CN115340472A - 一种谷氨酸衍生物及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种谷氨酸衍生物及其合成方法和应用，其中谷氨酸衍生物分子结构如下所示：
Figure DDA0003851432490000011
本发明首先通过商业购买的N‑(9‑芴甲氧羰基)‑D‑谷氨酸1‑叔丁酯与alpha‑溴‑4‑甲氧基苯乙酮进行取代反应，然后脱除谷氨酸主链羧基保护基叔丁酯即可获得侧链上带有光敏基团的谷氨酸衍生物。本发明的谷氨酸衍生物能够兼容多肽固相合成，用于制备生产各种需要光控保护基团的多肽。

Description

一种谷氨酸衍生物及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及一种兼容固相合成的侧链上带有光敏对甲氧基苯甲酰基团的谷氨酸衍生物及其合成方法和应用，属于蛋白质合成技术领域。
背景技术
光笼肽和蛋白质，其生物学功能被可光裂解的保护基团抑制，可在光照射下恢复其活性。这些化合物被广泛用于探测和阐明复杂的生物过程，因为光照可以在空间、时间和幅度方面以非侵入性方式精确控制。目前已经报道了丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸(Glu)的侧链笼形式。在这些功能中，羧酸基团在蛋白质活性和蛋白质与其他生物大分子或小分子的相互作用中起重要作用。已经开发了羧酸部分笼罩的肽和蛋白质衍生物来研究生化机制和蛋白质-蛋白质/配体相互作用。
例如，文章(J.Am.Chem.Soc.1991,113,2758–2760.)报道了一种在活性位点Asp20中含有天冬氨酰b-硝基苄酯的可光活化噬菌体T4溶菌酶来触发酶促反应的方法。同样，文章(J.Am.Chem.Soc.2013,135,4580–4583.)报道了将一个光不稳定的封闭基团引入PDZ结构域配体的基本C末端羧酸盐的方法，以利用突触PDZ结构域介导的相互作用。
通常，笼状肽通过标准固相肽合成(SPPS)方法合成，这为设计笼状肽和蛋白质衍生物提供了最大的灵活性。文章(J.Biomed.Mater.Res.PartA 2013,101A,787–796)通过用2-硝基苄基(2-NB)修饰Asp的羧酸，生成了一种含有“RGD”的可光活化肽。然而，2-NB的光化学和光物理特性限制了其在生物过程中的进一步应用。文章(Peptides 2007,28,1074–1082.)报道的4,5-二甲氧基硝基苄基(DMNB)虽然具有改善的光化学性质，但由于Asp(ODMNB)和Glu(ODMNB)形成天冬酰胺和吡咯烷酮副反应，在Fmoc SPPS过程中未能将其引入侧链羧酸。文章(Tetrahedron Lett.,56(2015),pp.4582-4585)报道了一种通过4-甲氧基-7-硝基二氢吲哚(MNI)修饰衍生Asp和Glu来合成光笼肽的方法。MNI笼组具有优异的光化学性质和快速的光解动力学，但是合成步骤却较为繁琐。
因此，仍然需要新的与Fmoc兼容的方法来简单快捷地生成具有良好光化学性质的侧链羧基封闭肽/蛋白质。
发明内容
本发明针对上述现有技术所存在的不足，提供了一种兼容固相合成的侧链上带有光敏对甲氧基苯甲酰基团的谷氨酸衍生物及其合成方法和应用。
本发明首先通过商业购买的N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯与alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮进行取代反应，然后脱除谷氨酸主链羧基保护基叔丁酯即可获得侧链上带有光敏基团的谷氨酸衍生物。本发明的谷氨酸衍生物能够兼容多肽固相合成，用于制备生产各种需要光控保护基团的多肽。
本发明谷氨酸衍生物，简记为Fmoc-Glu(cage)-OH，其结构式如下所示：
Figure BDA0003851432470000021
本发明首先通过商业购买的N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯与alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮进行取代反应，然后脱除谷氨酸主链羧基保护基叔丁酯即可获得侧链上带有光敏基团的谷氨酸衍生物。合成路线如下所示：
Figure BDA0003851432470000022
本发明谷氨酸衍生物Fmoc-Glu(cage)-OH的合成方法，具体包括如下步骤：
步骤1：化合物I的合成
通过将商业购买的N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯与alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮溶于干燥的二氯甲烷(DCM)中，并加入碳酸钾固体颗粒，氩气保护下，40℃搅拌24小时，反应完成后，真空浓缩并通过柱色谱纯化分离得到化合物I——1-(叔丁基)5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸。
步骤1中，N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯、alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮与碳酸钾的摩尔比为1：1.2：1.5。
步骤2：目标产物的合成
先将化合物I溶于二氯甲烷(DCM)中，置于冰浴搅拌降温至0℃，再向反应体系中缓慢滴加三氟乙酸(TFA)溶液，反应1小时后撤掉冰浴恢复室温继续搅拌反应6h；反应结束后真空浓缩除去溶剂，得到纯的目标产物——(S)-2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-5-氧代戊酸。
