CN115323052A - 子宫内膜癌的生物标记物和其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了表明子宫内膜癌的生物标记物，所述标记物包括以下lncRNA中的一个或其任意组合物：LOC100190940、C20orf56、LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572。本发明还提供了采用所述生物标记物诊断子宫内膜癌的方法。本发明还提供了包含所述生物标记物的诊断子宫内膜癌的试剂盒和基因芯片，及其制备方法。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和疾病诊断试剂制备领域。具体的，本发明涉及子宫内膜癌的长链非编码RNA生物标记物，以及所述长链非编码RNA在制备用于诊断或检测子宫内膜癌的试剂盒或基因芯片的应用。
背景技术
子宫体子宫内膜癌(Uterine Corpus Endometrial Carcinoma,UCEC)简称为子宫内膜癌，是女性生殖***三大恶性肿瘤之一，占我国女性生殖***恶性肿瘤的20％～30％，排第二位。据最新数据统计，2018年全球新发病例数38.2万和死亡9万例，我国UCEC发病率为63.4/10万，发病率逐年上升且发病年龄逐渐低龄化，死亡率为21.8/10万，已严重影响女性身心健康。
1983年，Bokhman教授最早提出按照组织病理学特征将子宫内膜癌分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型子宫内膜癌为***依赖型，占全部UCEC的65％，该型多为子宫内膜样腺癌，肿瘤组织分化程度好，对孕激素治疗效果好，预后较好。Ⅱ型子宫内膜癌为非***依赖型，绝经后女性常见，病理形态少见，多为低分化肿瘤，包括透明细胞癌、浆液性癌及黏液腺癌等，肿瘤恶性程度高，常出现***转移、远处转移和深肌层浸润，预后较I型差。确诊UCEC需要结合患者病史、临床症状和体征、实验室检查、影像学检查等，有诊断金标准的检查是分段诊刮+宫腔镜子宫内膜组织病理活检，但此操作属有创检查并有一定的风险性，且可能因组织取样大小或位置达不到检测标准以及存在肿瘤异质性等问题出现单次检测无法明确诊断，也难以做到通过多次取样进行动态监测病情的目的。影像学检查中还存在盆腔MRI价格昂贵、CT仪器存在放射性损伤等问题。UCEC临床常用的辅助诊断的血清肿瘤标志物有CA125、CA199、HE4。它们的检测特异性和敏感度均不高，对于早期肿瘤的检出率低。
综上，目前已有的检查对UCEC肿瘤的临床诊断价值比较局限，缺乏早期筛查UCEC及其癌前病变的检查手段。因此，迫切需要挖掘并寻找到有效的非侵袭性的生物标志物，为UCEC肿瘤的早期诊断及治疗、预后判断等多方面提供依据。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)作为竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的一员，发挥着调控基因的表达和参与细胞和组织发生发展过程的作用。LncRNA是长度大于200个核苷酸、缺少开放阅读框架且无编码蛋白能力的内源性RNA，可以提供与蛋白质结合的多个位点、或通过碱基互补配对原则与DNA、RNA相互作用，参与多种生物学过程的调控。绝大部分的lncRNA不合成蛋白质，也不编码基因，却以RNA的形式参与了染色质重塑、组蛋白修饰、基因转录后调控、剪切修饰等调控过程，还能形成核酸蛋白质复合体或成为小分子RNA，发挥其生物学功能。研究表明，lncRNA作为人类基因组中一类重要的表观遗传调控因子，通过表观遗传转录调控以及转录后调控等多种机制调控癌基因和抑癌基因的表达，使基因激活或沉默；也可以作为一种竞争性内源性RNA(ceRNA)与miRNA调控作用，调节靶基因的表达水平，并在肿瘤的发生过程中发挥重要作用。
提高子宫内膜癌的生存率、降低死亡率的重要手段在于早诊断和及时治疗。本领域还需要一种对子宫内膜癌的诊断，特别是通过特异性相关RNA的表达水平来对子宫内膜癌进行准确和快速的检测或预测的方法、试剂盒或基因芯片。
发明内容
本发明提供了表明子宫内膜癌的由lncRNA组成的生物标记物。本发明提供了检测所述生物标记物的lncRNA的水平变化来诊断受试者是否患有子宫内膜癌或处于发生子宫内膜癌的风险中的方法以及用于这些方法的试剂盒或基因芯片。
