CN114207145A - 基于III型CRISPR/Cas的诊断 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于成簇的规律间隔的短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)的核糖核酸检测***。本发明进一步涉及借助该***确定样本中存在或不存在靶核酸分子的方法,并且涉及包含根据本发明的核糖核酸检测***的装置。
Description
技术领域
本发明涉及CRISPR/Cas相关核酸检测***和其在诊断应用中的广泛用途。
背景技术
在过去的十年中,分子生物学领域有几项突破性的发现,这些发现的影响远远超出了其自身领域。毫无疑问,CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复,ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats,CRISPR/相关基因)能被认为是这些发现之一。CRISPR/Cas***被识别为原核适应性免疫***,提供针对外来遗传元件(例如噬菌体和质粒)的序列特异性防御。然而,CRISPR/Cas***允许在大多数(若不是全部)生物体中进行遗传干扰,这将对所有技术领域产生巨大影响。
CRISPR防御能被描述为由三个阶段组成的过程:适应、表达和干扰(Rath et al.,2015.Biochimie 117:119-128;Makarova et al.,2011.Nat Rev Microbiol 9:467-477)。在适应阶段,遗传片段从外来入侵实体中获取并存储在CRISPR储存器中(Jackson et al.,2017.Science 356:eaa15056)。这种储存器包含称为间隔区的外来DNA序列,其被重复的DNA序列(重复子)分开。CRISPR基因座的表达(阶段II)引起长的RNA分子的转录,其随后被加工成多个CRISPR RNA(crRNA)(Brouns et al.,2008.Science 321:960-964)。此外,细胞表达Cas蛋白,Cas蛋白是CRISPR/Cas***的效应物,通过结合crRNA形成核糖核蛋白(RNP)复合物。一旦外来遗传元件由于与crRNA的序列互补而被检测到,相关Cas蛋白将使用其核酸酶活性降解入侵实体,这通常被描述为CRISPR防御过程的干扰阶段。
由于过去十年致力于CRISPR/Cas的大量研究,大量***在细菌和古细菌界中被发现(Fenner et al.,2007.J Biomol Screen 20:1027-1039;van der Oost et al.,2009.Trends Biochem Sciences 34:401-407)。已经对CRISPR/Cas***进行了分类。I类***利用多亚基Cas复合物,而II类***仅使用单个Cas蛋白来介导其活性。通常基于特征基因的存在表征不同类型(Wright et al.,2016.Cell 164:29-44)。
与可以区分许多CRISPR/Cas***的差异相反,绝大多数***具有功能上的相似性。几乎所有的CRISPR/Cas类型都作为DNA靶向RNP,这可能与大量的基于DNA的入侵实体有关。相反,基于RNA性质的入侵元素在原核世界中并不常见。因此,III型CRISPR/Cas***已经进化为靶向RNA序列,这有些令人惊讶(Wright et al.,2016.Cell 164:29-44;Hale etal.,2009.Cell 139:945-956)。研究将这种异常活动归因于入侵噬菌体的转录产物的降解,从而阻止它们裂解细胞(Jiang et al.,2016.Cell 164:710-721;Goldberg et al.,2014.Nature 514:633-637)。III型***属于I类,意味着RNPs由多个亚基组成。
具有三种不同类型的核酸酶活性,III型***能被认为是独特的。此外,信使分子环状寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate,cOA)的产生并未归因于任何其他CRISPR/Cas***。利用这些特征可能会产生可视化靶点识别的新方法,这使得III型***适合应用于新型诊断工具。
发明内容
本发明提供基于成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)的核糖核酸的检测***,包含:a)效应物复合物,所述效应物复合物包含III型CRISPR相关效应物蛋白(CRISPR-associated effector protein,Cas)和与靶核酸分子结合的至少一种CRISPR RNA(crRNA)及b)用于直接或间接确定环状寡腺苷酸(cyclic oligoadenylate,cOA)水平的构件(means)。所述检测***中的III型Cas优选是IIIB型Cas,优选IIIB型Cmr。所述III型Cas优选来自诸如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的嗜热(thermophylic)生物。
III型Cas优选缺少切割活性(例如通过Cmr4亚基的D26N突变或另一亚基的等效突变)。进一步优选的切割死亡(cleavage-dead)突变包括Cmr4 D26A、Cmr4的E227A和E228双突变,和Cmr4 D86A(Ramia et al.,2014.Cell Reports 9:1610-1617;Zhu and Ye,2015.Nucleic Acids Res 43:1257-1267)。此外,Csm3 D32A是切割死亡IIIA型Csm突变的良好候选者(Samai et al.,2015.Cell 161:1164-1174)。
在根据本发明的优选的检测***中,所述用于直接或间接确定cOA水平的构件包含用于确定焦磷酸盐/酯(PPi)水平的构件。根据本发明的优选的检测***可进一步包含无机焦磷酸酶。所述无机焦磷酸酶优选来自诸如嗜热栖热菌的嗜热生物,使其与优选的III型CRISPR/Cas***兼容,并允许等温检测。
根据本发明的优选的检测***进一步包含诸如Csxl的cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶。
根据本发明的优选的检测***进一步包含cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶(诸如Csx1)和针对所述内切核糖核酸酶的可检测底物。
本发明进一步提供一种用于确定样本中存在或不存在靶核酸分子的方法,所述方法包含:为所述样本提供根据本发明的核糖核酸检测***;在允许crRNA与其靶核酸分子结合的条件下孵育所述样本;以及直接或间接地确定环状寡腺苷酸(cOA)水平,由此与对照相比,所确定的cOA水平的增加表示在所述样本中存在所述靶分子。
通过确定焦磷酸盐/酯的水平或在所述检测***中存在无机焦磷酸酶的情况下确定的无机磷酸盐的水平来确定cOA水平。通过基于比色的(colorimetric)、荧光测定的(fluorometric)、荧光的(fluorescent)或生物发光的(bioluminescent)试验确定焦磷酸盐/酯或无机磷酸盐的水平。
通过检测用于所述效应物核糖核酸内切酶的可检测底物来确定诸如Csx1的cOA依赖的非特异的效应物核糖核酸内切酶的水平,可间接地确定cOA水平。
根据本发明的优选的方法包含在37℃至85℃之间的温度下孵育所述样本与所述核糖核酸检测***,优选在约65℃。
本发明进一步提供一种包含根据本发明的核糖核酸检测***的装置。所述装置优选地包含多个排列的根据本发明的核糖核酸检测***。所述多个排列的核糖核酸检测***优选有不同靶核酸分子。
本发明进一步提供一种部件试剂盒,所述部件试剂盒包含a)效应物复合物,所述效应物复合物包含III型CRISPR相关效应物蛋白(CRISPR-associated effector protein,Cas)和与靶核酸分子结合的至少一个CRISPRRNA(crRNA),及b)用于直接或间接确定环状寡腺苷酸(cOA)水平的构件。
附图说明
图1:使用IDT Codon Optimization Tool(可在eu.idtdna.com/codonopt上获得)优化的Cmr Cas蛋白的密码子。
图2:Cmr和Csm序列的比对。
图3:用内源性和重构的TtCmr复合物进行体外RNase活性试验。(A)使用与和内源性TtCmr复合物一起孵育的crRNA互补的5′-磷-32标记的靶RNA的活性试验的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析。单链RNA标志物(“M”)被用作如左边所示的尺寸标准。(B)类似于A的活性试验,但是使用重构的复合物。
图4:(A)TtCmr的RNase活性不受crRNA的第一向导核苷酸错配的靶标影响。(B)cOA的产生受到在1、2和5核苷酸位置错配的显著影响。
图5:使用与在指定的核苷酸位置存在错配的靶RNA(表4)一起孵育的A)TtCmr40和B)TtCmr46进行的cOA生产试验。
图6:在crRNA 3′端的柔性种子区域(flexible seed region)。使用与在指定的片段中存在错配的靶RNA(表4)一起孵育的(A)内源性TtCmr(“TtCmr”)或有(B)46核苷酸(nt)crRNA的重构的TtCmr复合物(“TtCmr-46”)或有(C)40nt crRNA的重建的TtCmr复合物(“TtCmr-40”)进行的靶RNA降解和cOA生产试验。
图7:靶RNA与TtCmr结合的crRNA的碱基配对始于crRNA的3′末端。(A)内源性TtCmr复合物的电泳迁移率变化试验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)分析,内源性TtCmr复合物与不同的靶RNA(表4)一起孵育,每个靶RNA包含一段与TtCmr结合的crRNA错配的5nt。(B)内源性TtCmr复合物的EMSA分析,内源性TtCmr复合物与11nt的短的靶RNA(表4)一起孵育,这些靶RNA与TtCmr结合的crRNA所示的核苷酸互补。
图8:A)通过如所示的Cmr确定加入的靶RNA浓度范围的Pi检测的比色输出的吸光度。反应时间设定为1小时,显色时间设定为30分钟(使用Malachite Green试验直接检测cOA)。B)通过确定Pi水平随时间变化的倍数增加来检测靶RNA的比色输出的吸光度(使用Malachite Green试验直接检测cOA)。C)使用ssRNA和ssDNA猝灭剂荧光团序列检测cOA介导的Csx1的RNase活性(间接的cOA检测)。
图9:用于天然的靶RNA 4.5的嗜热栖热菌IIIB型Cmr***的灵敏度范围。使用间接cOA可视化方法监测靶标识别。类似长度的随机RNA用作阴性脱靶对照。
图10:用于天然的靶RNA4.5的含Cmr4 D26N突变的嗜热栖热菌IIIB型Cmr***的灵敏度范围。使用间接cOA可视化方法监测靶标识别。类似长度的随机RNA用作阴性脱靶对照。
图11:检测野生型Cmr复合物和dCmr复合物的诺如病毒(norovirus)靶RNA限度的比较。使用间接cOA可视化方法监测靶标识别。展示了该试验的原始信号输出。类似长度的随机RNA用作阴性脱靶对照。
图12:加入互补的靶RNA后,通过IIIA型CRISPR/Cas复合物产生的cOA。
图13:来自一锅(one-pot)SARS-CoV-19N基因检测试验的结果。该图显示了来自65℃下的“信号生产孵育”的数据。
图14:来自水貂样本的一锅SARS-CoV-19N基因检测试验的结果。该图显示了来自65℃下的“信号生产孵育”的数据。
具体实施方式
4.1、定义
如本文所使用的,术语“成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)”是指原核微生物基因组中的一个或更多个特定的DNA区域。这些区域的特征是存在核苷酸重复,这些重复被间隔区序列穿插,通常为~25-~38bp的直接DNA重复,其被相似长度的独特的间隔区序列分开(Grissa et al.,2007),这些间隔区序列源自之前与入侵元件的相遇。它们作为记忆,在下次感染时快速攻击这些入侵者。该基因组区域包括位于CRISPR基因座附近的一个或更多个CRISPR相关效应物蛋白(Cas)编码基因。
