CN109371134B

CN109371134B - 一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒

Info

Publication number: CN109371134B
Application number: CN201811488969.2A
Authority: CN
Inventors: 谭焕然; 郭红燕; 牛刚; 张坤
Original assignee: Beijing Niuniu Gene Technology Co ltd; Peking University; Peking University Third Hospital
Current assignee: Beijing Niuniu Gene Technology Co ltd; Peking University; Peking University Third Hospital
Priority date: 2018-12-06
Filing date: 2018-12-06
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2038-12-06
Also published as: CN109371134A

Abstract

本发明提供一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒，包括结合有子宫内膜癌抗体的磁珠及相应缓冲试剂，该试剂盒采用磁珠分选，逆转录‑多重PCR等分子生物学的方法检测子宫内膜癌患者血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，确定药物治疗靶点的基因，通过检测PAX8、ER和P53的表达水平，确定子宫内膜癌的发展及转归，对子宫内膜癌的个体化治疗提供理论依据和实验证据。本发明提供的试剂盒检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，检出率可达61.2％。

Description

一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种子宫内膜癌检测试剂盒，具体涉及一种准确性高的检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒。

背景技术

子宫内膜癌(endometrial carcinoma，EC)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤，来源于子宫内膜腺体的腺癌最常见，为女性生殖道三大恶性肿瘤之一，占女性全身恶性肿瘤7％，占女性生殖道恶性肿瘤的20％-30％。据统计，从2007年到2011年，子宫内膜癌的发病率每年增加了2.4％，死亡率每年增加了1.9％，5年期和10年期相对存活率是分别是82％和79％。

1.子宫内膜癌临床诊疗现状及影响预后的相关因素

1.1不同病理类型的子宫内膜癌，预后存在明显差别。

Bokhman提出的子宫内膜癌的二元模型现在已经被广泛接受：I型子宫内膜癌多发生于处于绝经期或绝经前期的女性，并多有暴露于无拮抗的内源性或外源性雌激素的病史，与女性***过多症有明显的相关性，如肥胖、无卵性的子宫出血、 ***症、***、绝经后期和子宫内膜增生，是最常见的类型的子宫内膜癌，可达80％-85％，多为子宫内膜样腺癌，肿瘤分化程度较好，恶性程度一般较低，对孕激素类药物敏感，预后较好，5年生存率约为74％。Ⅱ型子宫内膜癌，是非雌激素依赖型，多发生于萎缩的子宫内膜中，形态学表现为低分化癌，多为浆液性乳头状廇、透明细胞癌等少见肿瘤，该类型肿瘤属高度恶性肿瘤，已发生深肌层浸润，预后比较差，5年的生存率在27％-42％。

1.2子宫内膜癌临床期别不同，预后明显不同。

子宫内膜癌病人大多因有绝经后***流血、不规则***流血等症状到医院就诊，通过诊断性***术、子宫内膜活检可早期确诊得到及时的治疗。FIGO临床分期也是关于内膜癌的相关研究的标准参照之一。大多数的女性子宫内膜癌在早期诊断和手术可以治愈或没有辅助放疗，再结合手术方式改进，优化术后辅助治疗方案等，子宫内膜癌患者治疗生存率明显提高。子宫内膜癌术后的复发或转移是影响患者生存率的重要因素，也是导致死亡的重要原因。而对于疾病判定，其组织学分化越差，肌层浸润越深，盆腔***转移率越高，其预后就越差。研究表明高、中、低分化的5年生存率分别为94％、84％、72％。IA期高分化的患者，其5年生存率甚至可达到100％；而IB-IV期、高分化患者的生存率为67％；IB-IV期、低分化患者的生存率仅为26％，临床分期、肿瘤分化程度都是和子宫内膜癌预后相关的因素。但也有一些早期的子宫内膜癌会发生局部复发和远处转移，严重影响患者的生活质量，更是需要重视的问题之一。

