CN111595961B - 一种维生素b2有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种维生素B2片中有关物质的分析方法，以磷酸二氢钠溶液和甲醇与乙腈的体积比为3:7的混合溶液作为混合流动相进行梯度洗脱。所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为93～97:7～3。采用本发明的检测方法，专属性高，灵敏度高，回收率高，检出的杂质多，主成分及各杂质在该流动相体系中保留能力较强，响应较高，各杂质间均能有效分离，按加校正因子的主成分自身对照法进行计算杂质含量，增加本发明有关物质检测的准确性，能快速准确的监控维生素B2中的有关物质。

Description

一种维生素B2有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析方法技术领域，具体涉及一种维生素B2片中有关物质的分析方法。
背景技术
维生素B2是体内黄酶类辅基的组成部分，(黄酶在生物氧化还原中发挥递氢作用)，当缺乏时可影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，其病变多表现为口、眼、外生殖器部位的炎症。用于预防和治疗维生素B2缺乏症，如口角炎、唇干裂、舌炎、阴囊炎、结膜炎、脂溢性皮炎等。
为了保证药物的安全有效，需要对药物中的有关物质进行研究、检测和监控。有关物质主要为工艺副产物及降解产物，药品在放置过程中，杂质在发生变化，因此需要根据不同的合成路线和生产工艺、贮藏条件建立合适的分析方法，达到对维生素B2有关物质准确、有效的检测和监控。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种维生素B2中有关物质的检测方法。
本发明的技术方案如下：
一种维生素B2有关物质的检测方法，所述检测方法采用高效液相色谱对维生素B2及有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为磷酸二氢钠溶液，所述流动相B为甲醇与乙腈的体积比为3:7的混合溶液；所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为93～97:7～3；所述梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持初始比例不变；(2)在1-16分钟内，流动相A和流动相B的体积比由初始比例匀速渐变至85:15；(3)在16-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变；(4)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至70:30；(5)在45-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；(6)在55-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至30:70；(7)在60-65分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(8)在65-66分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至初始比例；(9)在66-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持初始比例不变。
本发明的检测方法可用于检测维生素B2原料药、维生素B2片剂中的维生素B2及有关物质。
在一种优选的方案中，当流动相A和流动相B的初始比例为95:5时，所述梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；(2)在1-16分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至85:15；(3)在16-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变；(4)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至70:30；(5)在45-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；(6)在55-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至30:70；(7)在60-65分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(8)在65-66分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至95:5；(9)在66-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5。具体的梯度洗脱过程如下所示：
Figure BDA0002474989170000021
本发明采用高效液相色谱法检测时，采用流动相A(磷酸二氢钠溶液)与流动相B(甲醇与乙腈的体积比为3:7的混合溶液)作为混合流动相进行梯度洗脱，在不影响本发明效果的情况下，磷酸二氢钠溶液中磷酸二氢钠的浓度为0.005mol/L～0.015mol/L；优选为0.01mol/L。
本发明中提到的流动相A的制备可包括以下步骤：将磷酸二氢钠以水溶解并稀释成浓度为0.01mol/L，即得。