如本文所使用的,术语“CRISPR crRNA”是指CRISPR衍生的RNA分子,其包含间隔区序列及5和3重复衍生的末端。所述CRISPR crRNA的长度优选为至少30个核苷酸,更优选为至少34个核苷酸,更优选为至少40个核苷酸,更优选为至少46个核苷酸。所述CRISPR crRNA优选少于1000个核苷酸,优选少于200个核苷酸,优选少于100个核苷酸。所述RNA分子可包括核糖核酸核苷酸类似物(例如肌苷、尿苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、2,6-二氨基嘌呤及基于6,8-二氨基嘌呤的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)。
如本文所使用的,术语“CRISPR相关效应物蛋白(Cas)”是指与CRISPR crRNA相关联的蛋白。CRISPR/Cas***目前分为两类。I类***使用多亚基Cas复合物,而II类***仅使用单个Cas蛋白来介导其活性。I类的III型CRISPR-Cas***已经进化到尤其靶向RNA序列。这些***中独特的蛋白是I类***中的Cas3、II类***中的Cas9和I类的III型***中的Cas10。
如本文所使用的,术语“效应物复合物”是指具有核酸酶活性并可切割和灭活入侵核酸序列的CRISPR-Cas核糖核蛋白复合物,该入侵核酸序列包含与CRISPR crRNA中的间隔区序列互补的序列。
如本文所使用的,术语“环状寡腺苷酸(cOA)”是指含3-6个单磷酸腺苷(AdenosineMono Phosphate,AMP)分子的环状结构。cOA的形成是通过Cas10的环化酶结构域催化的,其是III型效应物***的一部分。
如本文所使用的,术语“III型Cas”是指包含至少Cas10蛋白的RNA靶向、多亚基CRISPR相关复合物。
如本文所使用的,术语“IIIA型Cas”是指与靶RNA分子结合时具有非特异的DNase活性的RNA靶向的3型CRISPR/Cas复合物。IIIA型Cas包括诸如来自嗜热葡萄球菌(Staphylococcus thermophilus)、嗜热栖热菌和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermis)的IIIA型Csm复合物。
如本文所使用的,术语“IIIB型Cas”是指缺少非特异的DNase活性的RNA靶向的3型CRISPR-Cas复合物。所述IIIB型Cas复合物由6-7个蛋白组成。IIIB型Cas包括诸如来自Pyrococcus furiosus、嗜热栖热菌和硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的IIIB型Cmr复合物。
如本文所使用的,术语“PPi”或磷酸膦(phosphonato phosphate)是指焦磷酸的盐或酯。可替代的名称是焦磷酸盐/酯、二磷酸盐/酯和二聚磷酸盐/酯。
如本文所使用的,术语“无机焦磷酸酶”或无机二磷酸酶是指催化焦磷酸盐/酯的一个离子转化为两个磷酸盐离子的酶。该酶属于EC3.6.1.1类酶。
如本文所使用的,术语“cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶”是指使用HEPN(高等真核生物和原核生物,核苷酸结合(Higher Eukaryotes and Prokaryotes,Nucleotide binding)活性位点非特异性地降解RNA的核糖核酸酶。这些核酸酶通过使用它们的CRISPR相关Rossmann fold(CARF)结构域与信使cOA结合而被激活。这种非特异的效应物核糖核酸内切酶的示例是Cas辅助蛋白Csx1和Csm6。
如本文所使用的,术语“生物传感器(biosensor)”或“生物学传感器(biologicalsensor)”是指含根据本发明的基于CRISPR的核糖核酸***的传感装置。在基于CRISPR的核糖核酸***与和crRNA互补的RNA分子相互作用时产生的信号(例如比色的(colorimetric)、荧光测定的(fluorometric)、荧光的(fluorescent)或生物发光的(bioluminescent)信号)可耦合到换能器(transducer),从而允许对信号进行量化。该信号优选地通过合适的换能器被转换成可测量的电参数(例如电流或电压)。
4.2、基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***
一方面,本发明提供一种基于成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)的核糖核酸(RNA)检测***。所述***包含效应物复合物及用于直接或间接确定环状寡腺苷酸(cOA)水平的方法和构件,所述效应物复合物包含III型CRISPR相关效应物蛋白和与靶核酸分子结合的至少一种CRISPRRNA(crRNA)。
所述基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***优选源自嗜热生物(例如Pyrococcusfuriosus、硫化叶菌或嗜热栖热菌)。来自嗜热生物的基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***的优点是能在高温下进行检测(例如40℃至80℃之间,优选50℃至70℃之间,如55℃至65℃之间,优选约65℃)。与在较低温度下孵育相比,在这样的温度下孵育可加速cOA合成反应。此外,所述高温可灭活样本中存在的核酸酶(例如DNase、RNase)或蛋白酶。
此外,来自嗜热生物的基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***的优点可以为该***提供提高的稳定性(例如在与来自中温生物的基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***相比时,该***可以存储更长的时间)。
所述核糖核酸检测***是基于构成获得性免疫***以保护原核细胞免受入侵病毒和质粒的原核CRISPR/Cas***,其类似于真核RNA干扰(RNA interference,RNAi)***(Makarova et aI.,2006.Biol Direct 1:1-7)。CRISPR-Cas免疫应答由三个不同的阶段组成:1)适应,通过该阶段切除入侵者的靶DNA的一部分并***到CRISPR阵列中;2)CRISPR(cr)RNA的表达和成熟及CRISPR/Cas复合物的结合;以及3)在crRNA被用作向导以识别与病毒或质粒的入侵基因组中成熟的CRISPR序列互补的序列时的干扰,随后通过Cas核酸酶切割和灭活外源核酸。
III型CRISPR/Cas复合物的通用结构包含Cas7和Cas11的多个亚基(Staals etal.,2013.mol.Cell 52:135-145;Staals et al.,2014.mol.Cell 56:518-530),它们在一侧被Cas5和Cas10覆盖(capped off)。其中,Cas7在通过预先装载的RNA向导识别靶RNA时提供RNase活性。
已经显示了靶标识别通过Cas10的Palm结构域促进环状寡腺苷酸(cOA)的产生(Kazlauskiene et al.,2017.Science 357:605-609;Niewoehner et al.,2017.Nature548:543-548)。虽然在真核生物中cOA物质是已知的信号分子,但在原核宿主中这种活性尚未被报道。然而,研究表示cOA的存在使得Csm6或Csx1家族成员的RNase活性大幅增加。这些蛋白通常编码在III型基因座上,但不直接与核糖核蛋白复合体相关联。相反,对入侵者RNA转录产物的识别可产生通过Cas7的靶向RNA降解、通过I类的IIIA型的Cas10的非特异的DNA降解和使得Csm6或Csx1活化的cOA的产生,由此引起附近其他单链RNA分子的附属切割(collateral cleavage)。
用于直接确定cOA水平的方法优选地包括确定确定焦磷酸盐/酯或PPi水平的方法。焦磷酸盐/酯的形成与通过CRISPR/Cas相关蛋白(例如Cas10)由ATP形成cOA相关。由3-6个AMP单元组成的cOA的形成使得同时形成3-6个PPi分子。
作为替代,根据本发明的检测***可包含无机焦磷酸酶,使得PPi分解并且每个PPi分子形成两个无机磷酸盐/酯分子。因此,通过确定无机磷酸盐/酯的水平,可检测分子的数量从1分子cOA扩增到6-12Pi分子。
优选的无机焦磷酸酶是在与基于III型CRISPR/Cas的RNA检测***相同或相似的温度下有活性的酶。此外,优选地无机焦磷酸酶在与基于III型CRISPR/Cas的RNA检测***相同或类似的条件下有活性,该条件包括在相同或类似的pH和相同或类似的盐浓度下。例如,在基于III型CRISPR/Cas的RNA检测***在50℃下具有最佳活性的情况下,优选地无机焦磷酸酶在该温度下是有活性的。优选地,无机焦磷酸酶在50℃下的活性使得基本上所有的PPi分子都被分解成无机磷酸盐/酯分子。所述分解优选地是瞬时的。同样,在所选择的pH和盐浓度下,无机焦磷酸酶的活性使得基本上所有的PPi分子都被分解成无机无机磷酸盐/酯分子。所述分解优选地是瞬时的。
优选的无机焦磷酸酶来自嗜热生物(例如Pyrococcus furiosus、硫化叶菌和嗜热栖热菌),其允许同时的等温检测。这样一来,能通过确定Pi的水平来直接确定cOA的水平。
能使用本领域已知的方法检测PPi和Pi,包括基于比色的、荧光测定的、荧光的或生物发光的试验。
用于确定PPi水平的合适的方法包括荧光测定的和/或比色的焦磷酸盐/酯(PPi)试验试剂盒(Biovision Inc.,Milpitas,CA);荧光的焦磷酸盐/酯检测试剂盒(Thermfisher Sciential;Waltham,MA);荧光测定的焦磷酸盐/酯试验试剂盒(SigmaAldrich,Saint Louis,MO);和发光的PPiLightTM试验(Lonza Group a.G.,Bazel,Switcher)。
用于确定无机磷酸盐/酯或Pi水平的合适的方法包括比色的PiColorLockTM试验(Epedeon,Cambridge,UK);比色的Malachite Green磷酸盐/酯试验试剂盒(SigmaAldrich,Saint Louis,MO);荧光的磷酸盐/酯传感器(Thermfisher Sciential;Waltham,MA);发光的ADP转换成ATP后的读取器(美国专利申请US20140273036A);荧光的化学传感器(Meng etal.,2015.RSC Advances 5:53189-53197);和与铕离子结合的光致发光的石墨烯量子点(Bai et al.,2013.Chemistry 19:3822-3826)。
这些用于直接确定环状寡腺苷酸(cOA)水平的方法和构件优选包括至少一种底物,如果需要,还包括允许用于PPi或Pi的至少一种所示的检测方法的酶。
优选的方法是比色法(例如Malachite Green磷酸盐/酯试验试剂盒),其作为CoA水平的直接确定,允许快速确定PPi或Pi水平。
间接确定cOA水平的方法优选包括确定cOA依赖的非特异的效应物核酸酶(例如CRISPR辅助核酸酶1(Can1)或Can2)的活性的方法和优选地,确定cOA依赖的非特异的效应物核糖核酸内切酶(诸如Csx1)的活性的方法。为此,根据任何本发明所述的检测***优选地包括cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶(诸如Csx1)。