1.3子宫内膜癌治疗有规范的指南，但早期子宫内膜癌的辅助治疗并不统一确定。

关于子宫内膜癌的治疗，目前国内外均采用的NCCN(National ComprehensiveCancer Network，美国国立综合癌症网络，简称NCCN)推荐的指南，在其官方网站(www.nccn.org)会有定期更新，以方便临床使用，国内学者也会对NCCN指南进行相应的解读。在NCCN指南中，对于手术病理分期手术后的患者，是否添加辅助治疗方面，有些推荐，但并没有非常明确的指针界定，比如对于临床手术病理分期为FIGO IA、FIGO IB期的子宫内膜癌，根据其有无高危因素、病理分级(G1、 G2、G3)不同，给予的治疗推荐为观察、腔内放疗、外照射、全身化疗等，或者联合添加不同辅助治疗方法，而是否添加的选择依据，并无客观循证医学证据，也未提供明确推荐方案。

大多数子宫内膜癌会在早期即出现***出血、排液等症状，比较易于早期发现，临床中早期的子宫内膜癌占比最高，治疗以标准的子宫内膜癌分期手术治疗为主， NCCN有详细的手术相关说明，也是临床治疗参照的主要依据。但关于手术后的治疗，根据有无高危因素，如低分化子宫内膜样癌、有***瘤栓、高危组织类型 (透明细胞癌、浆液性***状腺癌及腺鳞癌)等决定添加后续的放疗、化疗、激素等辅助治疗。

但对于尤其是早期子宫内膜癌的辅助治疗添加与否、如何添加等方面，没有达成广泛的共识，临床选择术后辅助治疗方案也存在比较大的争议，在临床应用实践中，规范的手术病理分期后的辅助治疗添加与否，部分取决于主管医师的临床经验和主观选择，而临床早期、不伴有高危因素的患者，复发依然是影响远期预后的主要原因。这些都是临床诊治中的难以决策和达成统一共识的地方，有待进一步验证诊疗方案、积累临床经验、循证医学证据，并最终达成共识。探索辅助治疗添加的依据、评估临床预后，也是目前有待解决的问题之一。

1.3近年我院复发性子宫内膜癌病例临床特点

复发性子宫内膜癌一般资料

收集2006年1月～2016年12月确诊为子宫内膜癌，接受标准子宫内膜癌分期手术，临床资料完整，随访肿瘤复发，接受再次手术或穿刺病理证实的病例22例。

首次确诊子宫内膜癌的中位年龄为52岁(44～63岁)。临床症状有：绝经后 ***出血12例(54.5％)，***排液2例(9.1％)，非月经期***不规则出血4例 (18.2％)，

宫腔积脓/液1例(4.5％)，下腹痛2例(9.1％)，无症状体检超声发现1例(4.5％)。***超声提示宫腔内异常回声21例(95.5％)，子宫腔内存在异常血流信号12例 (54.5％)。12例接受盆腔增强MRI检查，均提示宫腔内异常，其中8例患者提示子宫内膜结合带显示不清。术前均行子宫内膜病理检查，诊断为子宫内膜癌。术前临床分期FIGO I期18例(81.2％)，II期4例(18.2％)。合并高血压病者12例 (54.5％)，合并糖尿病者8例(36.4％)。

首次治疗情况

均接受子宫内膜癌确定分期手术，全子宫+双附件切除+盆腔***切除+腹主动脉旁***切除术，术前诊刮子宫内膜病理或手术中冰冻病理证实为II型子宫内膜癌术中同时切除大网膜。

I型子宫内膜癌18例(81.8％：高分化12例，中分化5例，低分化1例)，II 型

子宫内膜癌中4例(18.2％：浆液性腺癌3例，透明细胞癌1例)；肌层浸润 <1/2 14例(63.6％)，肌层浸润>1/2 7例(31.8％)，肌层浸润达浆膜层1例(4.5％)； ***阳性4例(18.2％)，均为盆腔***，腹主动脉旁***均阴性。临床病理分期(FIGO 2009)IA期12例(54.5％)，IB期5例(22.7％)，II期1例(4.5％)， IIIC1期4例(18.2％)。

按照NCCN指南，根据临床病理分期以及是否存在高危因素，决定是否添加辅助治疗。未接受任何辅助治疗12例(54.5％)，术后补充化疗4例(18.2％)，腔内放疗2例(9.1％)，盆腔外放疗2例(9.1％)，孕激素治疗2例(9.1％)。

