CN116121245B - 小分子rna及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子RNA，本发明还公开了检测小分子RNA表达水平的试剂在制备子宫内膜异位症诊断试剂中的应用。本发明还公开了一种诊断子宫内膜异位症的试剂盒。本发明的小分子RNA EM‑free RNA‑9不仅具备目前核酸分子用于临床诊断的技术优势，而且稳定性高、显著提高诊断的准确率，提示EM‑free RNA‑9极有可能成为临床疾病早期诊断划时代的新指标，EM‑free RNA‑9的诸多优点可能为临床疾病的新药研制提供依据。
Description
技术领域
本发明属于小分子RNA领域，特别涉及一种小分子RNA片段(EM-free RNA-9)及其在子宫内膜异位症早期诊断中的应用，具体用于制备血清及尿液中检测该EM-free RNA诊断试剂盒。
背景技术
子宫内膜异位症(Endometriosis，简称内异症)是一种常见的妇科疾病，影响了10-15％的育龄期女性，在***症患者中甚至高达40-50％。该病在临床表现上具有恶性肿瘤侵袭转移的能力，易广泛种植于卵巢、腹膜、肠管等靶向器官，引起靶向器官的病变并导致多种临床症状，尤其是痛经，让很多患者痛不欲生，严重影响了患者的生存质量。目前，其诊断的“金标准”是腹腔镜检查和病理证据。但腹腔镜手术是一种有创性的手术，对于期望保守治疗的患者来说并非理想选择。由于该病具有明显的异质性，对它的认识也不足，导致诊断延迟6.7年到11.7年不等，初诊误诊率也高达65％，许多患者到了晚期才得到有效治疗。这种现状增加了患者的经济支出，也加大了临床医生的治疗难度。因此，寻找子宫内膜异位症发病的分子标志物，并开发成早期诊断试剂盒，对于在发病早期、通过液态活检即可精准地诊断内异症，对于患者无疑具有重要的临床意义和社会应用价值。
近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，遗传物质的表达及调控正在不断被阐述。已有研究表明非编码RNAs可在转录水平、转录后水平、表观遗传水平调控基因表达，与疾病的发生发展有着密切关系。更为耀眼的是，近两年随着新冠核酸检测试剂盒及ctDNA检测在临床上的广泛应用，与传统的蛋白或代谢物检测相比较，核酸检测(包括DNA和RNA)在疾病诊断中已经体现出尤为卓越的优势：组织特异性强、灵敏度高、检测方法成熟简便、假阳性率低、可重复性强、普及率高等特点。
大量研究证实，体液中存在大量的核酸片段，包括双链游离cfDNA、小非编码RNA(small non-coding RNA，sncRNA)等，有可能为疾病诊断和预后提供新的生物标志物，并已开展数项临床研究进一步论证核酸片段在疾病诊断中的应用价值。井喷般的证据表明，非编码RNA在多种疾病及肿瘤组织/体液中具有显著差异表达、高稳定性的特征，提示极有可能成为疾病诊断的新指标。但是目前为止，有关非编码RNA与子宫内异症早期诊断的相关研究正在不断发展中。核酸检测设备和使用已非常成熟，在各地级二甲及以上医院或第三方检测机构均可开展基于核酸检测技术的检验项目。因此，我们希望借此机会能够将核酸检测技术用于此类疾病的早期诊断，无疑对提升地区人口质量、减缓社会负担、增加社会效益、发展地区经济具有重要的帮助。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供小分子RNA片段EM-free RNA-9及其在制备子宫内膜异位症诊断靶点上的应用，为临床早期诊断子宫内膜异位症提供参考。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种小分子RNA，所述小分子RNA的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明内容还包括检测所述的小分子RNA的表达水平的试剂或试剂盒。
本发明内容还包括检测所述的小分子RNA的表达水平的试剂在制备子宫内膜异位症诊断试剂或试剂盒中的应用。
其中，所述诊断试剂通过检测被试者血清或尿液中小分子RNA的表达，与健康对照组相比较特异性升高，以此来判断被试者的子宫内膜异位症患病风险。
本发明内容还包括一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒，所述试剂盒包含检测血清或尿液中小分子RNA表达水平的检测试剂，所述小分子RNA的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
其中，所述检测试剂包括逆转录试剂和PCR反应试剂。