所述cOA依赖的非特异的效应物核酸酶,优选地内切核糖核酸酶,优选地是在与基于III型CRISPR/Cas的RNA检测***相同或相似的温度下有活性的酶。此外,优选地,在与基于III型CRISPR/Cas的RNA检测***相同或相似的条件下,包括在相同或相似的pH和相同或相似的盐浓度下,cOA依赖的非特异的效应物核糖核酸内切酶是有活性的。例如,在基于III型CRISPR/Cas的RNA检测***在65℃下具有最佳活性的情况下,优选地cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶在该温度下是有活性的。优选地,在65℃下的cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的活性使得cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的cOA诱导的活性引起所述cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的底物的反应产物产生可检测量。类似地,在所选择的pH和盐浓度下,cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的活性使得cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的cOA诱导的活性引起所述cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的底物的反应产物产生可检测量。
所述针对cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的底物优选是RNA分子,能检测到其被切割。可以通过本领域中已知的任何方法来执行检测。例如,可以通过质谱法(例如在正电喷雾电离模式下与串联质谱法(LC-MS/MS)耦合的超高效液相色谱法(UHPLC))直接执行检测。LC-MS/MS分析可以通过诸如使用耦合到三重四级杆质谱的高端UHPLC色谱***执行。
可进一步通过液-液相分离执行检测(LLPS;Spoelstra et al.,2018.BioRXiv,CSHL (doi.org/10.1101/471482))。
用于cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的优选的底物是在一端标记有荧光报告分子而另一端标记有猝灭剂的RNA分子。报告分子与猝灭剂紧密接近以阻止对其荧光的检测。通过cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的活性切割底物,破坏了报告分子-猝灭剂的近距离,因此允许未淬灭的荧光的发射,这种荧光能在激光激发后被检测到。因此,由于底物的切割和猝灭荧光报告分子的猝灭剂的移除,cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的活性的增加使得荧光成比例增加。
独立于非特异的效应物核糖核酸内切酶的激活,或除此之外,还可以通过确定存在于IIIA型CRISPR/Cas效应物复合物中的使用针对所述核酸酶的合适的底物的非特异的效应物DNase活性的激活来确定靶点识别的水平。所述合适的底物优选为一端标记有荧光报告分子而另一端标记有猝灭剂的DNA分子。报告分子与猝灭剂紧密接近以阻止对其荧光的检测。通过cOA依赖的非特异的效应物DNase的活性切割底物,破坏了报告分子-猝灭剂的近距离,因此允许未淬灭的荧光的发射,这种荧光能在激光激发后被检测到。因此,由于底物的切割和猝灭荧光报告分子的猝灭剂的移除,cOA依赖的非特异的效应物DNase的活性的增加使得荧光成比例增加。使用非特异的效应物内核糖核酸酶的激活和非特异的效应物DNase的激活都允许在单次的试验中确定存在或不存在两个独立的靶RNA分子,前提是使用两个独立的核糖核蛋白复合物,其中一个特异性激活非特异的效应物DNase,而另一个特异性允许间接或直接确定cOA水平。本领域技术人员将理解,为此,通过激活cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶和非特异的效应物DNase而存在于底物上的荧光标签必须足够差异化,以允许确定每种活性的水平,作为用于确定cOA水平的测量方法。
优选的荧光标签可选自Atto425(ATTO-TEC GmbH,Siegen,Germany)、Atto 647N(ATTO-TEC GmbH,Siegen,Germany)、YakimaYellow(Epoch Biosciences Inc,Bothell,WA,USA)、Cal610(BioSearch Technologies,Petaluma,CA,USA)、Cal635(BioSearchTechnologies,Petaluma,CA,USA)、FAM(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MAUSA)、TET(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、HEX(Thermo FisherScientific Inc.,Waltham,MA USA)、花菁染料(cyanine dyes)(例如Cy5、Cy5.5、Cy3、Cy3.5、Cy7(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA))、Alexa染料(ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、Tamra(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、ROX(Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、JOE(ThermoFisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)、异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate)(FITC,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA),Yakima(YY;Epoch Biosciences,Bothell,Washington)和四甲基罗丹明(tetramethylrhodamine)(TRITC,Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,MA USA)。所述底物优选在5′端用可检测标签,优选荧光标签标记。
猝灭剂(例如四甲基罗丹明TAMRA,二氢环吡咯吲哚三肽小沟粘合剂)是本领域已知的。优选的猝灭剂包括Black Hole (BHQ1)和BHQ2(BiosearchTechnologies,Petaluma,CA,USA)。BHQ1暗猝灭剂在480nm至580nm范围内具有强吸收,其猝灭在这个范围内发荧光的荧光团(例如FAM、TET、CAL Gold 540、JOE、HEX、CALFluor Orange 560和570染料)。BHQ2暗猝灭剂在599nm至670nm范围内具有强吸收,其猝灭在这个范围内发荧光的荧光团(例如570、TAMRA、CAL Red 590、CALFluor Red 610、ROX、CAL Fluor Red 635、650、Quasar 670和Quasar 705染料)。BHQ1和BHQ2可通过FRET和静态猝灭机制猝灭荧光。
优选的cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶来自嗜热生物(例如Pyrococcus furiosus、硫化叶菌和嗜热栖热菌)允许cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的活性的同时的等温检测。
用于间接确定环状寡腺苷酸(cOA)水平的方法和构件优选包括cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶和所述cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶的底物。
4.3、蛋白的产生
根据本发明的核糖核酸检测***是基于核糖核蛋白复合物(优选IIIB型复合物)的体外组装。所需的Cas蛋白优选来自诸如嗜热栖热菌的嗜热生物。所述蛋白优选从合适的表达***中表达和纯化。
用于产生异源蛋白的常用表达***包括大肠杆菌、芽孢杆菌、杆状病毒、酵母、真菌,最优选丝状真菌或酵母(例如酿酒酵母和毕赤酵母)、真核细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、人胚胎肾(HEK)细胞和细胞(Thermo Fisher Scientificial,MA,USA)和植物。重组蛋白在异源***中的表达效率取决于许多因素,包括转录水平和翻译水平。
优选使用原核细胞(优选大肠杆菌(E.coli))产生Cas蛋白。所述Cas蛋白优选通过将所述蛋白表达克隆到感兴趣的原核细胞(优选大肠杆菌)而产生。所述表达构建体,优选DNA,优选通过重组技术产生,包括使用技术人员熟知的聚合酶、限制性内切酶和连接酶。可替代地,所述表达构建体通过人工基因合成(例如通过如技术人员已知的合成部分或完全重叠的寡核苷酸,或者通过有机化学和重组技术的结合)提供。
作为替代或此外,可通过在嗜热生物中表达经标记的Cas蛋白,并基于该标记分离包含所述Cas蛋白的核糖核蛋白复合物,从所述嗜热生物中分离Cas蛋白。所述分离的核糖核蛋白复合物能使用经标记的Cas蛋白进行分离。
所述表达构建体优选经密码子优化以增强Cas蛋白在感兴趣的原核细胞(优选大肠杆菌)中的表达。进一步的优化优选包括去除隐匿的剪接位点、去除隐匿的polyA尾部和/或去除导致mRNA不利折叠的序列。此外,表达构建体优选编码用于将Cas蛋白分泌出细胞进入原核生物周质的蛋白输出信号,从而允许高效纯化Cas蛋白。
用于纯化Cas蛋白的方法是本领域已知的,并且通常基于色谱法(例如亲和色谱法和离子交换色谱法)以去除污染物。除污染物外,还可能需要去除产品本身的不良衍生物(例如降解产物和聚集物)。在Berthold和Walter,1994(Berthold and Walter,1994.Biologicals22:135-150)中提供了合适的纯化工艺步骤。
作为替代或此外,可通过基因工程用一个或更多个特异的标签标记重组Cas蛋白,以允许蛋白附着到对标签特异的柱上,并因此将其从杂质中分离出来。然后用去耦试剂从亲和柱中交换经纯化的蛋白。该方法已越来越多地应用于重组蛋白的纯化。用于蛋白的常规标签(例如组氨酸标签),与特异地捕获标签的亲和柱(例如用于组氨酸标签的Ni-IDA柱)一起使用,以从其他杂质中分离蛋白。然后根据特定的标签用去耦试剂从亲和柱中交换该蛋白。与传统的纯化方法相比,该方法更特异。
如Chatterjee,2006(Chatterjee,2006.Cur Opin Biotech 17,353-358)所展示的,合适的更多标签包括c-myc结构域(EQKLISEEDL)、血凝素标签(YPYDVPDYA)、麦芽糖结合蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG标签肽、生物素受体肽、链亲和素结合肽和钙调素结合肽。使用这些标签的方法是本领域已知的,并可用于纯化Cas蛋白。
用于在大肠杆菌中表达蛋白的方法是本领域已知的,并能用于Cas蛋白的表达和纯化。
在优选的方法中,在大肠杆菌中Cas蛋白表达自由密码子经优化的表达构建体。将所述构建体置于双顺反子表达质粒中,该质粒在N端含有Strep标签和氨基酸序列Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser),该氨基酸序列通过烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶被识别。将表达质粒转化到大肠杆菌(例如菌株B121(DE3))中。在37℃下的所需的培养体积中生长,直到OD600为~0.6,将培养物在冰上放置1小时,然后加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷至最终浓度为0.1mM。然后,将培养物在18℃下孵育~16小时(过夜)。收获细胞,在缓冲液A(100mM Tris-HCl、150mM NaCl)中通过超声处理裂解,然后在30000g下离心45分钟。澄清的裂解液经过滤并且在经预平衡的StrepTrap FPLC柱(GE Healthcare,Chicago,IL)上运行。用缓冲液A洗涤柱直到没有更多的蛋白存在于流经液(flow through)中后,用缓冲液B(100mM Tris-HCl、150mM NaCl和2.5mM D-脱硫生物素)洗脱感兴趣的蛋白。通过加入TEV蛋白酶并在4℃下孵育过夜以将蛋白从亲和标签上切割下来。通过HisTrap和StrepTrap亲和色谱法步骤从混合物中分离感兴趣的蛋白,收集该步骤中的流经液。如果需要,增加额外的体积排阻色谱,以达到更高的纯度。