复发的诊断标准、复发时间、复发部位

复发患者均接受再次手术或局部病灶穿刺活检，经病理证实为子宫内膜癌复发。

第一次手术后到复发的确诊时间中位数4年(1.5～7年)，盆腔内复发14例(63.6％)，其中12例主要位于***断端区域，2例位于膀胱后方左侧；腹膜后髂血管周围***复发6例(27.3％)；前腹壁腹膜外转移合并肺转移1例(4.5％)；肺部转移1例(4.5％)。

其中两例肺转移者均为FIGO IA期患者，伴有浅肌层浸润，高-中分化，可见不伴有复发高危因素的早期内膜癌，亦发生复发、远处转移。

1.4无高危因素的早期内膜癌也存在复发、远处转移

早期的子宫内膜癌患者，即便没有高危因素，如低分化子宫内膜样癌、有淋巴管瘤栓、高危组织类型(透明细胞癌、浆液性***状腺癌及腺鳞癌)、深肌层浸润、宫颈受累等情况，术后仍有一定的复发率，包含有肿瘤的远处转移，常见的部位为肺。子宫内膜癌复发患者，尤其是早期内膜癌复发者，并非局限于盆腔局部复发，还存在有远处复发的病例报道，比如肝、肺、骨等[15]，我院亦有早期非高危子宫内膜癌患者发生肺转移、腹壁转移的病例。究其复发的因素，是否存在其他的因素，有待进一步的研究。

1.5循环肿瘤细胞概述及其检测方法

1.5.1循环肿瘤细胞概述

循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，简称CTC)是指原发肿瘤或转移灶脱落入血的肿瘤细胞，第一次被提出是在1869年，部分入血的CTC可能具备了在组织支持的微环境中克隆生长形成转移灶的能力，因此CTC数目和分子特征可以作为一种实时无创的实时“液体活检”手段提供关于预后、治疗选择及有效性等临床信息。研究表明了CTC在恶性肿瘤中的存在及其临床意义，提示CTC是预后不良的独立预测因素，CTC检测阳性患者的无进展生存期和总生存期明显短于CTC检测阴性的患者，而有效的细胞减灭术或放化疗后CTC数目下降，说明CTC可以辅助检测治疗效果从而对进一步的治疗做出指导。

1.5.2循环肿瘤细胞富集方法

目前富集CTC方法主要包括两方面，一是根据CTC的生物学特征如蛋白标记物的表达来阳性或阴性筛选，比如可根据其抗上皮的标记物或抗间质标记物或两者一起进行阳性筛选，或者根据抗CD45来消除不需要的淋巴细胞等来进行阴性筛选；另一方面是根据CTC的物理学特征，如大小、密度、电荷、变形性等来阳性或阴性富集，如基于密度的密度梯度离心法(Ficoll density gradient)，基于细胞大小的CTC-chip等，每种方法都有其优势和限制性。

1.5.3子宫内膜癌循环肿瘤细胞相关研究

CTC可以作为预测肿瘤进展和生存率标记物，并且因早期患者体内也可被检测到所以也可作为肿瘤早期诊断的标记物，高CTCs数目与侵袭性疾病、转移增加、复发时间减少相关[21]。Bogani对于28位高危型子宫内膜癌患者进行CTC相关研究，发现CTC阳性率7％，CTC细胞数与肌层浸润和***阳性相关。而应用CK19、 CK20进行CTC的检测，研究内膜癌术前患者的阳性率为10％-35％[23]，在Klein的研究中还发现CTC在内膜癌高危、低危组的阳性率分别为53％、50％，复发患者为 100％，而阴性对照组未检出，在体外异种移植模型的实验中发现CTC可形成转移灶[25]，CTC逐步被应用为非侵袭性的实时诊断、预后、化疗治疗效果或耐药等的检测方法，评估肿瘤异质性的工具。