在本发明的一个方面，提供了子宫内膜癌的生物标记物，所述标记物包括以下lncRNA：LOC100190940、C20orf56、LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572中的一个，或其中多个lncRNA的任意组合。所述生物标记物可用于诊断受试者是否患有子宫内膜癌或处于发生子宫内膜癌的风险。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是长度大于200个核苷酸、缺少开放阅读框架且无编码蛋白能力的内源性RNA。lncRNA参与染色质重塑、组蛋白修饰、基因转录后调控、剪切修饰等调控过程，还能形成核酸蛋白质复合体或成为小分子RNA，发挥其生物学功能。
本发明中涉及的lncRNA包括：
LOC100190940(另名为LINC02418)，Gene ID:100190940，生物学信息包括序列信息在以下网页公开：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_024457.2
C20orf56(另名为LINC00261)，Gene ID:140828，生物学信息包括序列信息在以下网页公开：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_001558.3
LOC100144604(另名为LINC00930)，Gene ID:100144604，生物学信息包括序列信息在以下网页公开：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_021493.1
LOC727677(另名为CASC8)，Gene ID:727677，生物学信息包括序列信息在以下网页公开：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_024393.1
LOC151534(另名为LBX2-AS1)，Gene ID:151534，生物学信息包括序列信息在以下网页公开：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_024606.2
LOC158572(另名为USP27X-AS1或USP27X-DT)，Gene ID:158572，生物学信息包括序列信息在以下网页公开：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_026742.1
FLJ35390(另名为LINC00957)，Gene ID:255031，生物学信息包括序列信息在以下网页公开：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NR_015401.2
在本发明的其中一个方面，提供了子宫内膜癌的生物标记物，所述标记物包括以下lncRNA：LOC100190940。在本发明的其中又一个方面，所述标记物为多个lncRNA的组合，所述组合包括以下lncRNA：LOC100190940和C20orf56。在本发明的其中又一个方面，所述标记物为多个lncRNA的组合，所述组合包括以下：LOC100190940、C20orf56、LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572。
本发明提供了通过测量前述子宫内膜癌的生物标记物来诊断受试者是否患有子宫内膜癌或处于发生子宫内膜癌的风险的方法。本发明还提供了测量前述子宫内膜癌的生物标记物的水平的试剂在用于制备诊断子宫内膜癌的试剂盒或装置中的用途。所述测量前述子宫内膜癌的生物标记物的水平的试剂用于测量下述lncRNA的水平：LOC100190940。在本发明的其中又一个方面，所述lncRNA还包括：C20orf56。在本发明的其中又一个方面，所述lncRNA还包括以下LncRNA：LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572。
在本发明的其中一个方面，所述方法或所述试剂盒和装置通过下述步骤诊断诊断子宫内膜癌：a.测量受试者样品中所述lncRNA的表达水平；b.比较受试者样品中所述lncRNA的表达水平与无患病对照样品中所述lncRNA的表达水平。在本发明的其中又一个方面，当受试者样品中所述lncRNA的表达水平与无患病对照样品中对应lncRNA的水平相比存在显著性差异，则指示着子宫内膜癌的可能性较大。在本发明的其中一个方面，其中所述样品为受试者的子宫内膜组织样品。