优选的Cas蛋白包含Csm或Cmr蛋白,至少Cmr1和Cmr4,优选Cmr1-6,或至少Csm2和Cas10(Csm1),优选Csm2-5和Cas10,更优选Csm1-6。
优选的蛋白包括与表2所示的氨基酸序列具有至少80%序列一致性的蛋白,优选至少90%序列一致性,优选氨基酸序列如表2所示的蛋白。然而,所述蛋白质的突变体,包括***突变体、缺失突变体、嵌合蛋白和氨基酸取代蛋白,还可用于根据本发明的基于CRISPR的核糖核酸***中。
为了提高III型CRISPR/Cas检测方法的灵敏度,优选创造催化死亡(catalytically dead)的突变体Cmr和/或Csm复合物并将其用于本发明的检测***中。术语“催化死亡”是指根据本发明的基于CRISPR的核糖核酸***的靶RNA消化活性。这些突变体被称为dCmr和dCsm。这些突变被引入负责靶标结合和切割Cmr4和Csm3亚基并被选择用于保持靶标结合的同时废除靶点切割。已经描述了Cmr4蛋白中的许多突变(H15A、D26A、E277A),在Cmr4 D26A和D26N突变中观察到最强的催化损伤(Benda et al.,2014.Molecular Cell 56:43-54;Ramia et al.,2014.Cell Reports 9:1610-1617)。实验证明这种灭活突变在Pyrococcus furiosis中有用,并且对Cmr4同源序列的比对显示该氨基酸是高度保守的(数据未显示)。此外,晶体学数据显示这种特定的氨基酸位于复合物的凹槽中,靶RNA被期待在那里结合(数据未显示)。总而言之,这些结果表示D26氨基酸残基对Cmr4的催化活性很重要。改变该残基将产生嗜热栖热菌dCmr4突变体。除此之外,Pf Cmr4氨基酸序列与Csm3的同源序列的比对也显示D26是少数在两个III型***之间保守的氨基酸之一,因此还可用于创造dCsm3突变体。更多的切割死亡突变包括Cmr4的E227A和E228双突变体及Cmr4 D86A(Ramia et al.,2014.Cell Reports 9:1610-1617;Zhu and Ye,2015.Nucleic Acids Res 43:1257-1267)。此外,Csm3 D32A是切割死亡的IIIA型Csm突变体的良好候选者(Samai et al.,2015.Cell 161:1164-1174)。
此外,Jia et al.和Park et al.描述了通过D36A取代创造的dCsm3突变体(Jiaet al.,2019.Mol Cell 73:264-277;Park et al.,2017.EMBO reports 18:826-840)。还提及一个K56A和R60A的双突变体,但没有完全消除Csm3的靶标切割。
另一种变异类型是基于通过自然的CRISPR/Cas防御***的损害控制。在Csx1/Csm6的CRISPR相关Rossmann fold(CARF)结构域与cOA结合后,其高等真核生物和原核生物核苷酸结合(Higher Eukaryotes and Prokaryotes Nucleotide-binding,HEPN)结构域被激活并且蛋白将任意地开始切割RNA(Kazlauskiene et al.,2017.Science 357:605-609)。在正常生物环境中,cOA被Csx1/Cms6本身降解以避免持续激活,并且因此保持RNase活性(Athukoralage et al.,2019.J Mol Biol 431:2894-2899,Garcia-Doval et al.,2020.Nature Communications 11:1-9)。最近,通过使用Csx1/Cms6蛋白的突变体阐明了这种cOA降解的机制。研究表明,T10A、T10A/T11A或T11A Csx1/Csm6突变体不能降解cOA,并且使得RNase活性延长(Athukoralage et al.,2019.J Mol Biol 431:2894-2899;Garcia-Doval et al.,2020.Nature Communications 11:1-9)。这种通过Csxl/Cms6(例如通过使用T10A、T10A/T11A或T11A Csx1/Csm6突变体或它们的等价物)延长的RNase活性,能被用于诊断目的的更灵敏和更快速的读取。
4.4、核糖核蛋白复合物的组装
尽管在不同的III型亚型(Cmr,Csm)之间存在差异,但通用结构由Cas7和Cas11的多个亚基组成(Staals et al.,2013.mol.Cell 52:135-145;Staals et al.,2014.mol.Cell 56:518-530),它们的一侧被Cas5和Cas10覆盖。其中,Cas7在通过预先装载的RNA向导识别靶RNA时提供RNase活性。此外,这种识别还通过Cas10 HD结构域产生DNase活性(Kazlauskiene et al.,2016.Mol Cell 62:295-306)。
III型CRISPR/Cas***能进一步分成各种亚型,包括IIIA型Csm和IIIB型Cmr(Staals et al.,2013,2014.同上)。嗜热栖热菌(ttCmr46)的效应物复合物Cmr由化学计量为Cmr112131445361的12个亚基(Staals et al.,2014.同上;Taylor et al.,2015.Science348:581-586)和46nt crRNA组成。Staals et al.的新奇研究表明了有40nt crRNA的类似的复合物(表1)。
表1 TtCmr40和46的亚基组成
IIIA型Csm复合物的组成方式与Cmr(Csm1123354151)类似(Tamulaitis et al.,2017.Trends Microbiol 25:49-61)。这种复合物能通过以正确的摩尔比加入所有亚基并让反应混合物在孵育温度(例如60℃或65℃)下孵育一段时间(例如30分钟)来组装。
将纯化的Cas蛋白(例如Csm或Cmr蛋白)组装到合适的crRNA上。在一个实施方案中,所述crRNA和组装的核糖核蛋白复合物存在于水性溶液中。随后如果需要确定cOA水平,可以标记(例如用组氨酸标签和/或链球菌标签)Cas蛋白之一(例如CAP Cas(例如Cmr6)),并连接到表面上,优选在表面上的限定位置。所述表面可以是固体表面(例如玻璃、塑料或硅)。所述表面可以存在于诸如杯(例如Eppendoff管)的容器中,或者存在于微孔板的孔中,或者存在于装置中。
Mogila et al.最近的研究表明了嗜热链球菌Csm(StCsm)的个体亚基的作用(Mogila et al.,2019.Cell Reports 26:2753-2765)。此外,设计了仅含有Csm3、Csm4和Cas10(Cmr1)亚基(和crRNA)的最小Csm复合物,该复合物仍保留了所有三种催化活性(RNase、ssDNase、cOA合酶)。
在保留所有催化活性的同时废除几个亚基,这为III型CRISPR/Cas***的实际应用提供了可能。最值得注意的是,没有报告cOA的产生受到影响(Mogila et al.,2019.同上)。
如Mogila et al.所描述的,这些最小复合物将包括IIIA型CRISPR/Cas的Cmr1、3和4及IIIB型CRISPR/Cas的Cmr2、3和4,这些亚基的拷贝数可能变化。为了增加cOA的产生及靶点检测的特异性和灵敏度,可以增加Csm3/Cmr4亚基的数量。
此外,可以突变这些亚基以优化其活性。
所述Cmr蛋白优选以化学计量为Cmr1∶Cmr3∶Cmr4∶crRNA=1∶1∶4∶1和化学计量为Cmr1∶2∶3∶4:5∶6∶crRNA=1∶:1∶∶4∶3∶1∶被提供给合适的crRNA。
核蛋白复合物能如下组装在TtCmr46 crRNA上:
首先,将3.5μL crRNA(700ng)加入到3.5μL 1XCmr缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl)中。接着,以特定顺序(Cmr3、Cmr2、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cmr1)将亚基加入到反应混合物中至终浓度分别为.5μM、2.5μm、10μM、7.5μM、2.5μM和2.5μM,以组成20μL的总反应体积。该反应混合物可在65℃下孵育30分钟。
重构I类3A型复合物的优选方法包含将3.5μL crRNA(700ng)加入到3.5μL 1XCmr缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl)中,然后以Csm4、Csm1、Csm3、Csm2、Csm5的顺序加入亚基至终浓度分别为2.5μM、2.5μM、12.5μM、7.5μM和2.5μM,以组成20μL的总反应体积。该反应混合物可在60℃或65℃下孵育30分钟。
表2优选的Cmr和Csm序列
GeneID标识符来自NCBI RefSeq基因组的基因数据库的基因标识符
4.5、检测RNA的方法
用于诊断目的的常规CRISPR/Cas***(例如Cas12/Cas14(UC Berkeley,CA,USA)和基于Cas13的***(Broad Institute,MA,USA))依赖于邻近靶位点存在的特定基序。在生物环境中,这种机制被用来区分自体和非自体。如果没有这种基序,这些Cas蛋白就不能切割它们的靶标,并且它们就不可能成为诊断***。对于Cas12和Cas13这些基序分别被称为原间隔区邻近基序(PAM)和原间隔区侧翼位点(PFS)[Westra et al.2013.PLoS Genet 9:E1003742;Abudayyeh et al.2016.Science 353:aaf5573]。在某些Cas12/Cas14蛋白的情况下,这种所需的PAM是TTTN/TTTA,其大大限制了靶序列的选择。对于Cas13,所需的基序限制在较小的范围内,有利于邻近靶序列的H核苷酸(A、C、U)。
III(B)型CRISPR***使用了不同的自体与非自体机制,通过检查crRNA的5′-重复标签与相应的3′-原间隔区侧翼序列之间的互补性来防止自身免疫[Guo et al.,2019.RNABiol 16:1513-1520]。这两个区域之间的互补性在一定程度上影响相对cOA的产生,但不需要特定的PAM/PFS样序列才能使III型发挥预期的功能,这与目前使用的***相比具有很大的优势[Guo et al.,2019.RNA Biol 16:1513-1520]。
此外,Cas13靶标选择的使用还受到在靶RNA中形成的潜在二级结构的限制[Smargon et al.,2017.Mol Cell 65:618-630]。目前正在使用的诊断应用在37℃下运行,与在65℃下运行的用于嗜热栖热菌的IIIB***不同[Staals et al.,2013.Mol Cell,52:135-145]。这种升高的温度减少了在靶RNA序列中形成的潜在的二级RNA结构的数量[Wanet al.,2012.Mol Cell 48:169-181]。
本发明的用于检测特定RNA序列的方法可用于人类保健、兽医诊断、植物病原体的检测、水污染物的检测及食品和饲料污染物的检测。此外,本发明的用于检测特定RNA序列的方法可用于检测有益生物。通常,本发明的方法能用于细菌、真菌、古细菌、原生动物(protest)、原生动物(protozoal)、真核生物、病毒和病毒学病原体的检测。此外,本发明的方法还可用于检测和诊断在人、动物和植物中以RNA分子形式表达的遗传改变或性状。
对于人类保健和兽医诊断,核酸物质(包括RNA)优选从生物体液中分离,优选从脑脊液、唾液、鼻咽分泌物、口咽分泌物、汗液、尿便或血液中分离。术语“血液”包括血浆和血清,血浆是通过去除(例如离心法)红和白血细胞而制备的,而血清是通过形成血凝块并去除(例如离心)血凝块而制备的。优选的生物体液是血液。用于从生物体液,特别是血液中分离核酸物质的方法和组成优选使用水性溶剂,而不使用有机溶剂和离液盐。
