分别置10mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀；
S3使用液相色谱检测峰面积：设置液相色谱检测条件，然后将步骤S2中所得到的不同浓度醋酸阿比特龙溶液分别进样10uL进行液相色谱检测，记录峰面积；
S4绘制标准曲线：根据记录的峰面积和对应的进样浓度进行线性回归，绘制出标准工作曲线，得出线性回归方程，列出公式。
3.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，对醋酸阿比特龙样品进行高效液相色谱检测，将检测得到的峰面积(y)代入线性回归方程计算即可得到该醋酸阿比特龙样品中的醋酸阿比特龙含量(x)。
4.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，所述步骤S3中，液相色谱检测的条件为，色谱柱为以下三种色谱柱中的一种：
色谱柱1，型号为Agilent Eclipse Plus C18，内径×长度为4.6×100mm，粒径为3.5μm；
色谱柱2，型号为TYPE MGII，内径×长度为3.0×100mm，粒径为3μm；
色谱柱3，型号为AgelaVenusil XBP C18，内径×长度为4.6×150mm，粒径为5μm。
5.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，色谱柱为色谱柱1，型号为Agilent Eclipse Plus C18，内径×长度为4.6×100mm，粒径为3.5μm。
6.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，液相色谱检测中流动相为乙腈和水，二者体积比为80:20。
7.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，液相色谱检测中，洗脱方式为等度洗脱。
8.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，液相色谱检测中，流速为1.0mL/min。
9.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，液相色谱检测中，柱温为50℃。
10.根据权利要求2所述的一种检测醋酸阿比特龙含量的方法，其特征在于，液相色谱检测中，检测波长为254nm。
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| CN116046950A (zh) * | 2023-01-18 | 2023-05-02 | 河北省药品医疗器械检验研究院(河北省化妆品检验研究中心) | 一种检测醋酸阿比特龙中5种杂质的方法 |
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| CN105223282A (zh) * | 2014-06-26 | 2016-01-06 | 深圳海王药业有限公司 | 一种高效液相色谱梯度法测定醋酸阿比特龙有关物质的方法 |
| CN112964800A (zh) * | 2021-02-08 | 2021-06-15 | 江苏万高药业股份有限公司 | 一种醋酸阿比特龙制剂的高效液相检测方法 |
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