在本发明的其中一个方面，所述方法或所述试剂盒和装置还用于对子宫内膜癌进行分期，例如分为III-IV期或I-II期。分期标准可按照2009年国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)的定义。FIGO 2009子宫内膜癌分期标准为：I期：肿瘤局限于子宫体；II期肿瘤侵犯宫颈间质但无宫体外蔓延；III期肿瘤局部和(或)区域的扩散；IV期肿瘤侵及膀胱和(或)直肠黏膜，和(或远处转移)。
lncRNA的水平的测量可以测量从受试者得到的生物样品的细胞中的lncRNA的水平。例如，通过常规活检技术，可以从被怀疑患有子宫内膜癌的受试者取出组织样品，例如子宫内膜组织的样品。在另一个实施方案中，可以从受试者取出血液样品，并通过标准技术，分离白细胞。相应的对照组织或血液样品或对照参照样品，可以从受试者的未受影响的组织、从正常人个体或正常个体的群体、或从与受试者样品中大多数细胞相对应的培养细胞得到。可以将来自受试者样品中从给定lncRNA的水平与来自对照样品的细胞的lncRNA水平相对比。或者，可以与测试样品单独分开地得到和加工处理参照样品(例如在不同时间)，并将来自测试样品的细胞中从给lncRNA产物的水平与来自参照样品的相应lncRNA水平相对比。
使用适用于检测生物样品中的RNA表达水平的任意技术，可以测量样品中lncRNA基因产物的水平。用于测定生物样品(例如，细胞，组织)中RNA表达水平的合适技术(例如，RNA 印迹分析，RT-PCR，原位杂交)是本领域技术人员众所周知的。在一个具体的实施方案中，使用RNA印迹分析，检测至少一种lncRNA的水平。例如，可以如下从细胞纯化总细胞RNA：在有核酸提取缓冲液存在下匀浆，随后离心。沉淀核酸，通过用DNA酶处理和沉淀，去除DNA。然后根据标准技术，通过琼脂糖凝胶上的凝胶电泳分离RNA分子，并转移至硝酸纤维素滤膜。然后通过加热，将RNA固定化在滤膜上。使用与目标RNA互补的适当标记的DNA或RNA探针，进行对特定RNA的检测和定量。
通过逆转录lncRNA，随后通过聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增逆转录的转录物，也可以测定细胞中lncRNA的相对数目。可通过与内部标准例如来自存在于相同样品中的“管家”基因的mRNA的水平比较，来定量lncRNA的水平。用作内部标准的合适的“管家”基因包括例如肌球蛋白或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)。用于定量和半-定量RT-PCR的方法和其变化形式，是本领域技术人员众所周知的。
另外，还可构建基因芯片(即微阵列)的文库，其包含对于一组lncRNA特异性的一组寡核苷酸(例如，寡脱氧核苷酸)探针。通过使用该微阵列，可通过逆转录RNA以产生一组靶寡脱氧核苷酸，然后使其与微阵列上的探针寡脱氧核苷酸杂交，从而产生杂交或表达谱，来测定生物样品中多种lncRNA的表达水平。然后将测试样品的杂交谱与对照样品进行比较，以确定在实体癌细胞中具有改变的表达水平的lncRNA。如本文所用的，“探针寡核苷酸”或“探针寡脱氧核苷酸”是指能够与靶寡核苷酸杂交的寡核苷酸。“靶寡核苷酸”或“靶寡脱氧核苷酸”是指待检测(例如通过杂交)的分子。“lncRNA-特异性的探针寡核苷酸”或“对lncRNA特异性的探针寡核苷酸”是指具有经选择与特定lncRNA杂交或与该特定lncRNA的逆转录物杂交的序列的探针寡核苷酸。可以从由已知的lncRNA序列产生的基因特异性寡核苷酸探针制备基因芯片，即微阵列。
在本发明的其中一个方面，还提供了用于诊断子宫内膜癌的试剂盒或装置，其中包含测量子宫内膜癌的前述标记物的水平的试剂。其中，所述标记物为下述lncRNA的：LOC100190940。在本发明的其中又一个方面，其中所述lncRNA还包括：C20orf56。在本发明的其中又一个方面，所述lncRNA还包括以下LncRNA：LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572。
本发明的优点：