步骤2中，所述化合物I与三氟乙酸(TFA)的摩尔比为1：60。
步骤2中，反应体系中二氯甲烷(DCM)与三氟乙酸(TFA)的体积比为1：1。
本发明谷氨酸衍生物的应用，是作为一种特殊保护氨基酸，通过普通的N-芴甲氧羰基(Fmoc)固相多肽合成方法将其连接到多肽上，从而获得各种需要光控保护基团的多肽。
反应过程示意如下：
Figure BDA0003851432470000031
本发明的有益效果体现在：
本发明公开了一种侧链上带有光敏对甲氧基苯甲酰基团的谷氨酸衍生物及其合成方法与应用，该光控保护谷氨酸能够兼容Fmoc固相合成用于化学合成需要光控保护的多肽，其合成方法具有合成效率高，合成步骤简便，产物纯度高，可大量制备的特点。
附图说明
图1是化合物I——1-(叔丁基)5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸氢谱-CDCl3的(CompoundⅠ)氢谱图。
图2是化合物(S)-2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-5-氧代戊酸(Fmoc-Glu(cage)-OH)的氢谱图。
图3是化合物(S)-2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-5-氧代戊酸(Fmoc-Glu(cage)-OH)的碳谱图。
图4是连接Glu(cage)分子前的线性多肽ARKGKIKPKA-NH2的高效液相色谱图。
图5是连接Glu(cage)分子前的线性多肽ARKGKIKPKA的质谱图。
图6是连接Glu(cage)分子后的线性多肽GLE(cage)ARKGKIKPKA的高效液相色谱图。
图7是连接Glu(cage)分子后的线性多肽GLE(cage)ARKGKIKPKA的质谱图。
图8是带光控分子的固体粗肽SKGLE(cage)ARKGKIKPKA的高效液相色谱图。
图9是带光控分子的固体粗肽SKGLE(cage)ARKGKIKPKA的质谱图。
图10是光脱笼肽SKGLEARKGKIKPKA的高效液相色谱图。
图11是光脱笼肽SKGLEARKGKIKPKA的质谱图。
图12是带光控分子的固体粗肽AE(cage)FGLKLDRIG的高效液相色谱图。
图13是带光控分子的固体粗肽AE(cage)FGLKLDRIG的质谱图。
图14是光脱笼肽AEFGLKLDRIG的高效液相色谱图。
图15是光脱笼肽AEFGLKLDRIG的质谱图。
图16是固体粗肽AE(cage)FGLKLDRIG脱掉光控分子前后的高效液相色图对比。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合具体实施范例对本发明实施过程作进一步说明，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征及优点，而不是对发明权利要求的限制。
实施例1：
1、将商业购买的N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯(852mg，1.74mmol)与alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮(474mg，2.08mmol)溶于10mL干燥的二氯甲烷(DCM)中，并同时加入碳酸钾固体颗粒(312mg，2.26mmol)，将反应置于氩气保护下，40℃搅拌24小时，反应完成后，将反应液真空浓缩并通过柱色谱纯化分离得到化合物I——1-(叔丁基)5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸(897.6mg，1.57mmol)，收率为90％。
2、将化合物Ⅰ(897.6mg，1.57mmol)溶于7mL二氯甲烷(DCM)中，置于冰浴搅拌降温至0℃，再向反应体系中缓慢滴加7mL三氟乙酸(TFA)溶液，反应1小时后撤掉冰浴恢复室温继续搅拌6h。反应结束后真空浓缩除去溶剂，得到纯的目标产物——(S)-2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-5-氧代戊酸(Fmoc-Glu(cage)-OH)(731mg，1.42mmol)，收率为90％。
实施例2：
称取263.15mg(0.1mmol)取代度为0.38mmol/g的氨基树脂，在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)/二氯甲烷溶液(DCM)10ml，使树脂溶胀，加入溶液的体积比为：DMF:DCM＝1:1，溶胀时间为10分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂。
向树脂中加入20％的哌啶反应10分钟以全部除去树脂上氨基的Fmoc保护基，再用DMF、DCM、DMF各洗涤三次除去反应后残余的哌啶和脱离的小分子保护基。
