CN110846415A - 一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，包括Golli‑MPB、STIM1、FGF19、FGFR4四种蛋白标记物和以所述四种标记物作为检测靶标的试剂盒，根据所述四种标记物的mRNA的表达量判断扁平苔藓癌前病变的发展阶段，所述试剂盒包括荧光定量PCR试剂、Western‑blot蛋白印迹、逆转录试剂和DAB显色试剂，本发明提供的检测装置，可以有效预测口腔扁平苔藓癌前病变风险。

Description

一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置

技术领域

本发明属于生物技术及诊断技术领域，具体涉及一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置。

背景技术

口腔扁平苔藓(orallichenplanus，OLP)是一种常见的口腔黏膜疾病，病因不明，易反复发作，有一定的癌变倾向，被世界卫生组织定义为癌前状态。口腔扁平苔薛发病机制尚不明确，目前研究表明，可能与免疫、精神、内分泌、感染、微循环障碍、遗传、***性疾病及口腔局部刺激因素等有关，其中细胞介导的局部免疫应答紊乱在的发生发展中有重要作用，临床上使用糖皮质激素及氯喹等免疫抑制剂治疗有效，也证明本病与免疫因素有关。的典型病理表现为上皮过度不全角化，基底层液化变性以及固有层有密集的淋巴细胞呈带状浸润。口腔扁平苔藓是淋巴细胞介导的慢性炎症，淋巴细胞为主的选择性聚集以造成基底细胞的过度调亡。角质形成细胞和炎症浸润细胞产生细胞因子，促使淋巴细胞从血循环迁移到上皮下炎症浸润区。

癌症几乎总是由专家在显微镜下观察细胞或组织样品来诊断，在一些情况下，对细胞的蛋白质、DNA和RNA进行的测试可以帮助告诉医生是否存在癌症，这些测试结果在选择最佳治疗选项时是重要的，这些测试通常在个体有疾患自己挂号时进行，在这些情况下，如果是癌症，则很可能癌症已经进展到简单手术不能治愈或转移可能性显著的程度，导致需要使用化学疗法和/或放射进行侵入性治疗以及总体预后不良。另一方面，当疾患不是由癌症引起时，患者在等待活组织检查结果的相当长时间内处于不确定状态。

因此，需要一种简单、快速且非侵入性的方法来确定个体是否具有癌症，并且如果是癌症，则确定它是什么类型的癌症。

发明内容

本发明的目的是为了解决背景技术中所提出的问题，而提供一种用于快速、可靠的口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置。

本发明的目的是这样实现的：

一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，包括Golli-MPB、STIM1、FGF19、FGFR4四种蛋白标记物和以所述四种标记物作为检测靶标的试剂盒，根据所述四种标记物的mRNA的表达量判断扁平苔藓癌前病变的发展阶段，所述试剂盒包括荧光定量PCR试剂、Western-blot蛋白印迹、逆转录试剂和DAB显色试剂。

进一步的，所述荧光定量PCR试剂、Western-blot蛋白印迹和逆转录试剂检测Golli-MPB和STIM1两种蛋白，所述DAB显色试剂检测FGF19和FGFR4两种蛋白。

进一步的，所述Western-blot蛋白印迹包括细胞裂解液，蛋白酶抑制剂，SDS-PEGA凝胶试剂盒，PVDA，兔源抗STIM1单克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG。

进一步的，所述Golli-MPB和STIM1两种蛋白的检测包括如下步骤：

S1、样本总RNA提取，将口腔扁平苔藓组织纯化为外周血淋巴细胞，经离心、干燥、溶解后进行逆转录；

S2、总RNA浓度和纯度检测，通过紫外分光光度计测定S1中样品的RNA浓度和纯度；

S3、将总RNA逆转录为cDNA，通过逆转录试剂盒调制反应液，冷却后在-20℃下贮存cDNA；

S4、实时定量PCR，根据Golli-MPB和STIM1基因序列设计引物，扩增后通过荧光定量PCR仪检测基因表达量；

S5、Western-blot蛋白印迹，向样本中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，离心后通过核算蛋白测量仪测量总蛋白浓度，蛋白变性后经SDS-PAGE电泳，电泳后转膜，转膜结束后经拍照成像，通过统计学分析比较mRNA的表达差异。