肿瘤标志物在肿瘤筛查治疗、病情监测评估、复发转移以及患者预后判断等临床中有着极其重要的运用价值。目前临床用于辅助诊断子宫内膜癌的血清肿瘤标志物有CEA、CA125、CA199、HE4，但它们的特异性和敏感性不强，诊断效能较差。本发明提供了新的包括7个lncRNA的子宫内膜癌的标记物，可反映UCEC的发生、分化及病情进展情况，在UCEC的诊断、治疗效果监测和预后评估等方面具有重要价值。同时，本发明提供的基于ncRNA的检测方法和试剂盒、芯片等，具有保存稳定，检测方便快捷，避免了有创性操作的优点。
附图说明
图1为UCEC患者组织样本中III-IV期和I-II期患者的子宫内膜组织中LOC100190940的区别表达情况(qRT-PCR)。
图2为组织样本中7个lncRNA(C20orf56、LOC100144604、LOC100190940、LOC151534、LOC727677、FLJ35390、LOC158572)的表达情况(qRT-PCR)。HS:对照组；UCEC：子宫内膜癌组。以GAPDH为内参基因。
图3为7个lncRNA(C20orf56、LOC100144604、LOC100190940、LOC151534、LOC727677、FLJ35390、LOC158572)独立或组合用于检测子宫内膜瘤的ROC曲线。
图4为从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库中收集到的RNA表达谱中筛选出的子宫内膜瘤样本中发现的与正常组织相比有差异表达lncRNA的热图。
图5为从TCGA数据库中收集到的RNA表达谱中筛选出的子宫内膜瘤样本中发现的与正常组织相比有差异表达lncRNA的火山图。蓝色的图表示基因的下调，红色区域表示上调的基因，中间的灰色区域表示亚差异基因。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的实质内容和有益效果，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。
实施例1病人和样品
收集在云南省肿瘤医院妇科经病理确诊为子宫内膜癌(UCEC)患者的组织为研究对象，非UCEC患者的相对正常的子宫内膜为对照组。所有病例均为首次发病，术前未进行过任何治疗，未合并其他恶性肿瘤病史，标本均经病理诊断证实。本实验标本的收集、使用均通过患者和家属签字确认同意和云南省肿瘤医院伦理审查委员会批准。
子宫内膜癌组：38例，其中子宫内膜样腺癌37例，子宫内膜低级别间质瘤1例。按2009年国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，FIGO)分期：I期患者26例、Ⅱ期患者6例，Ⅲ期患者共4例，IV期患者2例。所有子宫内膜癌患者术前均未接受过激素治疗、放疗及化疗。患者年龄为29～73岁之间，中位年龄53岁。
其中，FIGO 2009子宫内膜癌分期标准为：
I期：肿瘤局限于子宫体
IA肿瘤浸润深度<1/2肌层
IB肿瘤浸润深度≤1/2肌层
II期肿瘤侵犯宫颈间质但无宫体外蔓延
III期肿瘤局部和(或)区域的扩散
IIIA肿瘤侵犯浆膜层和(或)附件
III B***和(或)宫旁受累
IIIC盆腔和(或)腹主动脉***转移
IV期肿瘤侵及膀胱和(或)直肠黏膜，和(或远处转移)
IVA肿瘤侵犯膀胱和(或)直肠黏膜
IVB远处转移。包括腹腔内***转移，和(或)腹股沟***转移。
非UCEC患者相对正常的子宫内膜对照组：10例，年龄16～82岁之间，中位年龄48岁。选取的患者都有详细的临床相关资料。
纳入标准：(1)首次就诊，原发性子宫内膜癌行手术治疗的患者，最终经病理确诊，排除同时患有其他恶性肿瘤的患者；(2)患者术前均未进行放疗、化疗及激素治疗等；(3)子宫正常对照组织标本取自卵巢癌或***行子宫切除患者的子宫内膜，经病理确证没有肿瘤组织。
排除标准：(1)临床资料不全者；(2)合并其他部位恶性肿瘤；(3)子宫内膜肿瘤为非原发部位的肿瘤；(4)患有影响检测结果的疾病；(5)入院前进行过化疗、放疗或其他干预性治疗的患者。
实施例2研究方法和试剂
样本的收集
术中取切除的子宫内膜组织放入装有RNAlater Sollution组织保存液的冷冻管中，所有标本均在离体30分钟内置于-70℃冰箱内保存。
组织中总RNA的提取