将首个氨基酸Fmoc-Ala-OH(124.53mg，0.4mmol，4eq.)和缩合剂6-氯苯并三氮唑-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸酯(HCTU，157.20mg，0.38mmol，3.8eq.)用4ml DMF溶解，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA，132μl，0.8mmol，8eq.)活化1分钟后添加到上述氨基树脂中，放入摇床中常温振荡30分钟；反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，再加入Fmoc-Ala-OH(124.53mg，0.4mmol，4eq.)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，144.49mg，0.38mmol，3.8eq.)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt，51.60mg，0.38mmol，3.8eq.)、DIEA(132μl，0.8mmol，8eq.)溶于DMF放入树脂中，反应30分钟；反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，向树脂中加入含有20％(体积分数)哌啶的DMF溶液，反应5分钟后依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，再次向树脂中加入20％的哌啶反应10分钟以全部除去树脂上氨基的Fmoc保护基，再用DMF、DCM、DMF各洗涤三次除去反应后残余的哌啶和脱离的小分子保护基，分别用DMF、DCM、DMF洗涤树脂。后面氨基酸的缩合类似进行至所有序列完成固相缩合，最终获得线性Fmoc-S(tBu)K(Boc)GLE(cage)AR(Pbf)K(Boc)GK(Boc)IK(Boc)PK(Boc)A-NH2树脂。用含有20％哌啶的DMF溶液两步脱除N末端的Fmoc保护基，再用DMF、DCM、DMF、DCM各洗涤三次后减压除去树脂中残余的DCM溶剂，得到干燥的树脂。
实施例3：
向实施例2获得的树脂中加入10ml预先配置好的切割试剂(三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2)，室温下反应2.5小时，将多肽链从树脂上裂解下来后收集滤液至离心管中，利用氮气鼓泡法进行切割液的浓缩。最后待切割液浓缩至5ml以内后，加入30ml冰***进行沉降，用低速离心机(4500转/分钟)离心，使粗肽沉降到底部。除去上清液后再次加入冰***，超声至形成粗肽悬浮液，切除的小分子杂质溶解于冰***中，最后通过离心除去。两次结束后将固体沉降物置于阴凉处风干，得到带光控分子的固体粗肽(SKGLE(cage)ARKGKIKPKA)150mg。
取少量粗肽用纯水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。分析梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证固体粗肽的正确性。验证正确后用C18半制备柱对固体粗肽进行分离纯化(半制备梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min)，收集正确产物峰溶液并放入冻干机中冻干，得到白色絮状SKGLE(cage)ARKGKIKPKA纯肽产物(112mg)。
实施例4：
在这里选取实施例3中的得到的SKGLE(cage)ARKGKIKPKA纯肽产物为目标短肽做进一步的光照脱笼实验。取1mgSKGLE(cage)ARKGKIKPKA纯肽产物溶于200uL缓冲液(6MGn-HCl，200mM NaH2 PO4，pH＝7.0)，将其放入紫外交联箱中，置于平整冰面上，使用365nm光照射5min。通过RP-HPLC监测反应。分析梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证产物的正确性。结果显示SKGLE(cage)ARKGKIKPKA纯肽(CagedForm)大部分转化为SKGLEARKGKIKPKA(NativeForm)，证明Fmoc-Glu(cage)-OH分子的侧链光敏保护基团在254nm光照条件下能够很好脱除，具有良好的光脱笼效率(见图10、图11)。
实施例5：
称取312.5mg(0.1mmol)取代度为0.32mmol/g的氯树脂，在树脂中加入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液10ml，使树脂溶胀，溶胀时间为20分钟，利用隔膜泵作为动力源，将溶胀后的产物抽干，得到溶胀好的树脂。
将首个氨基酸Fmoc-Gly-OH(118.92mg，0.4mmol，4eq.)用4ml DMF溶解，加入N,N-二异丙基乙胺(DIEA，132μl，0.8mmol，8eq.)活化1分钟后添加到上述氨基树脂中，放入摇床中常温振荡12h；反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，向树脂中加入含有20％(体积分数)哌啶的DMF溶液，反应5分钟后依次用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，再次向树脂中加入20％的哌啶反应10分钟以全部除去树脂上氨基的Fmoc保护基。反应结束后用DMF、DCM、DMF各洗涤三次，再加入Fmoc-Ile-OH(141.36mg，0.4mmol，4eq.)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，144.49mg，0.38mmol，3.8eq.)、N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt，51.60mg，0.38mmol，3.8eq.)、DIEA(132μl，0.8mmol，8eq.)溶于DMF放入树脂中，反应30分钟；后面氨基酸的缩合类似进行至所有序列完成固相缩合，最终获得线性Fmoc-AE(cage)FGLK(Boc)LD(OtBu)R(Pbf)IG-COOH树脂。用含有20％哌啶的DMF溶液两步脱除N末端的Fmoc保护基，再用DMF、DCM、DMF、DCM各洗涤三次后减压除去树脂中残余的DCM溶剂，得到干燥的树脂。