如有必要,核酸物质(包括RNA)可使用诸如物理和化学方法的组合从样本中纯化出来。优选使用用于核酸分离的可用的商购***(例如或 核酸提取***(bioMérieux,Marcy l′Etoile,France)或MagNAPure 96***(Roche Diagnostics,Almere,The Netherlands))。
为此,可以通过本领域公知的任何技术从样本中分离RNA,该技术包括但不限于合适的商业RNA分离试剂盒,包括Trizol(Invitrogen;Carlsbad,California)、(Applied Biosystems/Ambion,Austin,Tx)、(Qiagen,Hilden,Germany)、AgilentTotal RNA Isolation Lits(Agilent;Santa Clara,Califomia)、(Tel-Test.Friendswood,Texas)、the RNeasy mini kit(Qiagen,Venlo,The Netherlands)和MaxwellTM 16 Total RNA Purification Kit(Promega;Madison,Wisconsin)。分离的RNA,优选mRNA,优选在RNA依赖的DNA聚合酶的帮助下逆转录成单链或双链cDNA。
根据本发明的用于诊断目的的III型CRISPR/Cas包括但不限于医学诊断(例如***、呼吸道感染(特别是SARS-CoV-2和呼吸道合胞病毒(RSV))、血液感染(败血症)、抗生素耐药性标志物(例如耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)标志物的表达和广谱β-内酰胺酶标志物)、胃肠道感染、皮肤感染、牙源性感染、***感染(例如念珠菌病、***毛滴虫和加德纳菌属)、男性生殖***感染、热带传染病(例如疟疾、锥虫、登革热、寨卡热、鸡肯雅热)、由衣原体、淋病、人类免疫缺陷病毒、疱疹、梅毒引起的性传播疾病的检测及基因缺陷(包括癌症和自身免疫性疾病)的检测。
根据本发明的III型CRISPR/Cas可进一步用于兽医诊断,包括牛传染性疾病(例如乳腺炎、蓝舌病和***)、沙门氏菌、克雷伯氏菌、弯曲菌、猪传染性疾病(例如呼吸道疾病、皮炎、腹泻和猪细小病毒感染);绵羊和山羊传染病(例如梭菌病、羊口疮、肺炎和裂谷病毒(Riff Valley Diseae Virus)感染);家禽传染病(例如鸡感染性支气管炎、沙门氏菌);猫传染病(例如感染猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus,FIV)和猫白血病病毒(feline leukaemia virus,FeLV)及呼吸道感染);犬类传染病(例如狂犬病及包特菌属、钩端螺旋体属和Boriella的传染)的检测。
根据本发明的III型CRISPR/Cas检测***可进一步用于植物病原体(例如特定真菌(例如Ascomycetes种和Basidiomycetes种)、特定真菌样的生物(例如卵菌和植粘菌)、特定细菌(例如伯克霍尔德菌、变形杆菌和假单胞菌种);病毒、类病毒和病毒样生物(例如烟草花叶病毒、花椰菜花叶病毒);线虫(例如Meloidogyne chitwoodi和M.fallax)及原生动物和藻类(例如Phytomonas和Cephaleuro))的检测。
根据本发明的III型CRISPR/Cas检测***可进一步用于水污染物,包括细菌污染(例如霍乱弧菌、大肠杆菌、志贺氏杆菌spp.、Legionella spp.、沙门氏菌spp.);病毒污染(例如甲型肝炎、戊型肝炎、脊髓灰质炎病毒);藻类污染(例如Desmodesmus spp的存在)和寄生虫污染(例如Dracunculiasis spp.)的检测。
根据本发明的III型CRISPR/Cas检测***可进一步用于食品和饲料污染物,包括细菌污染(例如肉毒梭菌、大肠杆菌、李斯特菌spp.、沙门氏菌spp.、霍乱弧菌);病毒污染(例如Enterovirus spp.、甲型肝炎、诺如病毒spp.和rotavirus spp.的存在);寄生虫污染(例如Giardia spp.和Trichinella spp.的存在)和真菌污染的检测。
更具体地说,根据本发明的III型CRISPR/Cas检测***可进一步用于任何生物的检测,因为所有生物体在感染期间都产生RNA。所述生物体包括细菌:如杆菌种、梭菌种、肠杆菌种、埃希氏菌种、肠球菌种、克雷伯菌种、李斯特菌种、Legionella种、沙门氏菌种、葡萄球菌种、链球菌种及它们的组合);病毒包括DNA病毒(例如乙肝病毒、腺病毒、人***瘤病毒);RNA病毒(例如流感病毒、甲/丙/丁/戊型肝炎、脊髓灰质炎病毒、烟草花叶病毒、冠状病毒和HIV);类病毒;古细菌;真菌(例如曲霉种、Ascomycetes种、Candida种);原生动物和寄生虫(例如Trypanosoma种)。
使用用于检测RNA的根据本发明的III型CRISPR/Cas检测***将在诊断设置中发现明显的益处。下面将阐述两种这样的诊断设置。然而,本领域的技术人员将毫无疑问地能够找到另外的诊断设置,这些设置将受益于用于检测RNA的根据本发明的III型CRISPR/Cas检测***。
第一个例子通过最近的全球发展说明。精确的及时(point-of-care,PoC)检测将在COVID-19流行病中提供许多好处。最近爆发的SARS-CoV-2产生COVID-19流行病,其在发现后的几个月内就在全球蔓延。为了减缓疾病的传播,许多国家已经制定了预防措施,限制其人口的流动和迁徙。这些限制最终是为了“拉平曲线”,目的是保持国家医疗保健***的压力可控,并以尽可能挽救更多的生命。然而,一些国家/地区显然能够比其他国家/地区更有效地控制感染的增加。例如,新加坡、韩国和中国台湾的感染和随后死亡人数有限,这似乎反映了它们快速反应的成功。这一成功的一个主要因素是他们早期广泛部署大规模检测和随后的自我隔离,而其他国家/地区没有或不能这样做。这种诊断筛选方案有助于识别和隔离感染者,使得大大减缓了病毒的传播,产生更少的感染和更低的死亡率。此外,世界卫生组织还表示需要进行分散、广泛的检测,以便能够对出现的流行病作出快速反应。COVID-19测试中使用的最重要的诊断工具是基于(RT)-PCR,其检测病毒遗传物质(RNA)。虽然这种测试在4-6小时内产生可靠的结果,但只有集中的实验室有资格进行测试,这需要运输样本和至少24小时的每次测试的预期周转时间。即使在发达国家,最近增加的检测能力也不能满足需求。唯一可用的PoC测试是免疫测定法,它不能区分过去和现在的感染,并且不能用于急性期的诊断。
CRISPR-Cas核酸检测诊断为设置分散的筛查平台提供了解决方案。基于CRISPR-Cas的诊断被认为比聚合酶链反应更快,现场执行更便宜(Sheridan,2020.Nat Biotechnol38:382-384)。我们正在开发一种创新的、专有的基于CRISPR-Cas的PoC COVID-19诊断方法,这将有助于提高病毒监测能力,从而限制COVID-19和其他病毒的传播。
第二个例子是通过***(UTI)的检测提供的。目前的UTI诊断尚未达到标准。尤其是在一线医疗保健中,全科医生必须依赖不可靠的检测结果,其阳性预测值仅为61%。这导致对疾病阴性患者的大量治疗和不必要的抗生素处方(Eriksen和Bing-Jonsson,2016.Forskning 1-42;可在sykepleien.no/forskning/2016/09/kan-ikke-stole-blindt-pa-urinstiks获得)。使用III型CRISPR/Cas检测***的及时诊断将提供优于现有方法的主要优势。由于其用于特异的RNA检测的能力,III型CRISPR/Cas检测***允许快速的物种识别和抗生素耐药性标志物的检测。
大多数(70-90%)UTI病例是由泌尿道致病性大肠杆菌引起的,但也可由一系列其他病原体引起(Flores-Mireles et al.,2015.Nat Rev Microbiol 13:269-284)。识别引起感染的特定病原体将提供更多信息,以增加正确使用抗生素的机会。
例如,可能基于特定的16S核糖体RNA物质的表达识别特定病原体。Van der Zeeet al.(van der Zee et al.,2016.PLOS ONE 11:eo150755)显示了可以基于16S的qPCR区分7种引起UTI的病原体。表3提供了使用的引物的一些示例(Van der Zee et al.,2016.同上)。这些引物的靶点可以适应于III型CRISPR/Cas向导序列。类似地,用于检测抗生素耐药性标志物的PCR引物区域也能适应基于III型CRISPR/Cas的检测。
另一个例子是通过检测在生乳制品里的李斯特菌提供的。单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes)是一种熟知的食源性致病菌,能引起致命的李斯特菌病(Iisteriosis)。发现李斯特菌污染蔬菜、乳制品和肉制品等食品。据报道,欧洲有1%至4.4%的生牛奶含有李斯特菌,某些未经高温消毒的奶酪中含有1.1%至65%(Lundén etaI.,2004.J Dairy Science 87,E6-E12)。李斯特菌的基于III型CRISPR/Cas的基因检测能结合其他潜在病原体(例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni))的检测。
使用快速诊断快速检测食源性病原体可能会防止使用和食用受污染的乳制品。在农场进行这种检测将防止经污染的牛奶被运送到乳品加工厂,并防止污染的潜在传播,减少李斯特菌病的机会。
如第一个例子中,基于III型CRISPR/Cas的RNA检测能被设计为基于类似的PCR靶序列。在可能需要的牛奶预处理和可能需要的低检测限中可能会出现并发症。
如果需要,例如为了提高检测水平,本发明用于检测特定RNA序列的方法可以先进行靶序列的扩增。可以通过任何合适的扩增***(包括例如连接酶链反应(ligase chainreaction,LCR)、等温核糖核酸扩增***(例如基于核酸序列的扩增(nucleic acidsequence-based amplification,NASBA)和基于切割的RNA信号扩增)、转录介导的扩增、链置换扩增和聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR))进行扩增。如本领域技术人员已知的,优选在扩增反应之前或期间逆转录RNA。
优选的扩增反应是单管等温反应(例如NASBA、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification,LAMP)、解旋酶依赖的扩增(helicase-dependentamplification,HDA)、重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)反应和酶切扩增反应(nicking enzyme amplification reaction,NEAR)。优选的单管等温反应是RPA反应(TwistDx Ltd.,Cambridge,UK)。
所述单管等温反应(例如RPA)优选与本发明的基于CRISPR的核糖核酸检测***集成为“一锅”反应***。这种一锅或单管***的优点是降低了样本污染或不同样本交叉污染的风险。
对于通过使用直接cOA检测方法检测cOA,样本可以包含内源性水平的PPi和Pi。特别是生物体液(例如血浆、血清、尿液和滑液可分别包含0.16-3.42μM PPi和0.31mM Pi(血浆);3.5μM PPi和1-1.5mM Pi(血清);1.5mM Pi(尿液)及0.1μM Pi和0.3mM Pi(滑液)(Russell et al.,1970.Lancet 296:899-902;Silcox and McCarty,1973.J Clin Invest52:1863-1870;Bansal,1990.Serum Inorganic Phosphorus.In:Clinical Methods:TheHistory,Physical,and Laboratory Examinations(Butterworths);Le,2008.First aidfor the USMLE step 1 2018)。这些水平可能随着时间的推移和疾病的进程而变化(Armstrong et al.,1975.Clin Chem 21:104-108)。