其中，所述逆转录反应体系包括5x RT buffer、dNTP mixture、Rnase Inhibitor以及基因特异性反向引物，所述基因特异性反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
其中，所述PCR反应试剂，包括特异性引物对、PCR扩增buffer、DNA聚合酶混合物等，所述特异性引物对序列如SEQ ID NO.9所示和SEQ ID NO.10所示。
本发明的小分子RNA片段来源于子宫内膜异位症，并且以旁分泌的方式释放到病灶微环境中。在前期研究中，分离提取子宫内膜异位症患者在位/异位内膜配对组织及正常对照组内膜组织中的EM-free RNA并进行去修饰预处理后，通过高通量测序技术，发现：
①子宫内异症患者的病变组织(正常vs病变在位内膜vs病变异位内膜，各50例，在位内膜和异位内膜是同一患者配对组织样本)具有独特的RNA表达谱。
②通过qRT-PCR实验验证发现，EM-free RNA-9在患者血液和尿液中的表达水平与对照(健康对照人群或其它类型妇科疾病病例)相比均显著高表达，与组织中的趋势高度一致。
③技术改进：提取RNA后，通过凝胶电泳截取小分子RNA并去修饰后，EM-free RNA-9检测灵敏度提高了64倍；
④同时，通过小RNA富集纯化联合核酸质谱检测发现血清或尿液中的EM-freeRNA-9修饰图谱和组织中的修饰图谱一致，高度提示血清或尿液中EM-free RNA-9可能来源于子宫内膜组织。
⑤在相同纳排标准下，我们分别检测EM-free RNA-9在卵巢癌、子宫肌瘤、子宫肌腺症等患者血清/尿液中的表达水平。结果显示EM-free RNA-9在子宫内膜异位症患者血清/尿液中特异性升高。
因此，EM-free RNA-9极有可能是子宫内膜异位组织分泌到体液中、并且是液态活检的分子标志物。
本发明的新用途：可基于EM-free RNA-9为靶点，制备诊断子宫内膜异位症的试剂盒。
有益效果：EM-free RNA-9不仅具备目前核酸分子用于临床诊断的技术优势，而且由于其具有一定的茎环结构，在体内的存在比其他小分子RNA更稳定，能显著提高诊断的准确率，提示EM-free RNA-9极有可能成为临床疾病早期诊断划时代的新指标，EM-free RNA-9的诸多优点可能为临床疾病的新药研制提供依据。
附图说明
图1是实施例差异性分泌EM-free RNAs在组织及血液标本中验证结果。
图2是实施例验证EM-free RNA-9在组织中表达情况。
图3是实施例线性化及去修饰化的EM-free RNA-9在组织中表达检测情况。
图4是实施例血清及尿液中EM-free RNA-9的表达情况。
图5是实施例EM-free RNA-9在多种病种血液、尿液中的表达。
图6是实施例EM-free RNA-9与CA125、年龄、BMI等临床指标在内异症中受试者工作。特征(ROC)曲线。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。
需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、***、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
实施例1
收集的临床样本主要来源于接受手术治疗的女性患者(表1)。分别收集子宫内膜异位症患者的在位组织及异位组织和年龄匹配的非内异症患者的内膜组织样本5例。
表1：临床样本基本信息
| 子宫内膜异位症(n＝5) | 对照组(n＝5) | ||
| 年龄 | 34.5±5.5 | 32.5±8.5 | p＞0.05 |
| BMI | 23.4±1.2 | 23.1±4.1 | p＞0.05 |
表1：两组患者的年龄和BMI指数均无统计学差异(p＞0.05)
采用高通量测序技术随机筛选5对内异症异位内膜、在位内膜ESC细胞中的差异EM-free RNAs(变化倍数＞2倍即Fold_Change(FC)＞2或<0.5，p＜0.05)。结果发现：相对于在位内膜ESC细胞，异位内膜ESC细胞中差异高表达的EM-free RNA有8条(EM-free RNA-6，7，9，10，14，18，19，22)，低表达的有15条(EM-free RNA-1，2，3，4，5，8，11，12，13，15，16，17，20，21，23)(表2)。
表2.差异性游离RNA(FC＞2或＜0.5，p＜0.05)
实施例2定量PCR检测