本发明中提到的流动相B的制备可包括以下步骤：将甲醇300ml与乙腈700ml混匀即可。
本发明溶解待测样品(例如，维生素B2片剂)采用的溶剂为盐酸水溶液。例如，10％盐酸水溶液、30％盐酸水溶液、40％盐酸水溶液、50％盐酸水溶液、60％盐酸水溶液或80％盐酸水溶液。
本发明采用高效液相色谱法检测时，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。在不影响检测效果的情况下，优选色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。例如：YMC-PACK ODS-AQ(4.6*250mm，5μm)或Inertsustain C18(4.6*250mm，5μm)。
进一步的，高效液相色谱条件包括：检测波长为258nm～268nm，优选267nm。
进一步的，柱温为25℃～35℃，优选为30℃。
进一步的，流速为0.8～1.5ml/min，优选为1.0ml/min。
本发明可以根据需要，选择合适的进样量进样，进样量为80～100μl；优选100μl。例如：进样量为80μl、90μl或100μl。
本发明提及的维生素B2有关物质，
采用本发明的技术方案，优势如下:包括以下物质：杂质A：7,8,10-三甲基-3,10-二氢苯并碟啶-2,4-二酮；杂质B：7,8-二甲基-1,3-二氢苯并碟啶-2,4-二酮；杂质C：6,7-二甲基-8-((2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基)蝶啶-2,4-二酮；杂质D：8-羟甲基-7-甲基-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5四羟基戊基]-3,10二氢苯并碟啶-2,4，-二酮。具体如下所示：
Figure BDA0002474989170000031
Figure BDA0002474989170000041
本发明采用高效液相色谱法，分别从色谱条件等方面进行筛选、优化，拟定有关物质的检测方法，进行方法学验证，对杂质A、杂质B、杂质C和杂质D进行了定量研究，并提供完整的验证方案，操作简单，稳定性和重现性良好。其中，杂质A的校正因子为0.7；杂质B的校正因子为1.0；杂质C的校正因子为2.4；杂质D的校正因子为1.1。
溶解杂质A或杂质B包括如下步骤：以冰乙酸溶解杂质A或杂质B后，再以水定容及稀释；溶解杂质C或杂质D包括如下步骤：以混合流动相溶解杂质C或杂质D后，再定容及稀释，优选地，混合流动相中流动相A和流动相B的体积比为9:1。
本发明提供的检测方法的具体步骤为：分别配制杂质定位溶液、对照品溶液、供试品溶液并进样，通过加校正因子的主成分自身对照法进行杂质含量检测。
本发明采用高效液相色谱法，可以配制如下样品溶液：
供试品溶液：取本品细粉适量(约相当于维生素B2片10mg)精密称定，置100ml量瓶中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。
对照品溶液：0.1％供试品溶液。(稀释剂:水)
杂质定位溶液：称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶中，加溶剂(流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解并稀释至刻度，作为杂质C与杂质D定位母液溶液；另精密称取杂质A对照品、杂质B对照品1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作为杂质A与杂质B定位母液溶液；取各个杂质母液加水制成每1ml中含有对照品A0.03μg、B 0.2μg、C 0.2μg、D 0.2μg的混合溶液，作为混合定位溶液。
本发明通过筛选合适的流动相并优化流动相中各组分比例，选择合适的供试品溶剂、杂质定位用溶剂，筛选合适的其他色谱条件，对维生素B2及有关杂质进行色谱分析，确定了本发明的分析方法，进行了专属性(杂质与主成分分离度实验、强制降解实验)、重复性、精密度、准确的、线性范围、校正因子、耐用性验证，确证方法的可行性。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供的维生素B2有关物质的检测方法，克服了维生素B2在稀碱中易溶但不稳定，而在水、乙醇、三氯甲烷或***等溶剂中几乎不溶，导致的待测液难以配制的难题，在现有技术的基础上，通过筛选合适的流动相并优化流动相中各组分比例，以盐酸水溶液作为供试品溶剂，并优化杂质定位用溶剂，提高了待测样品的稳定性；在确保完全溶解的情况下，以较低浓度的待测液进行色谱分析，灵敏度高、特异性强、重现性好，能够准确的分离已知及相关未知杂质，满足维生素B2片有关物质的检测要求，可用于维生素B2片的质量控制。
附图说明
图1是杂质C以0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解色谱图；
图2是杂质B以0.1mol/L氢氧化钠溶液溶解色谱图；
图3是杂质B以冰乙酸溶解色谱图；
图4是杂质C以流动相A:流动相B的体积比为9:1溶液溶解色谱图；
图5是空白辅料色谱图；
图6是本发明杂质混合溶液定位色谱图；
图7是本发明供试品溶液检测色谱图；
图8是EP9.0供试品溶液检测色谱图；
图9是《中国药典》供试品溶液检测色谱图；
图10是杂质A线性图；
图11是杂质B线性图；
图12是杂质C线性图；
图13是杂质D线性图；