进一步的，S4中，以GAPDH为内参基因，Golli-MPB基因序列的正向引物序列为5’-AAATGCCGAGAAGGCCAGTA-3’,反向引物序列为5’AAAAGAGGCGGATCAAGTGG-3’,STIM1基因序列的正向引物序列为5’-GCAGCAGAGTTTTGCCCAAT-3’，反向引物序列为5’-TGACTTCCATGCCTTCCACA-3’。

进一步的，所述DAB显色试剂包括浓缩DAB溶液和DAB底物液，还包括鼠抗人FGF19抗体、鼠抗人FGFR4抗体、柠檬酸抗原修复液、盐酸乙醇、苏木素染色剂和氨水。

进一步的，所述FGF19和FGFR4两种蛋白的检测包括如下步骤：

1)筛选口腔扁平苔藓组织蜡块，将组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，经脱蜡、清洗后机芯抗原热修复；

2)修复后在双氧水内室温孵育，消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，并PBS浸泡，除去PBS后，滴加抗体，再经PBS冲洗、清除，滴加HRP试剂，再经PBS冲洗、清除，通过DAB显色剂显色，充分冲洗后复染封片，显微镜观察。

进一步的，S1中，RNA提取包括如下步骤：

1)将纯化的外周血淋巴细胞转移至无酶、无热源的管中，离心，弃上清，加1mlTrizol轻吹混匀，冰上静置10min；

2)加氯仿，充分混匀，冰上静置2-5min，于4℃下，12000r/min离心15min；

3)转移上层水相，至EP管，加入异丙醇，上下颠倒充分振摇混匀，冰上静置10min，于4℃下，12000r/min离心10min；

4)弃上清，沉淀加入75％乙醇轻轻洗涤后，于4℃下，12000r/min离心10min；

5)弃上清，RNA沉淀于通风橱中干燥2-3min；

6)将干燥后的RNA沉淀用DEPC水溶解后，进行逆转录。

进一步的，S3中，反应液调制于冰上操作，逆转录的条件为：37℃，15min；85℃，5s，冷却后在-20℃下贮存cDNA。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明提供的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，Golli-MPB和STIM1蛋白在外周血淋巴细胞中高表达，证实患者外周免疫***存在异常，体内Golli-MPB和STIM1的过表达，可能引起机体的自身免疫反应，同时对淋巴的负向调控作用，可使外周血细胞免疫出于抑制状态，可以有效预测口腔扁平苔藓癌前病变风险。

2、本发明提供的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，FGF19与FGFR4结合后及细胞凋亡上调增殖基因的表达，FGF19和FGFR4在肿瘤的发病、癌细胞的侵袭、肿瘤的转移及对肿瘤患者预后中的影响，已在口腔鳞癌、胃癌、乳腺癌、食管癌等恶性肿瘤的研究中得到证实，通过检测FGF19和FGFR4的高表达可对发现OLP恶变起到一定的提示作用。

附图说明

图1是本发明Golli-MPB mRNA和STIM1 mRNA在口腔扁平苔藓外周血淋巴细胞中的表达水平对比图。

图2是本发明Golli-MPB蛋白和STIM1蛋白在口腔扁平苔藓外周血淋巴细胞中的表达对比图。

图3是本发明FGF19蛋白和FGFR4蛋白在口腔扁平苔藓阻止中的表达对比图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，包括Golli-MPB、STIM1、FGF19、FGFR4四种蛋白标记物和以所述四种标记物作为检测靶标的试剂盒，根据所述四种标记物的mRNA的表达量判断扁平苔藓癌前病变的发展阶段，所述试剂盒包括荧光定量PCR试剂、Western-blot蛋白印迹、逆转录试剂和DAB显色试剂。

所述荧光定量PCR试剂、Western-blot蛋白印迹和逆转录试剂检测Golli-MPB和STIM1两种蛋白，所述DAB显色试剂检测FGF19和FGFR4两种蛋白。

实施例2

排除患有其他口腔疾病、自身免疫性疾病、服用过免疫制剂者及服用可能引起苔藓样反应药物的患者，选取OLP成人患者50例为实验组，健康成人50例为对照组，其中年龄和性别均无统计学意义。