对于子宫内膜癌患者，是否在肿瘤早期便存在血行转移的高危因素，比如外周血CTC临床特征和CTC是否存在相关性？便是我们实施本研究的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以准确检测子宫内膜癌标志物的试剂盒，主要是指一种通过采集子宫内膜癌患者外周血液中的子宫内膜癌细胞的检测试剂盒及复合的检测技术，具体地说是一种准确性高的检测子宫内膜癌细胞(恶性肿瘤细胞)的检测技术和试剂盒，特别是能够检测经过放、化疗治疗后残存在血液中的游离子宫内膜癌细胞的检测试剂盒，该检测结果对子宫内膜癌治疗方案的选择和预后具有重要指导意义。

本发明的发明思路为：采用磁珠分离，逆转录-多重PCR等分子生物学的方法检测子宫内膜癌患者血液循环中的肿瘤细胞的生物学活性，通过检测 PAX8、ER和P53的表达水平，确定子宫内膜癌的发展及转归，对子宫内膜癌的个体化治疗提供理论依据和实验证据。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明提供一种检测外周血中子宫内膜癌标志物的试剂盒，所述试剂盒由如下组分组成：

结合有子宫内膜癌抗体的磁珠：

结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；

缓冲液A；100-200mL

缓冲液B：100-200mL；

裂解/结合缓冲液 150-250mL；

10×缓冲液 4.0-5.0mL；

dNTPs，5mM each 4.0-5.0mL

逆转录酶，10000U/μL 2.0-3.0mL

RNA酶抑制剂，40U/μL 0.4-0.6mL

2×多重PCR混合液 2-3mL

RNase-free水 1-2mL；

子宫内膜癌肿瘤标志物引物10μmol/L 3.0-5.0mL；

其中所述子宫内膜癌肿瘤标志物为EpCAM、MUC1、CK20中的一种或多种；

所述ER引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：1所示：TTGCTATGTTACTAAGCGTGAG；

下游引物如SEQ ID NO：2所示：GGTGCTATAATAAACCCTTGAC；

所述PAX8引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：3所示：GAAGCAATAGCCGAGGAA；

下游引物如SEQ ID NO：4所示：TGTAGAAAGAGCCAAGCAAA；

所述P53引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：5所示：ACCTATGGAAACTACTTCCTGAAA；

下游引物如SEQ ID NO：6所示：ACCATCGCTATCTGAGCAGC；

所述子宫内膜癌抗体为抗EpCAM单克隆抗体、抗MUC1单克隆抗体和抗 CK20单克隆抗体。

其中，所述2×多重PCR混合液中包含HotStarTaq DNA Polymerase 5U/μL。

其中，所述缓冲液A的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA；0.1％LiDS。

其中，所述缓冲液B的配方为：10mM Tris-HCl,pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA。

其中，所述裂解/结合缓冲液配方：100mM Tris-HCl,pH7.5；500mM LiCl； 10mMEDTA，pH8；1％LiDS；5mM dithiothreitol。

本发明中用于富集循环血中子宫内膜癌细胞的肿瘤标志物为EpCAM、 CK20；而鉴定子宫内膜癌的标志物为EpCAM、KRT19和MUC16。

引物配制：

引物为每个先稀释至10μM(即10μmol/L)，然后将引物混合加水至每个引物浓度为2μM，多重PCR反应体系中每个引物终浓度为0.2μM。

使用时每1mL血液使用25μL抗体标记后的磁珠。

反应结果分析：

采用Agilent 2100生物分析仪对PCR产物物进行分析：

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种检测外周血中子宫内膜癌标志物的试剂盒，该试剂盒要求的检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，对癌细胞的检出量可低至2 细胞水平，即样品中含有2个游离癌细胞即可检出，并且可根据子宫内膜癌肿瘤标志物的含量确定检出为子宫内膜癌细胞还是子宫内膜癌干细胞，检出率可达80％，对子宫内膜癌患者治疗后是否复发及复发的个性化治疗提供理论依据和实验证据。