针对实施例1的测序结果，挑选adjust p值(即q value)<0.1，且Length≥17的12条EM-free RNA(与在位内膜ESC细胞相比，异位内膜ESC细胞中5条表达升高(EM-free RNA-6，9，10，14，19)、7条表达降低(EM-free RNA-1，2，3，4，17，20，21))在临床样本中验证这它们的表达规律。在正常子宫内膜、内异症在位内膜及异位内膜样本中(各30例)，而从定量PCR结果显示：与正常内膜组织相比，3条EM-free RNA(EM-free RNA-9、EM-free RNA-10、EM-free RNA-19)在异位子宫内膜组织中表达上调，1条EM-free RNA表达下调(EM-freeRNA-1)，与测序结果基本一致(图1A)。为进一步评价这些差异表达的EM-free RNA与内异症的相关性，我们在这30例血液样本中，采用Real-time PCR再次验证这4条EM-free RNA的表达水平(图1B)，结果显示其中仅一条EM-free RNA(EM-free RNA-9)呈现出在异位症子宫内膜组织及血液中均显著高表达、在对照组正常内膜组织及血液中低表达的特殊性。
具体实验步骤如下：
步骤1：收集人血清、尿液样本；步骤2：使用Trizol试剂提取人血清、尿液总RNA；步骤3：通过RNA逆转录反应得到cDNA，逆转录试剂为riboSCRIPTTM Reverse TranscriptionKit；步骤4：用特异性EM-free RNA核糖核酸设计引物向PCR体系中加入荧光染料SYBRGreen利用荧光定量PCR仪进行定量PCR反应，PCR反应试剂为针对SEQ ID NO.1～4所示序列设计的ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme，Nanjing，China，货号：Q311-02)试剂盒。步骤3中的逆转录的反应体系包括2μl 5x RT buffer、2μl 10mM每种dNTP mixture、0.5μlRnase Inhibitor以及1.5μl基因特异性反向引物，所述基因特异性反向引物分别如SEQID NO.5、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.14所示；反应步骤为42℃孵育60分钟，70℃孵育10分钟，4℃保存。步骤4的利用荧光定量PCR仪进行定量PCR反应的反应体系为：SYBRGreen 5μl，上下游引物(SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示)各2pmol，cDNA1μl，加DEPC水配平至10μl。反应条件为95℃5分钟进行1个循环→95℃10秒，60℃30秒进行45个循环。
具体的引物序列如下：
EM-free RNA-1：
CCTCCATCACCAGTACCA SEQ ID NO：1
RT引物：
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATGGTACTGGTGATGGAGSEQ ID NO：5
上游引物：TCGGCAGGCCTCCATCACCA SEQ ID NO：6
下游引物：CCACGACACGCACTGGATACGAC SEQ ID NO：7
EM-free RNA-9：
TTCTGTTTAATTAGGACGGCAA SEQ ID NO：2
RT引物：
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACATTGCCGTCCTAATTAAACSEQ ID NO：8
上游引物：TCGGCAGGTTCTGTTTAATTA SEQ ID NO：9
下游引物：CCACGACACGCACTGGATACGAC SEQ ID NO：10
EM-free RNA-10：
TCCGACATGGTCTAGCCGTTAGGATTCCTGGTT SEQ ID NO：3
RT引物：
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAAACCAGGAATCCTAACGGCTAG SEQ ID NO：11
上游引物：TCGGCAGGTCCGACATGGTCTAGCCGTT SEQ ID NO：12
下游引物：CCACGACACGCACTGGATACGAC SEQ ID NO：13
EM-free RNA-19：
GCGCAGCTGGTGTAGTGGTGTCATGCAAGAT SEQ ID NO：4
RT引物：
GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAATCTTGCATGACACCACTASEQ ID NO：14