荧光定量PCR：(1)样本总RNA提取：将纯化的外周血淋巴细胞转移至无酶、无热源的管中，离心，弃上清，加1mlTrizol轻吹混匀，冰上静置10min；加氯仿，充分混匀，冰上静置2-5min，于4℃下，12000r/min离心15min；转移上层水相，至EP管，加入异丙醇，上下颠倒充分振摇混匀，冰上静置10min，于4℃下，12000r/min离心10min；弃上清，沉淀加入75％乙醇轻轻洗涤后，于4℃下，12000r/min离心10min；弃上清，RNA沉淀于通风橱中干燥2-3min；将干燥后的RNA沉淀用DEPC水溶解后，进行逆转录。(2)总浓度和纯度检测：用260nm波长分光测定样品浓度，OD值为1相当于约40μg的单链RNA。(3)将总逆转录为cDNA：根据逆转录试剂盒调制反应液(冰上操作)，逆转录反应温度条件为37℃15min，85℃5s，冷却后在-20℃温度下贮存。(4)实时定量PCR，以GAPDH为内参，设计基因序列的引物，通过qPCR反应加样，进行基因扩增，通过荧光定量PCR仪器、检测基因表达量。

Western-blot蛋白印迹：(1)总蛋白提取：在样本中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上超声处理1min，4℃、12000r/min离心10min，取上清分装待用，弃去沉淀；(2)总蛋白浓度测定：配制蛋白浓度标准品，核酸蛋白测量仪上建立标准曲线后，最终测定待测样品蛋白浓度；(3)蛋白变性：将上样缓冲液与样品蛋白上清液按照1:4的比例混合，沸水浴煮蛋白5min，冰上待用；(4)SDS-PAGE电泳：配制12％的分离胶及上层5％的浓缩胶，取蛋白变性处理好的样品，按预定的顺序加样，接通电源后，浓缩胶中以60V恒压电泳至分离胶后改为90V恒压电泳，等到目的蛋白分离，指示剂溴酷蓝跑出分离胶即可停止电泳；(5)转膜：电泳结束后，根据上样顺序和蛋白指示剂按需切取适当大小的长方形分离胶，至转膜缓冲液中润湿，取与凝胶同样大小的一片PVDE膜，用甲醇浸泡至少15s，再用转膜缓冲液浸泡2min，胶与膜对齐，剪角标记，两侧各放一叠滤纸海绵，浸湿后用玻棒赶尽膜与胶之间的气泡，膜在正极端，胶在负极端，放入电转仪，加满转膜缓冲液，接通电源，以300mA稳流电转膜；(6)免疫印迹：转膜结束后，在封闭液中封闭2小时，在抗体中4℃过夜，用TBST洗膜五次，在抗体中室温震荡孵育1-2h，用TBST洗膜五次；(7)化学发光法处理膜，拍照成像，用单因素方差分析比较各组间的mRNA表达差异。

实施例3

在实施例2的基础上，结合图1和图2，实时焚光定量结果表明，Golli-MPBmRNA在实验组中的表达水平显著高于正常对照组，P＜0.001，STIM1mRNA在OLP组中的表达水平显著高于正常对照组，P＜0.001。根据蛋白印迹结果显示，实验组中Golli-MPB和STIM1蛋白的表达量也显著高于正常对照组。

实施例4

排除患有其他口腔疾病、自身免疫性疾病、服用过免疫制剂者及服用可能引起苔藓样反应药物的患者，选取OLP成人患者50例为实验组，健康成人50例为对照组，其中年龄和性别均无统计学意义。

筛选实验组的口腔扁平苔藓组织蜡块，固定和包埋后，将厚度5μm的组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，脱蜡、至水，自来水冲洗两次、PBS洗两次，3％双氧水，室温10分钟(避光)，蒸馏水洗1次，PBS洗5分钟三次，进行抗原热修复，将适量的枸橼酸盐缓冲液注入高压锅内加热至沸腾，先将切片置于耐高温金属架上，后放入锅内，注意应使切片位于液面以下，继续加热，当高压锅开始慢慢喷气时开始计1.5分钟，室温冷却10分钟后，取出切片，用蒸馏水清洗，再用PBS溶液洗3次每次2分钟，3％H₂O₂室温孵育10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，除去PBS，滴加稀释的抗体，4℃过夜，PBS冲洗，3次每次3分钟，除去PBS，在切片上滴加HRP试剂，室温下孵育15分钟，PBS冲洗，3次每次3分钟，除去PBS，DAB显色剂显色，自来水充分冲洗，复染，封片，显微镜观察。