实施例6：
向实施例5获得的树脂中加入10ml预先配置好的切割试剂(三氟乙酸、苯酚、水和三异丙基硅烷的混合物，体积比为：三氟乙酸：水：苯酚：三异丙基硅烷＝88:5:5:2)，室温下反应2.5小时，将多肽链从树脂上裂解下来后收集滤液至离心管中，利用氮气鼓泡法进行切割液的浓缩。最后待切割液浓缩至5ml以内后，加入30ml冰***进行沉降，用低速离心机(4500转/分钟)离心，使粗肽沉降到底部。除去上清液后再次加入冰***，超声至形成粗肽悬浮液，切除的小分子杂质溶解于冰***中，最后通过离心除去。两次结束后将固体沉降物置于阴凉处风干，得到带光控分子的固体粗肽(AE(cage)FGLKLDRIG)118mg。
取少量粗肽用纯水溶液溶解，过膜后使用反向高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析。分析梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证固体粗肽的正确性。验证正确后用C18半制备柱对固体粗肽进行分离纯化(半制备梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min)，收集正确产物峰溶液并放入冻干机中冻干，得到白色絮状AE(cage)FGLKLDRIG纯肽产物(76mg)。
实施例7：
在这里选取实施例6中的得到的AE(cage)FGLKLDRIG纯肽产物为目标短肽做进一步的光照脱笼实验。取1mgAE(cage)FGLKLDRIG纯肽产物溶于200uL缓冲液(6M Gn-HCl，200mMNaH2 PO4，pH＝7.0)，将其放入紫外交联箱中，置于平整冰面上，使用365nm光照射5min。通过RP-HPLC监测反应。分析梯度为10％-70％的乙腈浓度，时间为30min。色谱分析后对主峰进行ESI-MS鉴定验证产物的正确性。结果显示AE(cage)FGLKLDRIG纯肽(CagedForm)大部分转化为AEFGLKLDRIG(NativeForm)，证明Fmoc-Glu(cage)-OH分子的侧链光敏保护基团在254nm光照条件下能够很好脱除，具有良好的光脱笼效率(见图14、图15、图16)。
综上所述，本发明公开了一种兼容固相合成的侧链上带有光敏对甲氧基苯甲酰基团的谷氨酸衍生物及其合成方法和应用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，也不因各实施例之间的前后次序对本发明造成任何限制，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭示的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种谷氨酸衍生物，简记为Fmoc-Glu(cage)-OH，其特征在于其结构式如下所示：
Figure FDA0003851432460000011
2.一种权利要求1所述的谷氨酸衍生物的合成方法，其特征在于：
首先通过N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯与alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮进行取代反应，然后脱除谷氨酸主链羧基保护基叔丁酯，即可获得侧链上带有光敏基团的谷氨酸衍生物；
合成路线如下所示：
Figure FDA0003851432460000012
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1：化合物I的合成
将N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯与alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮溶于干燥的二氯甲烷中，并加入碳酸钾固体颗粒，氩气保护下，40℃搅拌24小时，反应完成后，真空浓缩并通过柱色谱纯化分离得到化合物I——1-(叔丁基)5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙基)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)-L-谷氨酸；
步骤2：目标产物的合成
先将化合物I溶于二氯甲烷中，置于冰浴搅拌降温至0℃，再向反应体系中缓慢滴加三氟乙酸溶液，反应1小时后撤掉冰浴恢复室温继续搅拌反应6h；反应结束后真空浓缩除去溶剂，得到纯的目标产物——(S)-2-(((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)-5-(2-(4-甲氧基苯基)-2-氧代乙氧基)-5-氧代戊酸。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤1中，N-(9-芴甲氧羰基)-D-谷氨酸1-叔丁酯、alpha-溴-4-甲氧基苯乙酮与碳酸钾的摩尔比为1：1.2：1.5。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤2中，所述化合物I与三氟乙酸的摩尔比为1：60。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：
步骤2中，反应体系中二氯甲烷与三氟乙酸的体积比为1：1。
7.一种权利要求1所述的谷氨酸衍生物的应用，其特征在于：
通过N-芴甲氧羰基Fmoc固相多肽合成方法将所述谷氨酸衍生物连接到多肽上，从而获得各种需要光控保护基团的多肽。
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