1)剪取20mg组织标本，放入液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织至粉末状，然后向粉末中加入适量的RNA提取试剂RNAex并混匀。将上述混合液转移至离心管中，室温静置5分钟，12,000rpm 4℃离心5分钟。小心吸取上清液，移入新的离心管中，再进行后续的RNA提取操作。
2)向上述裂解液中加入RNAex体积量1/5氯仿，充分混合。室温静置5分钟，12000rpm 4℃离心15分钟。吸取上清液转移至另一新的离心管中。
3)上清液中加入1/2倍RNAex体积的异丙醇变性沉淀RNA，充分混匀，室温下静置10分钟。4℃12000rpm离心8分钟后吸弃上清液留取管底的透明的胶状沉淀。
4)向离心管中加入与RNAex等体积的80％乙醇(-20℃预冷)，清洗RNA沉淀及离心管管壁，7500rpm 4℃离心5分钟，小心弃去上清。
5)干燥沉淀，向离心管中加入适量的RNA-free水溶解RNA，将溶解后的RNA放入-80℃中保存。
用ND-1000分光光度计检测RNA浓度和纯度。
RNA逆转录为cDNA
使用AG公司的Evo M-MLV反转录试剂盒，引物为逆转录试剂盒中的随机引物，反应体系为20μl。
按表1成分配制反应混合液，按表2扩增程序进行逆转录反应。
表1逆转录反应体系
实时荧光定量PCR
以逆转录生成的cDNA为反应模板,阴性对照组用无酶水代替。把准备好的反应混合液顺序加入到PCR管中，最后加入cDNA，按表3配制反应体系总体积20μl，加样完成的扩增管颠倒混匀，瞬时离心。将PCR管放置于
480仪器上，扩增程序为：1.预变性：95℃预变性30s；2.PCR反应：95℃变性5s，61℃退火30s，此阶段40个循环；3.生成溶解曲线：95℃变性15s，60℃退火1m，95℃加热15s。
表3实时定量扩增反应体系
在规格为96孔的PCR板中按编号顺序上样，每个孔中依次加入以上试剂，每个样本重复3个孔，把加好样本的PCR板放入
480仪器中进行扩增，按表4的实时定量扩增程序进行。
表4实时定量扩增程序
qRT-PCR扩增反应结束后，收集实验原始数据。采用△△Ct法计算结果，分别计算子宫内膜癌组织组和子宫内膜对照组织组目的基因的Ct值与内参基因的Ct值的差值，即ΔCt(癌)和ΔCt(对照)，以-ΔCt为目的基因在癌组织和正常对照组织中的相对表达水平；将ΔCt(癌)和ΔCt(对照)相减，得到ΔΔCt，最后取其负对数2-ΔΔCt。其值作为目的基因的相对差异表达倍数。通常认为其值＞2或者＜0.5表示癌组织组相对于对照组织组来说，基因表达上调或者下调。
表5引物序列及扩增片段长度
统计分析方法
使用R Studio(R版本3.4.1)和GraphPad Prism 6.0、SPSS 19.0统计软件包，使用edgeR来识别差异表达显著的lncRNA。采用SPSS 19.0统计软件包和Graphpad 6.0对子宫内膜癌实验组、子宫内膜对照组7个关键lncRNAs基因相对表达量和实时荧光定量PCR结果进行描述，若符合正态分布，则选用配对t检验；若不符合正态分布，则用非参数检验的秩和检验(Mann-Whitney U检验)，以上均以P<0.05认为具有统计学差异。
实施例3LOC100144604在子宫内膜癌患者中的表达显著升高，并且在III-IV期患者中较I-II期患者中的表达显著升高
发明人出乎意料地在对子宫内膜癌患者的miRNA和lncRNA的研究中发现其中一种lncRNA，即LOC100144604在患者中出现显著升高，并且在子宫内膜癌不同时期的样品中有显著区别。由此，发明人进一步对更多患者进行了研究。
根据实施例2记载的实验和统计分析方法，对来自子宫内膜癌组的38例患者和10个非子宫内膜癌组患者的子宫内膜组织样品中表达的LOC100144604进行了实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析。
结果发现，LOC100190940在子宫内膜癌组的平均表达量是对照组的平均表达量的8.486倍，明显上调，具有统计学意义(P＝0.0382)。
同时，发现在临床分期中，III-IV期UCEC患者(32例)子宫内膜组织中LOC100190940的表达量较I-II期患者(6例)的LOC100190940显著升高，差异有统计学意义(P＝0.0137)。参见图1。
实施例4C20orf56在子宫内膜癌患者中的表达显著升高
在对上述子宫内膜癌组的38例患者和10个非子宫内膜癌组患者的其它miRNA和lncRNA的研究中，还发现C20orf56在子宫内膜癌组的平均表达量是对照组的平均表达量的8.88倍，明显上调，具有统计学意义(P＝0.0213)。