图14是维生素B2线性图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
色谱条件建立
取维生素B2在《中国药典》2015年版2部维生素B2有关物质检测方法与EP9.0维生素B2有关物质检测方法中进行检测，对比试验方法的杂质检出情况。色谱图检测情况见图8-9。
《中国药典》2015年版2部维生素B2的检测方法浓度较低，液相图谱色谱峰峰高为184，检出杂质个数3个。而EP90维生素B2有关物质检测方法浓度大，液相色谱峰峰高为2678，检出杂质个数17个。从两种方法的比较来看，EP方法对杂质检测更合适。
由于本品在碱性条件下不稳定，EP9.0维生素B2的供试品溶剂中含0.1M的氢氧化钠，会导致样品不稳定，不能够准确检测杂质情况。因此，本发明人对有关物质检测方法进行优化，包括梯度选择、溶剂、波长、进样量，现总结如下：
①供试品溶剂及进样量的选择
EP9.0中维生素B2有关物质在稀碱中易溶，但是不稳定，为了达到有关物质检测的准确性及操作可行性，选择稳定的溶剂进行样品检测，参照《中国药典》2015年版二部维生素B2片有关物质供试品溶剂为先加5ml 50％盐酸水溶液振摇，加水定容至刻度，浓度为0.1mg/mL。研究过程中发现该浓度作为有关物质检测浓度较低，无法达到规定的已知杂质限度定量限，因此，将进样量20μl提高至80～100μl，确保各杂质能够准确检出。
②杂质定位溶液的选择
根据杂质梳理表，已知杂质A、B、C、D进行定位研究，配制过程中发现，杂质C与杂质B在0.1mol/L氢氧化钠溶液中检测各出两个峰，可能被破坏，详细图谱见下图1、图2。杂质C更换溶剂(水)溶解，发现一个93.49％的色谱峰，说明杂质C在水中相对稳定，杂质B极其难溶，更换溶剂二氯甲烷进行溶解，并加入乙醇助溶，防止二氯甲烷在反相色谱中形成油珠破坏色谱体系，发现杂质B出一个100％色谱峰，说明杂质B在碱性条件下极易破坏。
杂质A与杂质B的溶剂选择过程中根据供试品溶液进行摸索，选择冰乙酸溶解各杂质，减少或去除溶剂干扰，试验结果表明，称取适量杂质A、杂质B用冰乙酸溶解，再加水稀释定容，发现杂质无溶剂效应或破坏现象，其中杂质B储备液的浓度需要控制在0.01mg/ml才能确保完全溶解。其中杂质B详细图谱见图3。
杂质C与杂质D参照EP9.0使用混合流动相(流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解。其中杂质C详细图谱见图4。
拟定杂质A、B、C、D配制方法为：精密称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶中，加溶剂(流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解并稀释至刻度，作为杂质C与杂质D定位母液溶液；另精密称取杂质A对照品、杂质B对照品1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作为杂质A与杂质B定位母液溶液。
③波长的选择
通过对已知杂质与主成分的波长最大吸收波长进行统计，结果如表1。
表1最大吸收波长统计
内容 最大吸收波长(nm)
杂质A 268
杂质B 260
杂质C 258
杂质D 268
主成分 268
由统计结果可见，波长范围在258nm～268nm之间，与EP9.0中的维生素B2有关物质检测用波长267nm相当。
考察过程中参照《中国药典》2015年版二部维生素B2有关物质波长444nm，另设置444nm考察杂质检出情况，结果杂质B在444nm处未出峰，表明该波长不适用。因此，选择267nm为有关物质检测波长。
④流动相体系的选择
参照EP9.0维生素B2有关物质0.1％磷酸水溶液及相关方法检测，发现主峰后有未知杂质分离不佳的情况，会导致积分不准确，误判杂质量。通过变化流动相体系进行优化，统计如表2所示。
表2流动相体系选择
Figure BDA0002474989170000071
Figure BDA0002474989170000081
本申请在大量实验的基础上，故拟定流动相体系为0.01mol/L磷酸二氢钠-甲醇/乙腈(体积比为3:7)。
实施例：一种维生素B2片有关物质的HPLC检测方法
一、实验材料与仪器
1.药品及试剂：如表3所示。
表3药品及试剂
Figure BDA0002474989170000082
2.仪器：具体仪器的名称和规格，如表4所示。
表4仪器的名称及规格
Figure BDA0002474989170000083
二、液相色谱条件
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，型号为：YMC-PACK ODS-AQ(250×4.6mm，5μm)，流动相A为0.01mol/L磷酸二氢钠溶液，流动相B为甲醇与乙腈的体积比为3:7的混合溶液；梯度洗脱，流速为1.0ml/min，检测波长为267nm，柱温30℃，进样量100μl。
流动相A和流动相B的初始比例为95:5，所述梯度洗脱包括以下步骤：(1)在0-1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；(2)在1-16分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至85:15；(3)在16-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变；(4)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至70:30；(5)在45-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；(6)在55-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至30:70；(7)在60-65分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；(8)在65-66分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至95:5；(9)在66-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5。