FGF19和FGFR4阳性表达为细胞质或细胞膜黄染，每张切片均随机选取5个高倍镜视野，每个视野的细胞数最少200个，在高倍镜下观察切片中阳性细胞的染色强度及阳性细胞的百分率，按染色强度计分：0分为无染色，1分为浅黄色，2分为黄色，3分为棕黄色；再按照阳性细胞百分率计分：阳性细胞0-24％为1分，25％-49％为2分，50％-74％为3分，≥75％为4分，最后将两者相乘即为最后得分，≤1分为阴性(－)，2-3分为弱阳性(+)，4-5分为中度阳性(++)，≥6分为强阳性(+++)，将最后得分作为最终染色程度进行统计学分析。

结合图3，FGF19和FGFR4阳性表达为细胞质黄染，FGF19在50例正常口腔黏膜组织中18例弱阳性表达，32例阴性表达；在口腔扁平苔藓组织中主要表达在T淋巴细胞浸润带，其中3例弱阳性表达，47例中度阳性表达，经分析有统计学意义。

FGFR4在50例正常口腔黏膜组织中26例弱阳性表达，24例阴性表达；在口腔扁平苔藓组织中主要表达在T淋巴细胞浸润带，其中6例弱阳性表达，42例中度阳性表达，经分析有统计学意义。

以上仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的保护范围内所做的任何修改，等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，其特征在于：包括Golli-MPB、STIM1、FGF19、FGFR4四种蛋白标记物和以所述四种标记物作为检测靶标的试剂盒，根据所述四种标记物的mRNA的表达量判断扁平苔藓癌前病变的发展阶段，所述试剂盒包括荧光定量PCR试剂、Western-blot蛋白印迹、逆转录试剂和DAB显色试剂。

2.根据权利要求1所述的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，其特征在于：所述荧光定量PCR试剂、Western-blot蛋白印迹和逆转录试剂检测Golli-MPB和STIM1两种蛋白，所述DAB显色试剂检测FGF19和FGFR4两种蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，其特征在于：所述Western-blot蛋白印迹包括细胞裂解液，蛋白酶抑制剂，SDS-PEGA凝胶试剂盒，PVDA，兔源抗STIM1单克隆抗体，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗鼠IgG。

4.根据权利要求1或3所述的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，其特征在于：所述Golli-MPB和STIM1两种蛋白的检测包括如下步骤：

S1、样本总RNA提取，将口腔扁平苔藓组织纯化为外周血淋巴细胞，经离心、干燥、溶解后进行逆转录；

S2、总RNA浓度和纯度检测，通过紫外分光光度计测定S1中样品的RNA浓度和纯度；

S3、将总RNA逆转录为cDNA，通过逆转录试剂盒调制反应液，冷却后在-20℃下贮存cDNA；

S4、实时定量PCR，根据Golli-MPB和STIM1基因序列设计引物，扩增后通过荧光定量PCR仪检测基因表达量；

S5、Western-blot蛋白印迹，向样本中加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，离心后通过核算蛋白测量仪测量总蛋白浓度，蛋白变性后经SDS-PAGE电泳，电泳后转膜，转膜结束后经拍照成像，通过统计学分析比较mRNA的表达差异。

5.根据权利要求4所述的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，其特征在于：S4中，以GAPDH为内参基因，Golli-MPB基因序列的正向引物序列为5’-AAATGCCGAGAAGGCCAGTA-3’,反向引物序列为5’AAAAGAGGCGGATCAAGTGG-3’,STIM1基因序列的正向引物序列为5’-GCAGCAGAGTTTTGCCCAAT-3’，反向引物序列为5’-TGACTTCCATGCCTTCCACA-3’。

6.根据权利要求1所述的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，其特征在于：所述DAB显色试剂包括浓缩DAB溶液和DAB底物液，还包括鼠抗人FGF19抗体、鼠抗人FGFR4抗体、柠檬酸抗原修复液、盐酸乙醇、苏木素染色剂和氨水。

7.根据权利要求1或6所述的一种用于口腔扁平苔藓癌前病变的检测装置，其特征在于：所述FGF19和FGFR4两种蛋白的检测包括如下步骤：

1)筛选口腔扁平苔藓组织蜡块，将组织切片附于经多聚赖氨酸附膜的载玻片上，经脱蜡、清洗后机芯抗原热修复；

2)修复后在双氧水内室温孵育，消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，并PBS浸泡，除去PBS后，滴加抗体，再经PBS冲洗、清除，滴加HRP试剂，再经PBS冲洗、清除，通过DAB显色剂显色，充分冲洗后复染封片，显微镜观察。

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