实施例5采用ROC分析评估单个或多个lncRNA的组合在子宫内膜癌诊断中的价值
采用受试者特征曲线分析(receiver operating characteristics analysis，ROC analysis)对可用于鉴定子宫内膜癌的单个lncRNA或其组合进行评估。根据在不同阈值的敏感度(真阳性率)和特异性(假阳性率)，ROC分析用于选择可区分子宫内膜癌患者和非子宫内膜癌的单个lncRNA或其组合。
在前述子宫内膜癌组的38例患者和10个非子宫内膜癌组患者进行了miRNA和lncRNA的研究，其中发现7个有明显表达差异的lncRNA(C20orf56、LOC100144604、LOC100190940、LOC151534、LOC727677、FLJ35390、LOC158572)。参见图2。
对上述7个lncRNA进行受试者特征曲线(ROC curve)分析。根据qPCR测量的表达水平绘制受试者特征曲线。结果如图3和下表6所示。
表6 7个lncRNA独立和联合检测的ROC曲线统计结果
结果表明，7个lncRNA(C20orf56、LOC100144604、LOC100190940、LOC151534、LOC727677、FLJ35390、LOC158572)的线下面积(AUC)基本达到和超过0.5。而这7个lncRNA的组合的线下面积(AUC)达到0.941(95％CI：0.875-0.947)，具有更高的对子宫内膜癌的鉴定精度。
实施例6lncRNA在子宫内膜癌中的调控机制
为了更清楚地理解上述7个已发现在子宫内膜癌的临床诊断上发挥作用的lncRNA(C20orf56、LOC100144604、LOC100190940、LOC151534、LOC727677、FLJ35390、LOC158572)在子宫内膜癌的发生或发展过程中的机理，发明人采用生物信息学手段对所述lncRNA可能参与或调控的病理机制进行了分析和研究。
主要分析方法、步骤和结果包括：从癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)数据库中下载子宫内膜癌相关的RNA表达谱，筛选到266个UCEC样本和3个对照样本符合要求，数据包括miRNA、mRNA和lncRNA的原始数据。使用RNASeqV2***处理lncRNA和mRNA的原始数据，microRNA测序原始数据经Illumina HiSeq 2000miRNA seq sequencingplatforms高通量测序软件进行标准化。将以上数据利用R Studio中的数字基因表达数据分析肿瘤组织与正常组织对照之间表达水平的差异，计算FDR、|log2FC|和P值。通过设定的阈值为|log2FC|>1.5，FDR<0.05，P值<0.01，分析筛选出差异表达的miRNA、lncRNA和mRNA，并使用R软件包中的“ggplots”绘制了热图和火山图，以便可视化差异基因分析的结果。其中差异表达的lncRNA的热图见图4，火山图见图5。结果发现，上述7个已发现在子宫内膜癌的临床诊断上发挥作用的lncRNA(C20orf56、LOC100144604、LOC100190940、LOC151534、LOC727677、FLJ35390、LOC158572)均属于在上述采用生物信息学手段发现的在子宫内膜癌样品中与正常组织具有差异表达的lncRNA，且为表达差异较显著的lncRNA。
进一步利用基因本体论(GeneOntology，GO)和京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)数据库来预测所筛选的lncRNA以及与其相关的mRNA基因的生物学功能和所参与的信号通道。通过DAVID数据库(the Database forAnnotation Visualization and Integrated Discovery，https://david.ncifcrf.gov/)对上述筛选的差异表达基因进行GO及KEGG通路分析。在GO数据库中选择人类(human)，得到差异性表达基因的功能列表，计算生物学功能和信号通路的富集分数，设定P<0.05，富集分数>1.5为筛选标准，得到基因的显著性功能。按照同样的筛选标准和方法在KEGG数据库中计算得到差异性基因的显著通路。分析结果显示上述7个已发现在子宫内膜癌的临床诊断上发挥作用的lncRNA(C20orf56、LOC100144604、LOC100190940、LOC151534、LOC727677、FLJ35390、LOC158572)的生物学过程主要富集在癌症相关信号通路，包括“MAPK信号通路”、“癌症中的蛋白多糖”、“钙信号通路”、“P53信号通路”等通路。