样品溶液的配制：
供试品溶液：取本品细粉适量(约相当于维生素B2 10mg)精密称定，置100ml量瓶中，加盐酸溶液50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。
对照品溶液：0.1％供试品溶液。(稀释剂:水)
杂质定位溶液：称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶中，加溶剂(流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解并稀释至刻度，作为杂质C与杂质D定位母液溶液；另精密称取杂质A对照品、杂质B对照品1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作为杂质A与杂质B定位母液溶液；取各个杂质母液加水制成每1ml中含有对照品A 0.03μg、B 0.2μg、C 0.2μg、D 0.2μg的混合溶液，作为混合定位溶液。
三、实验过程
1.方法学验证
1.1专属性
①空白及已知杂质干扰试验
供试品溶液：避光操作。取维生素B2片研细，取细粉适量(约相当于维生素B2 10mg)精密称定，置100ml量瓶中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。
空白辅料溶液：另称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约145mg，配制同供试品溶液。
杂质定位溶液：杂质A对照品、杂质B对照品1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作为杂质A与杂质B定位母液溶液；精密称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶中，加溶剂(流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解，作为杂质C与杂质D定位母液溶液；取各个杂质母液适量加水制成每1ml中含有对照品A0.03μg、B 0.2μg、C 0.2μg、D 0.2μg的混合溶液，作为杂质混合溶液。
精密量取100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，见图5-7，数据总结见表5。
表5维生素B2及各已知杂质专属性数据
名称 保留时间(min) 理论板数
杂质A 44.295 422988
杂质B 51.164 590529
杂质C 6.837 15240
杂质D 18.987 167397
主成分 30.32 47388
空白辅料 / /
注：“/”表示无数据；
结论：本品空白辅料无干扰，各杂质之间、主成分与杂质分离度了良好，理论板数均大于2000。
1.2强制降解试验
分别用高温、酸、碱、氧化、光照等剧烈条件对维生素B2片进行破坏，取各破坏溶液于拟定色谱条件进样测定，比较破坏前后主峰峰面积的变化同时验证该色谱条件能否有效地检出破坏杂质，同步考察主峰与相邻杂质的分离效果及主峰的峰纯度。
未破坏溶液：取维生素B2片，研细，取细粉约154mg(相当于维生素B2 10mg)，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为未破坏溶液。
未破坏稀释溶液：量取上述未破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得未破坏稀释溶液。
光照(固体)破坏溶液：取维生素B2片，研细，于药品光照箱(强度：5000lx)放置5小时，取光照后的细粉约154mg(相当于维生素B210mg)，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为光照(固体)破坏溶液。
空白辅料-光照(固体)破坏溶液：称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约144mg，配制同光照(固体)破坏溶液。
光照(固体)破坏-稀释溶液：量取上述光照(固体)破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得光照(固体)破坏稀释溶液。
光照(溶液)破坏溶液：取维生素B2片，研细，取细粉约154mg(相当于维生素B210mg)，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，于药品光照箱(强度：5000lx)放置1.0小时，滤过，取滤液得光照(溶液)破坏溶液。
空白辅料-光照(溶液)破坏溶液：称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约144mg，配制同光照(溶液)破坏溶液。