上游引物：TCGGCAGGGCGCAGCTGGTGTAGTGG SEQ ID NO：15
下游引物：CCACGACACGCACTGGATACGAC SEQ ID NO：16
实施例3扩大样本量，qRT-PCR检测样本内EM-free RNA-9的相对表达水平
扩大临床样本收集子宫内膜异位症患者的在位组织及异位组织和年龄匹配的非内异症患者的内膜组织、血液及尿液样本各50例(如表3)。明确EM-free RNA-9在正常人群中的检测基线。
表3：扩大临床样本的基本信息
BMI：身体质量指数，AFS：美国生育协会腹腔镜诊断内异症评分***
通过qRT-PCR实验验证发现，EM-free RNA-9在患者组织的表达水平与对照(健康对照人群或其它类型妇科疾病病例)相比均显著高表达，且呈现出在对照组织、患者在位内膜、患者异位内膜中梯度升高的特性(图2)。检测前处理样本：使用Trizol试剂分别提取患者或健康对照的组织总RNA，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，切取15-50nt区段凝胶，后再使用0.3M NaCl、无水乙醇、3M醋酸钠以5mg/ml的糖原将RNA从凝胶中沉淀出来，再加入AlkB(核酸脱甲基化酶，MedChemExpress(MCE))1μg，37℃孵育半小时，最后使用Trizol试剂重新提取RNA，所得产物用于qRT-PCR检测样本内EM-free RNA-9的相对表达水平。结果显示：去修饰的EM-free RNA-9在正常子宫内膜、内异症在位内膜及异位内膜样本中(各50例)，定量PCR与前期验证结果基本一致(图3)。
实施例4 qRT-PCR分别在血清、尿液中检测EM-free RNA-9的表达情况
利用qRT-PCR分别在血清、尿液中检测EM-free RNA-9的表达情况，结果提示：EM-free RNA-9在子宫内膜异位症患者的血清及尿液中较对照组明显升高(图4)。在相同纳排标准下，我们分别检测EM-free RNA-9在卵巢癌、子宫肌瘤、子宫肌腺症等患者血清/尿液中的表达水平。结果显示：EM-free RNA-9在子宫内膜异位症患者血清/尿液中特异性升高(图5)。比较EM-free RNA-9与CA125、年龄、BMI等临床指标在内异症中诊断价值：EM-free RNA-9、CA125、年龄、BMI等AUC分别0.8766(P＜0.01)、0.7842(P＜0.01)、0.5722、0.6848，提示EM-free RNA-9在子宫内膜异位症中具有良好的诊断价值(图6)。
结论：EM-free RNA-9可稳定且特异性表达于子宫内膜异位症患者的多种体液中，可能为子宫内膜异位症的早期诊断提供新的思路和有效的检测方法。
Claims (7)
1.一种小分子RNA，其特征在于，所述小分子RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.检测权利要求1所述的小分子RNA的表达水平的试剂在制备子宫内膜异位症诊断试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述诊断试剂通过检测被试者血清或尿液中小分子RNA的表达，与健康对照组相比较特异性升高，以此来判断被试者的子宫内膜异位症患病风险。
4.一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含检测血清或尿液中小分子RNA表达水平的检测试剂，所述小分子RNA的核酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求4所述的用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒，其特征在于，所述检测试剂包括逆转录试剂和PCR反应试剂。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应体系包括5x RTbuffer、dNTP mixture、Rnase Inhibitor以及基因特异性反向引物，所述基因特异性反向引物序列如SEQ ID NO.8所示。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应试剂包括特异性引物对、PCR扩增buffer、DNA聚合酶混合物，所述特异性引物对序列如SEQ ID NO.9所示和SEQ IDNO.10所示。
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