结论
本发明第一次提供了可区别和定义发生或子宫内膜癌的lncRNA生物标记物。本发明提供的子宫内膜癌的lncRNA生物标记物为LOC100190940，或为包括两个lncRNA的组合(LOC100190940和C20orf56)，或进一步为包括七个lncRNA的组合(LOC100190940、C20orf56、LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572)。在本发明之前，本发明发现的上述生物标记物中的lncRNA都没有被发现与子宫内膜癌的病理相关。本发明发现的生物标记物可有效和准确地鉴定子宫内膜癌，甚至可用于对子宫内膜癌患者进行分期。本发明由此提供了用于区分和鉴定子宫内膜癌的方法。
肿瘤标志物在肿瘤筛查治疗、病情监测评估、复发转移以及患者预后判断等临床中有着极其重要的运用价值。目前临床用于辅助诊断子宫内膜癌的血清肿瘤标志物有CEA、CA125、CA199、HE4，但特异性和敏感性不强，诊断效能较差。本发明提供了新的包括7个lncRNA的子宫内膜癌的标记物，可反映UCEC的发生、分化及病情进展情况，在UCEC的诊断、治疗效果监测和预后评估等方面具有重要价值。同时，本发明提供的基于ncRNA的检测方法和试剂盒、芯片等，具有保存稳定，检测方便快捷，避免了有创性操作的优点。
上面是对本发明进行的说明，不能将其看成是对本发明进行的限制。除非另外指出，本发明的实践将使用有机化学、聚合物化学、生物技术等的常规技术，显然除在上述说明和实施例中所特别描述之外，还可以别的方式实现本发明。其它在本发明范围内的方面与改进将对本发明所属领域的技术人员显而易见。根据本发明的教导，许多改变和变化是可行的，因此其在本发明的范围之内。
如无特别表示，本文中出现的温度的单位“度”是指摄氏度，即℃。
Claims (10)
1.测量lncRNA的水平的试剂在用于制备诊断子宫内膜癌的试剂盒或装置中的用途，其中所述测量lncRNA的表达水平的试剂用于测量下述lncRNA的表达水平：LOC100190940。
2.权利要求1所述的用途，其中所述lncRNA还包括：C20orf56。
3.权利要求2所述的用途，其中所述lncRNA还包括以下LncRNA：LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572。
4.权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述试剂盒和装置通过下述步骤诊断子宫内膜癌：
a.测量受试者样品中所述lncRNA的水平；
b.比较受试者样品中所述lncRNA的水平与无患病对照中所述LncRNA的表达水平。
5.权利要求1-3中任一项所述的用途，其中测量lncRNA的水平的试剂为对所述LncRNA进行逆转录的试剂和/或对逆转录产物进行扩增或识别的试剂，例如为扩增和识别所述逆转录产物的引物和探针。
6.权利要求1所述的用途，其中所述诊断子宫内膜癌的试剂盒或装置还用于对子宫内膜癌进行分期，例如分为III-IV期或I-II期。
7.诊断子宫内膜癌的试剂盒或装置，其中包含测量下述lncRNA的水平的试剂：LOC100190940，优选的，其中所述lncRNA还包括：C20orf56，更优选的，所述lncRNA还包括以下LncRNA：LOC100144604、LOC151534、LOC727677、FLJ35390和LOC158572。
8.权利要求7的试剂盒或装置，其中包含测量所述lncRNA的水平的试剂，其为对所述LncRNA进行逆转录的试剂和/或对逆转录产物进行扩增或识别的试剂，例如为扩增和识别所述逆转录产物的引物和探针。
9.权利要求7的试剂盒或装置，其中所述诊断子宫内膜癌的试剂盒或装置还用于对子宫内膜癌进行分期，例如分为III-IV期或I-II期。
10.权利要求7的试剂盒或装置，其中所述装置为基因芯片。
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