光照(溶液)破坏-稀释溶液：量取上述光照(溶液)破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得光照(溶液)破坏稀释溶液。
高温(溶液)破坏溶液：取维生素B2片，研细，取细粉约154mg(相当于维生素B210mg)，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，加水适量，于水浴锅(温度：99℃)加热2.0小时，放冷，用水定容至刻度，滤过，取续滤液得高温(溶液)破坏溶液。
空白辅料-高温(溶液)破坏溶液：称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约144mg，配制同高温(溶液)破坏溶液。
高温(溶液)破坏-稀释溶液：量取上述高温(溶液)破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得高温(溶液)破坏稀释溶液。
高温(固体)破坏溶液：取维生素B2片，研细，于电热鼓风干燥箱(温度：130℃)放置5小时，取高温后的细粉约154mg(相当于维生素B210mg)，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为高温(固体)破坏溶液。
空白辅料-高温(固体)破坏溶液：称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约144mg，配制同高温(固体)破坏溶液。
高温(固体)破坏-稀释溶液：量取上述高温(固体)破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得高温(固体)破坏稀释溶液。
酸破坏溶液：取维生素B2片，研细，取细粉约154mg(相当于维生素B210mg)，加入1.0ml 5M盐酸溶液浸润，置100ml量瓶中放置5小时，加水振摇使溶解，继续加水振摇并稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏溶液。
空白辅料-酸破坏溶液：称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约144mg，配制同酸破坏溶液。
酸破坏-稀释溶液：量取上述酸破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得酸破坏稀释溶液。
碱破坏溶液：取维生素B2片，研细，取细粉约154mg(相当于维生素B210mg)，加入1.0ml 0.5M氢氧化钠溶液浸润溶解，置100ml量瓶中放置5小时，继续加水振摇并稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏溶液。
空白辅料-碱破坏溶液：称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约144mg，配制同碱破坏溶液。
碱破坏-稀释溶液：量取上述碱破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得碱破坏稀释溶液。
氧化破坏溶液：取维生素B2片，研细，取细粉约154mg(相当于维生素B210mg)，加入1.0ml 10％双氧水溶液浸润，置100ml量瓶中放置5小时，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏溶液。
空白辅料-氧化破坏溶液：称取空白辅料(乳糖一水合物、淀粉、聚维酮K30、硬脂酸镁等混合物)约144mg，配制同氧化破坏溶液。
氧化破坏-稀释溶液：量取上述氧化破坏溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水定容至刻度摇匀，得氧化破坏稀释溶液。
精密量取上述各破坏溶液及各破坏辅料溶液各100μl，注入液相色谱仪，采用拟定的色谱条件进行检测，考察破坏前后样品中杂质的变化情况，试验结果见表6。
表6破坏试验杂质统计
Figure BDA0002474989170000121
结论：1)本品在光照、碱、高温形式破坏的条件下均有不同程度的破坏，其降解产物均可被检出，各降解产物与主峰的分离度良好。主成分峰纯度均大于980，符合纯度要求；2)本品在酸条件下稳定。
1.3检测限、定量限
称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶中，加溶剂(流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解并稀释至刻度，作为杂质C与杂质D定位母液溶液；另精密称取杂质A对照品、杂质B对照品1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作为杂质A与杂质B定位母液溶液；取各个杂质母液加水制成每1ml中含有对照品A 0.03μg、B 0.2μg、C 0.2μg、D 0.2μg的混合溶液，作为混合定位溶液，并逐步稀释后进样20μL，以信噪比S/N＝3、S/N＝10分别作为检测限和定量限，结果见表7。
表7检测限、定量限数据
Figure BDA0002474989170000131
1.4重复性
避光操作。取维生素B2片研细，取细粉适量(约相当于维生素B2 10mg)精密称定，置100ml量瓶中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液；精密量取上述供试品溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再量取1.0ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；平行配制6份。精密量取100μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。分别按加校正因子的自身对照法、外标法以峰面积计算本品有关物质含量。已知杂质对比测定结果见表8，加校正因子自身对照计算本品的重复性结果见表9。