附图说明

图1为本发明所提供试剂盒的有效性检测结果图。

图2和图3为本发明提供的试剂盒中PAX8、ER和P53在胰腺癌患者CTC 中的表达结果。

具体实施方式

本发明中所用材料与仪器：

材料

1.人子宫内膜癌细胞系RL95-2购买自中国科学院细胞库。

2.用于结合抗体的磁珠为

M-450 Tosylactivated购买自美国invitrogen公司。

3.用于结合寡核苷酸的磁珠为

Oligo(dT)25购买自美国invitrogen公司。

4.抗EpCAM单克隆抗体、抗MUC1单克隆抗体和抗CK20单克隆抗体三种单克隆抗体均购买自美国abcam公司。

5.10×缓冲液：为美国QIAGEN公司的Sensiscript Reverse Transcriptase反应缓冲液(10x Buffer RT)。

6.dNTPs、逆转录酶、RNA酶抑制剂购买自美国QIAGEN公司。

7.引物合成由北京奥科公司完成。

8.安捷伦2100生物分析仪。

9.试管旋转混合器。

试剂：

1.磷酸平衡盐溶液(PBS，pH7.4)

2.磁珠分选相关试剂

5.mRNA磁珠富集相关试剂

实施例1：结合子宫内膜癌抗体的磁珠的制备：

用量：大约每25μL(1×10⁷)Dynabeads标记5ug抗体

下面为结合1mL(4×10⁸)Dynabeads的步骤：

1.将1mL液体重悬的磁珠

M-450Tosylactivated到EP管中；

2.将此EP管放在磁珠富集器上1min，弃掉上清，将EP管从磁珠富集器上取下来；

3.用buffer1重悬磁珠，然后放置在磁珠富集器上1min，弃掉上清，反复三次，最后重悬于buffer1中；

4.将200μL的抗体加入到1mL buffer1重悬的磁珠中；

5.37℃轻度倾斜旋转孵育16-24小时；

6.将EP管放在磁珠富集器上1min，弃掉上清；

7.在2-8℃用1mL buffer2清洗5min，放在在磁珠富集器上1min，弃掉上清，重复3遍；

8.将磁珠重悬于1mL buffer2；

9.加入2％的NaN₃ 10μL，这是防止滋生细菌。

使用的抗体为抗EpCAM单克隆抗体、MUC1单克隆抗体和抗CK20单克隆抗体，分别标记上述3种抗体后将上述3种已经标记的磁珠等量混合使用。

实施例2：子宫内膜癌细胞的分离：

2.1样品处理：

取子宫内膜癌首次发病或复发患者外周血5mL，EDTA抗凝，4℃保存， 48小时之内使用。

2.2磁珠处理：

将结合有子宫内膜癌抗体的磁珠(抗体标记磁珠，为标记三种抗体的混合磁珠，且按1mL样本加25μL磁珠的比例准备抗体标记磁珠)用buffer2反复清洗三次，分离出磁珠，冰上备用；

具体操作为：吸取125μL标记好抗体的磁珠加入1.5mL的离心管中，用移液器轻轻的吹吸混匀(注意不能使用混旋仪)后放在磁珠富集器上静置1min，使磁珠贴附到离心管壁上，移去上清；然后加入200μL buffer2，重悬混匀磁珠，放在磁珠富集器上1min，使磁珠贴附到离心管壁上，弃去上清；采用相同方法使用buffer2共清洗3次；最后移去上清后加入200μL buffer2，冰上备用。

后续步骤磁珠分离也均使用磁珠富集器进行分离。

2.3子宫内膜癌细胞的分选：

将外周血样品和抗体标记磁珠均加入15mL锥形离心管(反应管)中，将反应管放在4℃的试管旋转混合器上，以10rpm的速度孵育30min，孵育后将反应管置于磁珠富集器上(注意将盖子上面的血液也收集到管子中)，静置5min；然后使用巴氏吸管或10ml移液管完全移去血液，请勿碰触磁珠；分离磁珠，弃去上清；加入5ml buffer2，盖上管盖，上下颠倒洗涤(请勿用移液器直接吹吸)，最后将管盖上残留的液体也加入到管子中；将反应管置于磁珠富集器上，静置 1min，弃净上清；重复上述步骤三次(总共四次洗涤)，后三次洗涤液加入体积分别为3ml、1ml和1ml；将反应管取下，加入200μl的裂解液，注意冲刷下贴壁的磁珠，反复吹吸至少五次，并置于磁珠富集器上，静置1min；将裂解上清液吸入到一个新的1.5ml管中，置于冰上备用(裂解上清液或储存于-80℃，储存时间不能超过2周)。