预处理具有高内源性PPi或Pi水平的样本可以通过在检测特定RNA序列之前去除小分子如Pi和PPi来进行。能采取几种方法来防止内源性PPi或Pi水平对读取的干扰,这些包括但不限于以下列出的方法,包括化学沉淀、透析和使用阳离子交换柱。
可以执行去除(例如,通过截留分子量小于1000,优选小于500的过滤器过滤样本)小分子(例如Pi和PPi)。截留分子量定义为膜保留了大于90%的已知分子量溶质的最低分子量(以道尔顿为单位)。
内源性磷物质对测试结果的影响也可以通过从患者样本中分离遗传物质(其中的靶序列)和随后在无PPi/Pi培养基中的应用来消除。用于分离核酸物质的方法包括但不限于有机萃取、螯合萃取、固相萃取、磁珠和/或阴离子交换。
除了降低内源性Pi水平外,还需要样本制备步骤来解决其他因素(包括但不限于患者样本中的蛋白酶、盐浓度和pH值)对读取的干扰。
表3用于检测导致UTI的病原体的特定的qPCR引物如van der Zee et al.(vander Zee et al.,2016.PLOS ONE 11:e0150755)所描述的。
缩写:F=正向引物。R=反向引物。CY5、YY和FAM是荧光染料。
4.6、合适的装置
根据本发明的基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***优选存在于装置中。所述装置优选地包含一个或更多个靶向一个或更多个特定RNA序列的检测***。所述装置可以包含开口(例如入口和出口),用于将流体引入和从装置中提取。所述开口可连接到阀、管、通道、腔室、注射器和/或泵。该装置可连接到允许流体在微流体装置内定向运动的流体流动致动器。致动器示例包括但不限于注射器泵、机械致动的再循环泵、电渗泵、灯泡、波纹管、隔膜或旨在迫使流体运动的气泡。在特定的示例实施方案中,该装置连接到具有可编程阀的控制器,该可编程阀一起工作以移动流体通过该装置。此外,加热机制可用于在所需温度下孵育反应混合物。
所述基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***优选地存在于生物传感器中,优选通过使用一次性盒。优选的生物传感器提供了用于检测基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***与靶核酸相互作用的方法和构件。优选的生物传感器包含可重复使用的手持读取器(该读取器能够简单的按钮操作以自动分析样本)和有成本效益的一次性盒,优选一次性微流控传感器盒,其已被功能化以提供最佳检测和/或多个临床相关的病原体(例如病原体)的定量。一种可能的生物传感器是横向流动测试装置(例如基于可量化物质(例如磁性颗粒)的积累)。
在一个实施方案中,所述装置或生物传感器是及时(POC)测试装置,其是一种可运输的、便携的和手持的仪器或测试套件,允许在非常短的时间内,在患者位置处或附近收集样本并获得结果,从而根据需要调整治疗计划。所述装置优选地包含允许快速、低成本和可靠地确定靶核酸存在或不存在的装置,并且优选地还包括对所述靶核酸进行定量。
包含基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***的POC优选指向检测有限数量的靶核酸分子,包括5个或更少个的靶核酸分子、4个或更少个的靶核酸分子、3个或更少个的靶核酸分子,如2个靶核酸分子和1个靶核酸分子。为此,crRNA核糖核蛋白复合物优选存在于核糖核酸检测***的离散位置,允许确定每个单独crRNA核糖核蛋白复合物的cOA水平。
所述阵列包含基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***,优选地靶向至少5个不同的靶核酸分子,优选地至少10个不同的靶核酸分子,优选地至少20个不同的靶核酸分子,优选地至少50个不同的靶核酸分子,优选地至少100个不同的靶核酸分子。所述阵列包含基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***,优选地靶向2至12000个不同的靶核酸分子。
如本领域技术人员所清楚的,所述不同的靶核酸分子都可以指向不同的生物,从而使得每个crRNA分子源自于并用于检测不同的靶生物(例如不同的细菌、病毒、真菌、原生动物和/或寄生虫)。可以选择所述不同的crRNA分子从而使得不同的crRNA分子的亚群指向相同的生物。所述亚群可包括2个不同的crRNA分子、3个不同的crRNA分子、4个不同的crRNA分子、5个不同的crRNA分子。优选地,指向相同生物的不同crRNA分子的数目限制在最多10个。很明显,通过所有不同的crRNA分子检测靶生物,证实了该靶生物的识别是正确的。
此外,特定的crRNA分子可以多个拷贝存在于在根据本发明的基于CRISPR/Cas的核糖核酸检测***中(例如在微滴度板(例如48孔板、96孔板、192孔板、384孔板或768孔板)的多个孔中)。通过crRNA分子的多个拷贝来检测靶生物证实了对靶生物的识别是正确的。
5、实施例
实施例1
材料和方法
Cmr复合物的纯化及重组Cmr蛋白的表达和纯化的详细描述
如Staals et aI.,2013(Staals et al.,2013.Mol Cell 52:135-145)所描述,纯化了Cas蛋白和Cas复合物。
体外活性试验
RNA底物(表4)用T4多核苷酸激酶(NEB)和5′32P-γ-ATP进行5′标记,然后使用RN凝胶洗脱缓冲液(0.5M乙酸钠、10mM MgCl2、1mM EDTA和0.1%SDS)从变性PAGE中纯化出来。体外活性试验使用经标记的RNA底物和400nM TtCmr,在TtCmr活性试验缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl、10mM DTT、1mM ATP和2mM MgCl2)中进行。除非另有说明,否则反应在65℃孵育1小时。在95℃煮沸5分钟后,加入RNA上样染料(含有95%甲酰胺)。样本在20%变性聚丙烯酰胺凝胶(含7M尿素)上15mA电泳约3-4h或4mA常量下电泳过夜。图像使用磷成像可视化。
Cmr46和Cmr40的复合物重构
首先,将3.5μL crRNA(700ng)加入到3.5μL 1XCmr缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl)中。随后,对于Cmr46,将亚基以特定顺序(Cmr3、Cmr2、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cmr1)加入到反应混合物中,至最终浓度分别为2.5μM、2.5μM、2.5μM、10μM、7.5μM和2.5μM,以组成20μL的总反应量。反应混合物在65℃孵育30分钟。类似地,对于Cmr40的亚基(Cmr3、Cmr2、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cmrl)的终浓度分别为2.5μM、2.5μM、1.875μM、6.66μM、7.5μM和2.5μM。
直接的cOA检测试验
体外cOA检测试验在TtCmr活性试验缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、10mM DTT、1mM ATP和0.5mM MgCl2)中进行,该缓冲液中加入Cmr40-或CMR46-复合物(62.5nM)及RNA底物(200nM,列于表4)。反应在65℃孵育1小时,然后加入0.05单位焦磷酸酶(Thermfisher EF0221),然后在25℃孵育30分钟。使用Sigma-Aldrich Malachite Green磷酸盐/酯试验试剂盒(MAK307)对信号进行可视化。
电泳迁移率位移试验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)
通过在Cmr结合缓冲液(20mM Tris-HCl pH 8.0、150mM NaCl)中孵育400nM内源性TtCmr复合物和经标记的靶RNA(表4)执行EMSA。所有反应在65℃下孵育1小时,然后在5%(w/v)聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)上15mA电泳2.5小时,或在4mA常量下电泳过夜。图像通过磷成像可视化。
结果
不同大小TtCmr复合物的RNA切割活性。
我们之前的研究显示,从嗜热栖热菌HB8纯化的天然Cmr复合物负载有不同长度的成熟crRNA向导,并且crRNA-4.5(嗜热栖热菌CRISPR阵列4,间隔区5)最丰富(Staals etal.,2013.Mol.Cell 52:135-145)。内源性Cmr复合物以6nt间隔特异性地切割互补的5’经标记的靶RNA(4.5靶RNA),产生大多为21、27、33和39个核苷酸的5’经标记的降解片段(图3中A)。然而,内源性Cmr复合物的crRNA的异质性(Staals et al.,2013.同上,Taylor etal.,2015.Science 348:581-586)使这些结果的解释变得复杂。因此,为了进一步探讨靶RNA切割的机制,我们将内源性Cmr复合物替换为与不同长度的单个crRNA(crRNA-4.5)结合的重构的Cmr复合物。
基于在我们之前的RNA测序数据中的丰度,我们选择包括34nt(TtCmr-34)、40nt(TtCmr-40)和46nt(TtCmr-46)长度的crRNA(Staals et al.,2013.同上)。与和内源性复合物一起观察到的5’经标记降解产物混合物相反,每个重构的复合物产生大多为一种尺寸的定义的降解产物(图3中B)。这与复合物的长度由crRNA的长度决定的观点是一致的,越大的复合物(例如TtCmr-46)越靠近靶RNA的5′(经标记)端。越小的复合物(即TtCmr-40和TtCmr-34)分别缺乏一个或两个Cas7-Cas11(Cmr4-Cmr5)骨架片段,因此在更远的位置(离5′标签更远)切割靶RNA,产生越大的降解产物。这些结果显示,内源性TtCmr复合物群体是大小复合物的异质性混合物,在不同的位置切割它们的同源靶RNA。
TtCmr种子序列
为了研究这些不同化学计量比的III型复合物的重要性,我们设置了活性试验法,以探讨靶向性和种子需求的差异。在结构相似的I型效应物复合物(即级联复合物)中,靶向性受两个因素控制:PAM(原间隔区邻近基序)和种子(Mojica et al.,2009.Microbiol155:733-740;Semenova et al.,2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108:10098-10103;Wiedenheft et al.,2011.Proc Natl Acad Sci U S A 108:10092-10097)。然而,在III型***中,自我辨别是由所谓的rPAM赋予的,它检查crRNA的8nt 5′柄(称为核苷酸-8到-1)和原间隔区侧翼对应的3′区之间的互补性[Elmore et al.,2016.Genes Dev 2016.30:447-459;Kazlauskiene et al.,2016.Mol Cell 62:295-306.;Marraffini and Sontheimer,2010.Nature 463:568-571]。在互补的情况下,Cas10的DNase活性被废除。因为TtCmr缺乏DNase活性(Staals et al.,2013.同上),由于N端截短的Cas10蛋白缺乏HD结构域(数据未显示),我们测试了RNase活性是否受与crRNA的5′柄匹配的靶RNA的影响。然而,活性试验显示,这些底物对RNA切割活性没有可辨识的影响,这表明通过TtCmr的RNA靶向不能靶向自身RNA(例如来自CRISPR阵列的反义转录物),与其他III型***类似(Tamulaitis et al.,2014.Mol Cell 56:506-517;Samai et al.,2015.Cell 16l:1164-1174)。