表8重复性计算方式结果对比(加校正因子的自身对照法、外标法)
Figure BDA0002474989170000132
Figure BDA0002474989170000141
注：“/”表示未检出
表9重复性检测结果(加校正因子的自身对照法)
Figure BDA0002474989170000142
小结：(1)检出已知杂质B均在0.019％-0.027％范围之内，杂质D均在0.059％-0.092％范围之内，重复性结果良好；通过两种计算方式可见，外标法计算结果与加校正因子的自身对照法计算结果相近。(2)本品重复测定6次检出杂质情况一致，检出量基本一致，说明本方法重复性良好。
1.5中间精密度
照重复性项下样品配制，在不同日期由不同人员用不同仪器，测定样品杂质含量，考察中间精密度，结果见表10。
表10中间精密度数据统计
Figure BDA0002474989170000143
Figure BDA0002474989170000151
总结：在不同日期由不同人员用不同仪器，测定杂质A、杂质C未检出，杂质B检出量在0.019％～0.023％范围内波动，杂质D检出量在0.059％～0.067％范围内波动，未知单杂检出量在0.037％～0.055％范围内波动，总杂全计0.34％～0.37％范围内波动，总杂(0.05％以下不计)0.07％～0.11％范围内波动。由此可知，检测中间精密度良好。
1.6准确度
取维生素B2片(相当于维生素B210.0mg)约154mg，置100ml量瓶中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液。
另精密称取杂质对照品(杂质A、B、C、D)以及维生素B2对照品适量，制成杂质A约为1μg/ml，杂质B、C、D约为10μg/ml的溶液作为杂质对照品储备液，精密称取9份维生素B2片约154mg，置100ml量瓶中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，分别加入各杂质对照品储备液制成80％、100％、120％的回收率供试品溶液(限度按杂质A：0.025％、杂质B：0.2％、杂质C：0.2％、杂质D：0.2％)。结果统计见表11～表14。
表11杂质A回收率数据
Figure BDA0002474989170000152
Figure BDA0002474989170000161
表12杂质B回收率数据
Figure BDA0002474989170000162
表13杂质C回收率数据
Figure BDA0002474989170000163
表14杂质D回收率数据
Figure BDA0002474989170000164
Figure BDA0002474989170000171
小结：杂质A回收率在100.0％～101.6％，平均回收率为101.1％，RSD为0.5％，回收率在90％～108％之间，符合回收率要求；杂质B回收率在98.4％～99.5％，平均回收率为98.9％，RSD为0.4％，回收率在92％～105％之间，符合回收率要求；杂质C回收率在93.1％～105.4％，平均回收率为97.8％，RSD为3.8％，回收率在92％～105％之间，符合回收率要求；杂质D回收率在97.7％～103.7％，平均回收率为100.1％，RSD为2.1％，回收率在92％～105％之间，符合回收率要求。
1.7线性
精密称取杂质A对照品、杂质B对照品1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水稀释至刻度，制成每1ml中含有杂质A约为1μg、杂质B约为10μg的对照品线性储备溶液；精密称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶，加溶剂(动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解，制成每1ml中含有杂质C约为10μg、杂质D约为10μg的对照品线性储备溶液，分别取上述杂质A储备液2.0ml、3.0ml、3.5ml、5.5ml、7.5ml，杂质B储备液约5.0ml、8.0ml、10.0ml、15ml、20ml，杂质C、杂质D储备液约为1.5ml、2.5ml、3.0ml、4.5ml、6.0ml分别于5个100ml量瓶中用水稀释至刻度，作为线性溶液，用上述各杂质溶液照定量限浓度制备定量限混合溶液，用水定容至刻度，摇匀，得到一系列浓度的溶液；线性结果见表15，线性图见图10～14。
表13各杂质线性浓度及峰面积
Figure BDA0002474989170000172
总结：杂质A浓度在0.0009μg/ml～0.09μg/ml范围内呈良好线性，相关系数r为1；杂质B浓度在0.0011μg/ml～0.78μg/ml范围内呈良好线性，相关系数r为1；杂质C浓度在0.0028μg/ml～0.70μg/ml范围内呈良好线性，相关系数r为0.99995；杂质D浓度在0.0009μg/ml～0.65μg/ml范围内呈良好线性，相关系数r为1；维生素B2浓度在0.002μg/ml～0.202μg/ml范围内呈良好线性，相关系数r为0.9991。
1.8校正因子