实施例3：子宫内膜癌细胞标记物的检测：

3.1磁珠提取mRNA

使用移液器重悬混匀磁珠

Oligo(dT)25，并吸取40μl至1.5ml 管中；静置于小型磁珠富集器上，30s后，弃去上清；将1.5ml管取下，加入 40μl的结合液，重悬混匀磁珠，静置于小型磁珠富集器上，30s后，弃去上清；取下1.5ml管，将裂解上清液加入到装有磁珠的1.5ml管中；将1.5ml管置于试管旋转混合器上，10rpm，室温下孵育15min；在小型磁珠富集器上静置 2min，弃去上清后取下；加入200μl的缓冲液A，重悬混匀磁珠，置于小型磁珠富集器上30s，弃去上清后，将离心管取下；再加入200μl的缓冲液A，重悬混匀磁珠，置于小型磁珠富集器上30s，弃去上清后，将离心管取下；加入 200μl的缓冲液B，重悬混匀磁珠，置于小型磁珠富集器上30s，弃去上清后，将离心管取下；加入100μl的H₂O，重悬混匀磁珠，置于小型磁珠富集器上 30s，弃去上清后，将离心管取下；加入29.5μl H₂O，重悬混匀磁珠，置于55 ℃水浴(或金属浴)中，5min；然后立刻将1.5ml管放置于冰上，至少2min。

mRNA/磁珠混合物不能储存，需立即进行逆转录。

3.2逆转录：

逆转录步骤如下：

逆转录程序：

37℃60min，4℃保存。

将逆转录后的cDNA置于冰上或-20℃保存(最长可以保存2周)。

反应同时以RNase-free水替代样品作为阴性对照。

3.3多重PCR

引物序列：

阳性对照为：将子宫内膜癌细胞系RL95-2收集提取RNA逆转录翻译获得阳性对照的cDNA；

阴性对照为：高纯水。

反应体系

PCR:程序

95℃15min；94℃45s，58℃90s，72℃60s，35个循环；60℃30min；4℃∞

将PCR产物置于冰上或-20℃保存。

3.5结果分析

实验结构均采用Agilent生物分析仪分析对PCR产物进行分析。

1)所有患者的样品必须有Actin基因的条带(内标)；

2)逆转录的阴性对照不能有大于80个核苷酸的条带；

3)如果产物大于1kb，说明被基因组DNA污染(内含子)；

4)在本实验中PCR产物中的3个阳性条带中任何一个条带为阳性均可以判定结果为阳性；

5)在PCR结果中，除Actin外的3个PCR产物均存在于肿瘤细胞，而EpCAM 的PCR产物与肿瘤细胞的来源是上皮细胞有关；

6)在PCR结果中，除Actin外为每次必须出现的条带外，其他的3个条带可以随机出现。但是采用本方法检测，最低的PCR检出应该为2个细胞，即在被测样品中只要存在2个及2个以上的肿瘤细胞或肿瘤干细胞，均可以检测到 3个PCR产物中的任何一个。

首先多重PCR确定三种鉴定Marker的可靠性，图1所示为RL95-2子宫内膜癌细胞系中三种marker的鉴定结果。对子宫内膜癌细胞系RL95-2提取RNA 逆转录cDNA后，分别做PAX8、ER和P53的多重PCR结果，内参选择Actin。

采取67例初诊或复发的病理诊断为子宫内膜癌患者，平均年龄56.1岁 (21-81岁)；20例健康志愿者，排除全身各***恶性肿瘤，作为阴性对照组，平均年龄53.3岁(25-72岁)。I型子宫内膜癌患者53例(79.1％)，II型子宫内膜癌患者5例(7.5％)，混合型子宫内膜癌9例(13.4％)。高分化子宫内膜癌患者18例(26.9％)，中分化子宫内膜癌患者31例(46.3％)，低分化子宫内膜癌患者18例(26.9％)。IA期49例(73.1％)，ⅠB期患者4例(6.0％)，Ⅱ期患者4例(6.0％)，ⅢA期患者1例(1.5％)，ⅢB期患者 1例(1.5％)，ⅢC1期患者1例(1.5％)，ⅢC2期患者4例(6.0％)，Ⅳ 期患者4例(6.0％)。由于FIGO分期IB及以后分期的患者较少，根据FIGO 分期判定指标，将临床分期统计时做合并处理，分为IA期、IB-II期、IIIA-IVB 期三组，各组中病例数分别为：早期——IA期49例(73.1％)、中期——IB-II期8例(11.9％)、晚期——IIIA-IVB期10例(14.9％)。