接着,我们通过设置在crRNA向导部分(与原间隔区配对的crRNA碱基的非重复片段)的前8nt中有突变的活性试验来测试TtCmr是否利用了类似于I型***的种子。结果表明,RNA靶向性不受这些突变的影响,尽管在第5位的错配阻断地消除了邻近的切割位点,如缺失的39个nt降解产物所示(图4中A、B)。如图4中A所示,crRNA向导部分的前8个nt的突变不影响靶RNA降解。然而,它对cOA产生和随后的非特异的RNA降解的影响尚不清楚。通过使用新的分析方法,可以更深入地了解单核苷酸错配对cOA产生的影响。
对于内源性的TtCmr复合物和两个重构的Cmr复合物(46nt和40nt,图5),结果清楚地证明了在1、2和5nt位置有互补对cOA产生的重要性(图3)。与1、2和5相比,4位置的nt错配对cOA产生的影响较小。值得注意的是,在3、6和7位置的nt错配对似乎对第二信使分子的产生没有什么影响。
这些结果表明,在这区域完全互补是不必要的,并且种子可能位于不同的区域。事实上,对来自冰岛硫化叶菌的IIIB型Cmr复合物的早期研究(Peng et al.,2015.NucleicAcids Res 43:406-417)显示在crRNA的3′端需要严格的碱基配对。
为了研究这种可能性,我们用内源性TtCmr复合物和带有不同错配片段的RNA靶标执行了活性分析(图6中A)。与之前的发现一致,尽管跳过了错配片段下游的一个切割位点,第一片段(核苷酸1-5)中的错配的RNA靶标不会干扰靶标的降解。然而,其对cOA产生的影响非常显著,几乎完全消除了cOA(图6)。对于第二和第三错配片段(核苷酸7-12和13-17),它们的上游和下游切割位点都被跳过,而其他切割位点不受影响。第二片段错配完全消除了cOA的产生,而在第三片段错配中仍观察到大量cOA的产生。然而,当在第四和第五片段(核苷酸19-23和25-29)中引入错配时,RNA的降解被完全消除,而cOA的产生仅在第四个片段错配中受到影响。最后一个片段(核苷酸31-35)中的错配除了跳过上游切割位点外,对RNA降解或cOA产生没有影响。这表示在跨越第四和第五片段区域中的碱基配对对于靶标识别和降解至关重要,同时也在cOA产生的起始过程中发挥作用。
由于内源性复合物是较长复合物和较短复合物的混合物,我们转而使用46nt(TtCmr-46)或40nt crRNA(TtCmr-40)的重构的复合物,以便更精确地定位这个关键区域。TtCmr-46复合物几乎完全反映了用内源性复合物获得的结果,显示出第四和第五片段中的错配对RNA降解的敏感性,及第一、第二和第四片段中对cOA产生的显著影响(图5中B)。然而,在TtCmr-40复合体中,这一重要区域似乎移动了1个片段,在第三和第四片段中有严格的碱基配对要求(图5中A)。综上所述,这些结果强烈地表明TtCmr中位于3′的种子区域,显著地向具有较小的crRNA的向导的5′端(并且因此向复合物)移动。我们提出这些区域,共同或独立地作为TtCmr中的种子序列。
我们假设该种子序列负责在互补RNA靶点识别过程中使结合开始。为此,我们使用内源性TtCmr复合物在EMSA中测试了相同错配RNA靶标的结合亲和力(图6中A)。与活性试验一致,我们观察到在前三个片段(核苷酸1-5、7-11和13-17)中有错配的靶点不会干扰与TtCmr复合物的结合,并且完全互补的RNA靶标对照类似地迁移。然而,第四和第五片段(核苷酸19-23和25-29)中的错配严重影响了TtCmr-靶RNA三级复合物在凝胶上的迁移。虽然该迁移与未结合状态的不同,但我们预计这可能代表与靶RNA另一下游(互补)部分的部分结合。
为了进一步证实碱基配对起始于crRNA的3′端,我们在EMSA中设计了短的11nt靶RNA。尽管与crRNA的5′部分互补的靶点不能与crRNA碱基配对,但与提出的3′种子区域碱基配对的靶点能够结合(图6中B)。这些结果表示,向导的5′端在某种程度上屏蔽了与其同源靶RNA的碱基配对相互作用。相反,crRNA:靶双链形成物似乎起始于向导的3′端,然后向5′端延伸。
之前,我们解决了不同大小的载脂蛋白和ssRNA靶标结合的TtCmr复合物的冷冻电镜结构(Taylor et al.,2015.Science 348:581-585)。我们观察到该复合物在与靶RNA结合时发生了亚基的协同重排。最值得注意的是,Cas11(Cmr5)纤维远离复合物中心旋转,从而将更多位于5′的crRNA部分暴露在允许crRNA:靶RNA双链进一步传播的通道中。这些观察结果与本研究识别的种子区域一致。例如,所提出的种子位于有更高可及性的区域中,并与Cmrl、Cmr6和Cmr4拇指(a Cmr4 thumb)相互作用。它也是crRNA的第一片段,从顶部与Cmr5邻近。这表明,最初的靶点结合可能始于Cmr1头部最易接近的“开放”区域;然而,需要关键的种子序列残基以通过在“封闭的”主要骨架(Cmr4)和次要骨架(Cmr5)间***来起始复合体内的构象变化。一旦种子区域结合,TtCmr的通道能打开,其余的底物可以碱基配对,从而传播协调一致的构象变化。
实施例2
材料和方法
CMR46-复合物重构
首先,将3.5μL crRNA(700ng)加入到3.5μL 1XCmr缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl)中。随后,将亚基以特定顺序(Cmr3、Cmr2、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Cmr1)加入到反应混合物中,最终浓度分别为2.5μM、2.5μM、10μM、7.5μM、2.5μM和2.5μM,以组成20μL的总反应量。反应混合物在65℃孵育30分钟。
在该试验中使用的靶RNA序列包含以下序列:
(GAACUGCGCCUUGA)C(GUGGU)C(GUCCC)C(GGGCG)C(CUUAU)C(UACGGCCAUCG),其中,下划线的核苷酸是脱氧核苷酸。这个靶RNA不能被Cmr复合物切割。
Pi检测试验
体外cOA检测试验在TtCmr活性试验缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、10mM DTT、1mM ATP和0.5mM MgCl2、2单位耐热的无机焦磷酸酶(NEB#M0296S))中送行,该缓冲液中加入Cmrt复合物(62.5nM)及RNA底物(200nM,除非另有说明)。除非另有说明,否则反应在65℃孵育1小时。使周Sigma-Aldrich Malachite Green磷酸盐/酯试验试剂盒(MAK307)对信号进行可视化。
Csx1原理证明实验
对于Csx1原理证明实验,除在65℃孵育1小时后,样本在95℃热灭活10分钟外,按照“Pi检测试验”中描述的执行cOA检测试验。热灭活后,样本在13000g下离心10分钟,然后上清液在-20℃下储存。在有TtCmr活性缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、10mMDTT、1mM ATP及0.5mM MgCl2、2单位耐热无机焦磷酸酶(NEB#M0296S))和~1.5ug Csx1(TTHB144)的反应混合物中加入2uL之前获得的上清液,并且在65℃孵育10分钟。孵育后根据说明书加入RNase alert(IDT#11-04-03-03)或DNase alert(IDT#11-04-03-04)试剂。测量荧光后,该反应在37℃孵育30分钟。
结果
灵敏度实验
反应时间(A)设为1h,显色时间为30min,以考察***的灵敏度。如图8中A所显示的,在500pM-1nM的靶RNA范围内获得了可测量的读数(比非靶标增加~2倍)。制作缺少切割靶RNA能力的突变亚基以增加有效的灵敏度的策略被使用复合物不能切割的靶RNA模拟。
时间序列实验
设置该实验以在特定的时间点上确定可测量的信号(以比空白样本增加的倍数表示)。总反应时间由两部分组成:A)靶RNA加入后的Pi产生反应和B)显色剂加入后的比色反应。最终的输出是倍数增加,其在结合的两个反应时间结束时用吸光度来测量。最终应用中总反应时间的持续时间由期望的可测量的阈值设置(比空白样本(阴性对照)增加的倍数)。在图8的B中,选择有15分钟的设定显色反应时间(B)和可变的Pi产生反应时间(A)的数据集。这是任意选择的,以给出***的观点。
Csx1介导的原理证明实验
实施图8中C所示的这一原理证明实验是为了证明靶RNA诱导的Csx1的激活。将在靶RNA存在的情况下孵育从而产生cOA的部分反应混合物加入到含有Csx1及ssRNA或ssDNA猝灭剂荧光团序列的新反应物中。柱状图中所示的结果清楚地显示了加入含cOA的混合物后ssRNA的降解。这表示,Csx1在识别靶RNA时能被III型CRISPR Cas***间接激活。
实施例3
材料和方法
Cas蛋白和Cas复合物
通过靶向诱变产生Cmr4 D26N切割死亡突变体。在密码子优化以与异源表达宿主大肠杆菌兼容后,所有Cas蛋白编码序列均作为合成的gBlocks(Integrated DNATechnologies(IDT))生成。使用本领域技术人员已知的标准克隆方法将所有编码序列克隆到表达载体中。此外,通过Cmr4 gBlock的靶向诱变产生了Cmr4 D26N切割死亡突变体。表达载体含有N-或C-末端链球菌标签、选择性的TEV切割位点、双顺反子设计元件、T7启动子序列、终止子序列、p15A低拷贝复制起点和卡那霉素抗性标志物。表达载体本身衍生自p15A克隆载体(Addgene质粒#41187)。将所有表载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)中用于蛋白表达。
重组菌株在2L溶原肉汤(Lysogeny Broth,LB)培养基中培养,生长直到OD600达到~0.6。培养物在冰上放置1小时后,加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.2mM。培养物随后在18℃下孵育16小时(过夜)。收获细胞(5000g,10分钟)并在缓冲液A(100mM Tris-HCl、150mM NaCl,pH8.0)中通过超声处理裂解,然后在30000g下离心45min。澄清的裂解液经过滤,并在经预平衡的StrepTrap FPLC柱(GE Healthcare,Chicago,IL)上运行。在用缓冲液A洗涤柱直到流经液中没有蛋白质后,使用缓冲液B(100mM Tris-HCl、150mM NaCl和2.5mM D-去硫代生物素)洗脱感兴趣的蛋白质。如果需要,通过加入TEV蛋白酶(Genscript cat.No.Z03030),将蛋白质从亲和标签上切割下来,并在4℃下孵育过夜。通过HisTrap亲和色谱法步骤从混合物中分离出感兴趣的蛋白质,收集该步骤中的流经液。如果需要,加入额外的体积排阻色谱以获得更高的纯度。
Cmr46-复合物和dCmr46-复合物重构
首先,将3.5μL crRNA(700ng)加入到3.5μL 1XCmr缓冲液(20mM Tris-HCl,pH8.0、150mM NaCl)中。随后,将亚基以特定顺序(Cmr3、Cmr2、Cmr4或Cmr4 D26N、Cmr5、Cmr6、Cmr1)加入到反应混合物中至最终浓度分别为2.5μM、2.5μM、10μM、7.5μM、2.5μM和2.5μM,以组成20μL的总反应量。反应混合物在65℃孵育30分钟。
间接的cOA检测试验
体外cOA检测试验在TtCmr活性试验缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、10mM DTT、1mM ATP和0.5mM MgCl2)中进行,该缓冲液中加入重构的Cmr46复合物(62.5nM)、不同浓度的RNA底物(列于表4或表5)、Csx1(1μM)和0.5μL RNaseAlert QC***(ThermoScientific,根据说明书制备)。将反应在qPCR热循环仪中在65℃下孵育,以2分钟的间隔测量荧光输出(495/520nm激发/消光),或通过在Genie III(Optigene)中在65℃下孵育,以15秒间隔(495/520nm激发/消光)测量荧光输出。在不同浓度的目标RNA下的测量被用于确定***的灵敏度范围。
结果
确认靶RNA结合dCmr46的能力和随后的Cmr2/Cas10激活
产生了Cmr4 D26N突变体,因为它假设是只影响复合体的切割能力,而不影响复合体的结合能力或随后的Cmr2/Cas10亚基的激活。为了证明这一点,使用前述的间接cOA可视化方法测量了靶标结合能力。事实上,突变的蛋白质并没有消除全长IIIB型复合物(Cmr46)的靶标结合(图9、10)。