取杂质(杂质A、B、C、D)对照品及维生素B2对照品，在限量浓度的50％～200％内共制备5份样品，配制方式同线性项下。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归并求出各杂质的标准曲线和维生素B2的标准曲线。
采用维生素B2的标准曲线斜率与杂质的标准曲线斜率之比，即为校正因子。采用不同时间、不同人员、不同色谱柱和不同仪器进行测定。测定结果见表16。
表16杂质校正因子的测定
Figure BDA0002474989170000181
1.9溶液稳定性
①供试品溶液稳定性
取维生素B2片约154mg(相当于维生素B2 10mg)，置100ml量瓶中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液作为供试品溶液；分别于0h、6h、12h、18h测定，考察样品溶液的稳定性，结果见表17。
表17维生素B2样品溶液稳定性数据统计
Figure BDA0002474989170000191
结论：由上表数据统计结果可见，杂质B检出杂质含量0.017％～0.020％范围内波动，杂质D检出杂质含量0.057％～0.061％范围内波动，未知单杂(除A外，大于0.05％)杂质含量0.052％～0.054％范围内波动，总杂(全计)杂质含量0.32％～0.36％范围内波动，总杂(0.05％以下不计)杂质含量0.11％～0.11％范围内波动，未见杂质出现明显变化趋势，稳定性良好，说明供试品溶液在18小时内稳定。
②对照溶液稳定性
称取杂质C对照品、杂质D对照品约1mg分别置10ml量瓶中，加溶剂(流动相A:流动相B的体积比为9:1)溶解稀释定容至刻度，摇匀，作为杂质C与杂质D定位母液溶液；另精密称取杂质A对照品、杂质B对照品各1mg分别置100ml量瓶中，加冰乙酸(3ml)溶解后用水稀释至刻度，摇匀，作为杂质A与杂质B定位母液溶液；取各个杂质母液加水制成每1ml中含有对照品A 0.03μg、B 0.2μg、C 0.2μg、D 0.2μg的混合溶液分别于0h至18h测定，考察样品溶液的稳定性。结果见表18。
表18杂质定位溶液稳定性
Figure BDA0002474989170000192
Figure BDA0002474989170000201
由上表杂质定位溶液稳定性数据可见，18小时内，各杂质峰面积未见明显变化，18小时内4次进样峰面积结果RSD均小于1.0％。溶液稳定性良好。
③自身对照溶液稳定性
精密量取供试品滤液溶液1.0ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，量取1.0ml置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液，于0小时、于6小时、于12小时、于18小时进样考察，结果见表19。
表19自身对照溶液稳定性数据统计
内容 0H 6H 12H 18H 平均值 RSD(％)
保留时间(min) 30.329 30.317 30.402 30.349 30.349 0.124
峰面积 57.28 58.57 57.65 58.65 58.04 1.17
由上表自身对照溶液稳定性数据可见，18小时内，峰面积未见明显变化，18小时内4次进样峰面积结果RSD均小于1.0％。溶液稳定性良好。
1.10耐用性
为考察本发明检测方法对条件发生微小变化的耐受程度，取杂质混合对照品溶液和维生素B2片批样品溶液及其自身对照溶液，进行了耐用性试验，考察因素包括流动相不同初始比例、色谱柱型号、色谱柱柱温(30±5℃)。考察指标为***适用性、主峰的理论塔板数，样品中各杂质相对保留时间和有关物质含量。结果见表20。
表20耐用性数据统计
Figure BDA0002474989170000202
Figure BDA0002474989170000211
注：色谱柱1(拟定条件)：YMC-PACK ODS-AQ 4.6*250mm，5μm。
色谱柱2：Inertsustain C18 4.6*250mm，5μm。
由表可见，本品在本发明拟定的流动相比例、柱温及色谱柱型号时，对含量检测无明显变化，由此说明，本品含量测定方法耐用性良好。
对比例1
EP9.0维生素B2有关物质方法，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
波长：267nm
进样量：20μl
流动相：以0.1％磷酸溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，进行梯度洗脱，梯度洗脱包括以下步骤：(1)所述梯度在：0-5分钟内，流动相A和流动相B的体积保持90:10不变；(2)在5-20分钟内，流动相A和流动相B的体积比由90:10匀速渐变至80:20；(3)在20-25分钟内，流动相A和流动相B的体积比体积比保持80:20不变；(4)在25-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至50:50；(5)在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持50:50不变。
供试品溶液的配制：取本品约0.120g，精密称定，置100ml量瓶中，加0.1mol/L的氢氧化钠溶液10ml溶解，再用溶剂1(13.6g/L醋酸钠溶液)定容至刻度，作为供试品溶液。
供试品溶液的色谱图见图8。
对比例2
《中国药典》2015年版2部维生素B2有关物质检测方法，色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