为检测本发明试剂盒中三种Marker对病人外周血标本的灵敏性，以子宫内膜癌细胞系RL95-2为阳性对照，健康志愿者为阴性对照，选取病人外周血，按照上述实验流程富集CTC之后提取RNA，逆转录成cDNA，随后多重PCR验证三种标记物的结果。结果显示67例子宫内膜癌患者中有41例检出CTC，阳性检出率为61.2％(41/67)，20例正常人外周血均未检出CTC。PCR产物阳性表达率是：PAX8 70.1％(29/41)，ER 48.8％(29/41)，P53 29.3％(12/41)。图2和图3显示其中部分临床样本、子宫内膜癌细胞系RL95-2、阴性对照的实验结果。

从上述实施例可以看出，本发明检测外周血中子宫内膜癌细胞的试剂盒检测方法简便，且检测样本量小，对患者伤害小，检测灵敏度高，检测准确率可以达到61.2％，检测结果可信。

子宫内膜癌患者外周血中可检测到CTC；CTC阳性与肿瘤分化程度、临床病理分期、肿瘤病灶大小、子宫肌层受累情况相关；在***转移或者复发病例中阳性率较高；说明CTC的阳性率与子宫内膜癌的高危因素存在相关性， CTC可以作为判断子宫内膜癌预后的指标，并在一定程度上指导术后辅助治疗的选择。本发明提供的试剂盒主要针对子宫内膜癌患者治疗后的监测，为医生对子宫内膜癌患者治疗后是否复发及治疗效果评价提供可靠的实验数据。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京牛牛基因技术有限公司

北京大学

北京大学第三医院

<120> 一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒

<130> DEMO

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgctatgtt actaagcgtg ag 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggtgctataa taaacccttg ac 22

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gaagcaatag ccgaggaa 18

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtagaaaga gccaagcaaa 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

acctatggaa actacttcct gaaa 24

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accatcgcta tctgagcagc 20

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaaatcgtgc gtgacatta 19

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aggcagctcg tagctctt 18

Claims

1.一种检测外周血中子宫内膜癌细胞标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由如下组分组成：

结合有子宫内膜癌抗体的磁珠；

结合有寡核苷酸Oligo(dT)的磁珠；

缓冲液A；100-200mL；

缓冲液B：100-200mL；

裂解/结合缓冲液 150-250mL；

10×缓冲液 4.0-5.0mL；

dNTPs，5mM each 4.0-5.0mL；

逆转录酶，10000U/μL 2.0-3.0mL；

RNA酶抑制剂，40 U/μL 0.4-0.6mL；

2×多重PCR混合液 2-3mL；

RNase-free水 1-2mL；

子宫内膜癌肿瘤标志物引物10μmol/L 3.0-5.0mL；

其中所述子宫内膜癌肿瘤标志物为ER、PAX8和P53；

所述ER引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：1所示；

下游引物如SEQ ID NO：2所示；

所述PAX8引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：3所示；

下游引物如SEQ ID NO：4所示；

所述P53引物序列为：

上游引物如SEQ ID NO：5所示；

下游引物如SEQ ID NO：6所示；

所述子宫内膜癌抗体为抗EpCAM单克隆抗体、抗MUC1单克隆抗体和抗CK20单克隆抗体；

所述缓冲液A的配方为： 10mM Tris-HCl, pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA；0.1% LiDS；

所述缓冲液B的配方为：10mM Tris-HCl, pH7.5；0.15M LiCl；1mM EDTA。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述2×多重PCR混合液中包含HotStarTaqDNA Polymerase 5U/μL。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述裂解/结合缓冲液配方：100mM Tris-HCl, pH7.5；500mM LiCl；10mM EDTA, pH8；1% LiDS；5mM DTT。