此外,在与野生型IIIB型复合物相比时,全长催化死亡IIIB型复合物(dCmr46)被发现增加了靶RNA的灵敏度(图9、10)。
此外,试验的信号输出表示,在与野生型Cmr46相比时,dCmr46在相同的时间框架内产生了更多的cOA(图11)。我们旨在为了诊断目的而利用Cmr4 D26N的这些特征,其中我们将该突变应用于更高靶灵敏度的体外培养试验。这给出了检测试验样本中较低浓度的靶物质的益处,或者降低达到检测极限所需的预扩增水平。
表5在间接cOA检测试验中使用的RNA寡核苷酸
实施例4来自嗜热栖热菌的IIIA型***(Csm)
材料和方法
cOA检测试验
体外cOA检测试验在TtCmr活性试验缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.0、150mM NaCl、10mM DTT、1mM ATP和0.5mM MgCl2)中进行,该缓冲液中加入内源性Csm复合物(~2μg;Staal et al.,2014.Mol Cell 56:518-530)和RNA底物(200nM,列于表4)。反应在65℃孵育1小时,然后加入0.05单位焦磷酸酶(Thermfisher EF0221),然后在25℃孵育30分钟。使用Sigma-Aldrich Malachite Green磷酸盐/酯试验试剂盒(MAK307)对信号进行可视化。实验根据表6所示的设计实施。
表6使用内源性IIIA型Csm RNP复合物用于直接检测cOA的反应概要。反应A到D是根据所提出的组成设置的。
A | B | C | D | |
Csm复合物 | + | + | + | + |
靶RNA | - | - | + | + |
焦磷酸酶 | - | + | - | + |
结果
图12显示了IIIa型Csm cOA产生试验的结果。这种III型CRISPR/Cas复合物还显示了在加入互补的靶RNA后产生的cOA。
实施例5一锅SARS-CoV-2检测
材料和方法
IIIB型Cmr crRNA和RPA引物的设计
基于世界卫生组织(World Health Organization,WHO)和疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)的报告,N基因被鉴定为用于SARS-CoV-2检测的合适靶点。crRNA被设计用于N基因中的区域,该区域被CDC称为N3,其在多种SARS-CoV-2样冠状病毒中是保守的:
crRNA_N3:
5’-AUUGCGACGCAGCATTGTTAGCAGGATTGCGGGTGCCAATGTGATC 3’
为了扩增N3区,根据TwistAmp Liquid Basic kit(TwistDx Ltd,Maidenhead,UK)提出的参数设计了用于RPA的DNA引物。此外,在正向引物的5′处加入T7启动子序列,用于体外转录。通过筛选多个用于成功扩增的候选引物,我们鉴定出性能最好的引物对:
nCOV_N3_RPA_F1:5′
GGCATAATACGACTCACTATAGGGTCTGATAATGGACCCCAAAATCAGCGAAAT 3′
nCOV_N3_RPA_R1:5′CTCCATTCTGGTTACTGCCAGTTGAATCTG 3′
使用crRNA_N3如前所描述地对Cmr46复合物进行了重构。
SARS-CoV-2检测试验将RPA和IIIB型Cmr检测结合在单一反应中。合成的SARS-CoV-2被用作靶RNA。该基因组由Twist Biosciences(South San Francisco,CA)提供,为6个非重叠的5kb RNA片段,约每微升106拷贝。基于分离的Wuhan-Hu-1(GenBank ID:MN908947.3)创建了参考基因组。
TwistAmp Liquid Basic kit(TwistDx)为RPA扩增提供了试剂。为了允许在小样本体积下工作,供应商提供的每种RPA反应混合物被分成四等份。此外,寡核苷酸引物、逆转录酶组分和T7体外培养转录物被引入到这些混合物中:1.5μL引物混合物(10mM;Integrated DNA Technologies)、0.5μL M-MLV RT(100U/μL;Invitrogen),0.5μL DTT(50mM;Invitrogen)、0.25μL鼠RNase抑制剂(40U/μL;New England Biolabs(NEB))、0.5μLT7聚合酶(50U/μL;NEB)、2.25μL dNTP溶液混合物(10mM;NEB)和2.25μL NTP溶液混合物(20mM;NEB)。继RPA混合物之后,通过结合0.125μL RNaseAlert QC***(ThermoScientific,制造商提供的干燥颗粒重悬于100μL而不是1mL)、1μL Csxl(10μM)、Cmr46复合物至终反应混合物浓度~60nM和ATP至终反应混合物浓度为1mM来创造SARS-CoV-2Cmr混合物。混合两种反应溶液后,16.5μL RPA混合物与4.25μL SARS-CoV-2Cmr混合物和1μL SARS-CoV-2合成的基因组模板结合。创建了包含100000拷贝/L至10拷贝/L范围内的基因组模板的多种混合物。反应在Genie III(OptiGene)中37℃孵育30分钟,65℃孵育45分钟。该仪器在495/520nm(激发/发射)下从30分钟开始进行荧光读取。
结果
SARS-CoV-2检测试验在单一反应中结合了靶遗传物质的扩增和检测。此一锅反应混合物在37℃孵育45分钟(预扩增),然后温度升高到65℃(信号产生)。在图13中,描绘了来自SARS-CoV-2合成基因组潜伏期的数据。结果显示,在65℃孵育的几分钟内,与阴性对照(NC)相比,信号显著增加。据估计,预扩增时间能进一步缩短,因为通常在65℃孵育5分钟后就可以观察到信号的产生。
实施例6一锅SARS-CoV-2检测的验证
材料和方法
与Wageningen Bioveterinary Research(WBVR)合作,执行了小规模试验,以验证水貂样本中用于SARS-CoV-2的一锅III型检测试验。使用Direct Zol RNA miniprep kit(Zymo Research)对4只COVID阳性水貂(GenBank ID MT396266、MT457390和Mt457399)的直肠拭子样本执行RNA提取。样品在100μL无RNase水中洗脱,其中5μL用作检测试验的模板。TwistAmpTM nfo Kit(TwistDx)提供用于通过RPA扩增的试剂。为了允许在小样本体积下工作,供应商提供的每种RPA反应混合物被分成四等份。提供的无引物再水合缓冲液与每反应1.05μL引物混合物(5mM正向和反向;Integrated DNA Technologies)结合,并且随后被用于再水合提供的RPA颗粒。此外,通过结合4.5μL重构的Cmr46复合物(至终反应混合物浓度~60nM,负载N3基因crRNA)、0.125μL RnaseAlert QC***(Thermo Scientificial,制造商提供的干燥颗粒重悬于100μL而不是1mL)、0.25μL ATP(80mM;Sigma Aldrich)、1μL Csx1(10μM)、0.5μL M-MLV RT(100U/μL;Invitrogen)、0.5μL DTT(50mM;Invitrogen)、0.25μL鼠RNase抑制剂(40U/μL;New England Biolabs(NEB))、0.5μL T7聚合酶(50U/μL;NEB)和2μLNTP溶液混合物(20mM;NEB)。对于每个试验反应,8.425μL RPA混合液与5.625μL Cmr混合物、0.625μL MgOAc(280mM,TwistDx)和5μL模板或不含RNase的MQ混合,至总量为19.675μl。作为阳性对照,使用5μL 100拷贝/μL SARS-CoV-2合成的基因组(见实施例5)。反应混合物在Genie III(OptiGene)分光光度计中37℃孵育30分钟,并且随后在65℃孵育45分钟。数据采集是在65℃孵育期内完成的,以15秒间隔测量495nm/520nm(激发/发射)的荧光。
结果
自2020年4月底荷兰水貂养殖场首次爆发SARS-CoV-2以来,WBVR一直负责荷兰水貂的所有诊断测试。提供了提取的RNA样品,并且随后用于诊断试验,该试验结合靶遗传物质的扩增与单一反应中的检测。此一锅反应混合物在37℃孵育45分钟(预扩增),之后温度升高到65℃(信号产生)。来自水貂SARS-CoV-2样本孵育期间的数据描绘在图14中。这些结果清楚地显示,在65℃孵育30分钟内检测SARS-CoV-2是可能的,显示了这项技术在现实世界复杂样本矩阵上的适用性。
Claims (17)
1.一种基于成簇的规律间隔的短回文重复(CRISPR)的核糖核酸检测***,包含:
a)效应物复合物,所述效应物复合物包含III型CRISPR相关效应物蛋白(Cas)和与靶核酸分子结合的至少一种CRISPR RNA(crRNA);
b)用于直接或间接确定环状寡腺苷酸(cOA)水平的构件。
2.根据权利要求1所述的检测***,其中,所述III型Cas是IIIB型Cas,优选IIIB型Cmr。
3.根据权利要求1或2所述的检测***,其中,所述III型Cas来自诸如嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的嗜热生物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的检测***,其中,所述III型Cas缺少切割活性。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的检测***,其中,所述用于直接或间接确定cOA水平的构件包含用于确定焦磷酸盐/酯(PPi)水平的构件。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的检测***,进一步包含无机焦磷酸酶。
7.根据权利要求6所述的检测***,其中,所述无机焦磷酸酶来自诸如嗜热栖热菌的嗜热生物,所述嗜热生物允许等温检测。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的检测***,进一步包含cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶,诸如Csx1。
9.根据权利要求8所述的检测***,进一步包含cOA依赖的非特异的效应物内切核糖核酸酶,诸如Csx1,和针对所述内切核糖核酸酶的可检测底物。
10.一种用于确定样本中存在或不存在靶核酸分子的方法,所述方法包含:
为所述样本提供根据权利要求1-9中任一项所述的核糖核酸检测***;
在允许crRNA与其靶核酸分子结合的条件下孵育所述样本;以及
直接或间接地确定环状寡腺苷酸(cOA)水平,由此与对照相比,所确定的cOA水平的增加表示在所述样本中存在所述靶分子。
11.根据权利要求10所述的方法,其中,通过确定焦磷酸盐/酯的水平或在所述检测***中存在无机焦磷酸酶的情况下确定的无机磷酸盐的水平来确定cOA水平。
12.根据权利要求10或11所述的方法,通过基于比色的、荧光测定的、荧光的或生物发光的试验确定焦磷酸盐/酯或无机磷酸盐的水平。
13.根据权利要求10所述的方法,通过使用根据权利要求8-9中任一项所述的检测***检测针对所述效应物核糖核酸内切酶的可检测底物来确定cOA依赖的非特异的效应物核糖核酸内切酶,诸如Csx1,的水平,从而间接确定cOA的活性水平。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的方法,所述样本与所述核糖核酸检测***在37℃至85℃之间,优选在约65℃的温度下孵育。
15.一种装置,所述装置包含根据权利要求1-9中任一项所述的核糖核酸检测***。
16.根据权利要求15所述的装置,包含多个排列的根据权利要求1-8中任一项所述的核糖核酸检测***,所述核糖核酸检测***的靶核酸分子不同。
17.一种部件的试剂盒,包含:
a)效应物复合物,所述效应物复合物包含III型CRISPR相关效应物蛋白(Cas)和与靶核酸分子结合的至少一种CRISPR RNA(crRNA);
b)用于直接或间接确定环状寡腺苷酸(cOA)水平的构件。
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