波长：444nm
进样量：20μl
流动相：以0.01mol/L庚烷磺酸钠的0.5％冰醋酸溶液-乙腈-甲醇(85:10:5)。
供试品溶液的配制：取维生素B2片研细，取细粉适量(约相当于维生素B2 10mg)精密称定，置100ml量瓶中，加50％盐酸水溶液5ml，振摇使维生素B2溶解，加水10ml，继续振摇数分钟，再用水稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。
供试品溶液的色谱图见图9。
由图7～9可知，本发明的检测方法与EP9.0和中国药典的检测方法相比，《中国药典》的检测方法，检出杂质个数少，准确度不高；EP9.0的检测方法，主峰与杂质分离度差，并且供试品溶剂为稀碱容易对维生素B2破坏；而本发明的检测方法，主峰与杂质分离能力强，检出灵敏度高。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明保护范围之内。

Claims (11)

1.一种维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述检测方法采用高效液相色谱对维生素B2及有关物质进行定量检测，其高效液相色谱条件包括：色谱柱为YMC-PACK ODS-AQ或Inertsustain C18；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为0.01mol/L磷酸二氢钠溶液，所述流动相B为甲醇与乙腈的体积比为3:7的混合溶液；所述梯度洗脱过程中流动相A和流动相B的初始比例为93~97:7~3；所述梯度洗脱包括以下步骤：（1）在0-1分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5不变；（2）在1-16分钟内，流动相A和流动相B的体积比由95:5匀速渐变至85:15；（3）在16-35分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持85:15不变；（4）在35-45分钟内，流动相A和流动相B的体积比由85:15匀速渐变至70:30；（5）在45-55分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持70:30不变；（6）在55-60分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至30:70；（7）在60-65分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持30:70不变；（8）在65-66分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至95:5；（9）在66-70分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持95:5；
其中，定量检测的有关物质为：杂质A：7,8,10-三甲基-3,10-二氢苯并碟啶-2,4-二酮、杂质B：7,8-二甲基-1,3-二氢苯并碟啶-2,4-二酮、杂质C：6,7-二甲基-8-((2S,3S,4R)-2,3,4,5-四羟基戊基)蝶啶-2,4-二酮和杂质D：8-羟甲基-7-甲基-10-[(2S,3S,4R)-2,3,4,5四羟基戊基]-3,10二氢苯并碟啶-2,4，-二酮；
溶解杂质A或杂质B包括如下步骤：以冰乙酸溶解杂质A或杂质B后，再以水定容及稀释。
2.根据权利要求1所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的长度为250mm，直径为4.6mm，填料粒径为5μm。
3.根据权利要求1所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：检测器的检测波长为258nm~268nm。
4.根据权利要求3所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，检测器的检测波长为267nm。
5.根据权利要求1所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：柱温为25~35℃。
6.根据权利要求5所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述柱温为30℃。
7.根据权利要求1所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件包括：进样量为80~100μl。
8.根据权利要求7所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述进样量为100μl。
9.根据权利要求1所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，溶解杂质C或杂质D包括如下步骤：以混合流动相溶解杂质C或杂质D后，再定容及稀释。
10.根据权利要求9所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，所述混合流动相中流动相A和流动相B的体积比为9:1。
11.根据权利要求10所述的维生素B2有关物质的检测方法，其特征在于，杂质A的校正因子为0.7；杂质B的校正因子为1.0；杂质C的校正因子为2.4；杂质D的校正因子为1.1。
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