CN115287227B - 一种促进植物氮营养和生长的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种促进植物氮营养和生长的芽孢杆菌及其应用。本发明从花生玉米间作体系中间花生根际土壤中分离得到一株芽孢杆菌，将其命名为1603IPR‑02，并对其进行了生物保藏，保藏编号为CGMCC NO.24753。本发明提供的芽孢杆菌1603IPR‑02为革兰氏染色阳性菌，具有很强的固氮能力，可将空气中的氮转化为可被植物利用的氮，增加土壤养分，促进植物对氮的吸收，同时其能够成功定殖于植物根际土壤，提高植物光合作用并促进植物生长，在植物促生领域具有很大的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种促进植物氮营养和生长的芽孢杆菌及其应用。
背景技术
花生是一种常见的豆科油料作物，出油率较高，分布较广，在现有技术中多个领域应用广泛。玉米是一种常见的粮食作物，在全世界热带和温带地区广泛种植。玉米的营养价值较高，广泛应用于畜牧业、养殖业、水产养殖业等领域，具有广阔的开发和应用前景。
氮素被称为生命元素，是构成核酸、蛋白质、叶绿素等生物大分子的重要组成部分，参与光合作用、呼吸作用等重要生命过程。现有的农业生产中普遍过量使用化学氮肥，这不仅降低肥料利用效率、抑制花生的共生固氮效率，也直接增加了生产成本、降低了经济效益。玉米作为主要粮食作物对氮肥需求量很大，在实际生产过程中也不可避免地对外源氮肥有着很强的依赖性。但氮肥的大量施用会对土壤以及生态环境造成一些不可逆的损伤，因此通过实验室手段探究其他绿色无污染的途径以替代大量化学氮肥施用具有十分重要的现实意义。
空气中游离的氮转化为化合态氮的过程被称为固氮，其中生物固氮是指微生物在固氮酶的催化下将N2还原为氨的过程。大气中65％的氮主要以生物固氮的形式被固定，这部分氮素不仅可以由微生物自身利用还可以被植物吸收利用。全球每年由生物固定的氮含量近200万吨，占全球植物需氮量的75％。因此在农业中合理利用微生物所固定的氮以减少化学氮肥的施用是一种节能、绿色、健康的肥力补充方式。利用微生物进行固氮在降低氮肥施用量、提高农作物产量、减少环境污染促进农业可持续发展等方面具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种促进植物氮营养和生长的芽孢杆菌及其应用。
本发明从花生玉米间作体系中间花生根际土壤中分离得到一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)，将其命名为芽孢杆菌1603IPR-02，并对其鉴定，其菌落即菌体特征为：菌落圆形，中心凹陷，颜色白色，边缘粗糙，菌体呈干涩半透明状。显微镜观察体形态特征为杆状，单细胞，革兰氏染色为阳性，有芽孢。
本发明进一步将该菌株进行了生物保藏，保藏信息如下：
保藏编号：CGMCC No.24753；分类命名：芽孢杆菌Bacillus sp.；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号邮编100101；保藏日期：2022年4月22日。
本发明进一步提供芽孢杆菌1603IPR-02的发酵产物。
进一步地，所述芽孢杆菌1603IPR-02的发酵采用的培养基为LB培养基，其组成为：酵母提取物5g；蛋白胨10g；氧化钠10g；加蒸馏水定容至1000mL；pH＝7.0，121℃灭菌20min；发酵的条件为：温度为30℃，转速为150-200rpm。
第二方面，本发明提供一种菌剂，包括所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02或其发酵产物。
进一步地，所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02的有效活菌数不少于1×109CFU/mL。
进一步地，所述菌剂为植物光合改善剂或植物氮营养改善剂。
本发明进一步提供包括所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02，或所述菌剂的生物肥料。
本发明进一步提供所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02，或所述菌剂，或所述生物肥料在促进植物对土壤中氮吸收的应用。
本发明进一步提供所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02，或所述菌剂，或所述生物肥料在提高植物光合作用中的应用。
进一步地，所述植物包括：豆科作物和/或禾本科作物。
本发明具有如下有益效果：
于本发明从植物根际土壤中分离得到一株芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02，该菌株具有高效固氮能力，将空气中的氮转化为可被植物利用的氮，增加土壤养分，本发明提供的芽孢杆菌1603IPR-02能够促进花生及玉米对土壤氮的吸收，改善植物氮营养，提高植物光合作用。本发明提供的芽孢杆菌1603IPR-02在应用过程中，无污染，无残留，生物环保，是一株在植物促生领域应用前景良好的促生菌株。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02对花生影响照片；其中左为对照组，右为经过芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02处理的花生。
图2为本发明是实施例2提供的对照组和经过芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02处理的花生叶片SPAD值统计结果。
图3为本发明实施例2提供的芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02对玉米影响照片；其中左为对照组，右为经过芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02处理的玉米。
图4为本发明实施例2提供的对照组和经过芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02锤的玉米叶片SPAD值统计结果。
图5为本发明实施例2提供的对照组和经过芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02处理的玉米叶片氮浓度统计结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的培养基如无特殊说明配方如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，用蒸馏水定容至1L，将pH调至7.0。
实施例1
本实施例针对芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02的促生功能进行验证，具体步骤如下：
1、芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02的固氮能力的鉴定：
将处于对数生长期的待测菌株接入LB液体培养基，30℃震荡培养过夜。测定菌株的OD600值后，离心收集菌体，利用生理盐水洗3次后悬浮于限氮培养基中，调OD600＝0.2。每个厌氧管接入1mL菌液，使厌氧管成密封状态，排除空气并注入高纯氩气加入2.5mL新制乙炔，30℃振荡培养72h。每个厌氧管中用微量进样器取100μL气体，注入气相色谱仪测定乙烯含量。
酶活计算公式如下：
固氮酶活＝记录仪上乙烯峰面积×(试管气体体积/进样量)/(1nmol标准乙烯峰面积×反应时间)
由菌株固氮酶活测定结果可知，芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02具有较强固氮能力，达到1.27μmol/(h·ml)。
2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02解磷能力的鉴定：
将单菌落接种于蒙金娜无机磷培养基后28℃、转速180rmp摇床培养两天。将菌液在10000rpm转速下离心10min，取5mL菌液上清液，用滤孔0.22μm滤膜过滤后稀释。取5mL稀释液加入到50mL容量瓶中，再加入5mL的钼锑抗比色液，加去离子水至刻度线。静置30min后，测880nm处波长吸光度OD880。绘制磷浓度标准曲线，以根据磷标准曲线及菌液OD880值计算菌液溶出的磷含量。
由菌株解磷能力测定结果可知，芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02具有较强解磷能力，达到4.11μg/mL。
3、芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02产生长素能力的鉴定：
将色氨酸单独灭菌后加入到LB液体培养基，使最终浓度100mg/L。分别接种单菌落后摇床培养1天，条件为28℃，摇速180rpm。将1mL菌液在10000rpm的转速下离心10min，取100μL上清液滴于白色点滴板上，以空白培养基、50mg/L IAA溶液分别作为阴性、阳性对照，加入等量的Salkowski显色液，室温避光放置30min。取1mL上清液与等体积Salkowski显色液混匀，将显色液置于40℃的水浴中避光反应30min，比色法测530nm波长处吸光度，同时测定菌悬液OD600值。结合IAA浓度标准曲线，计算菌液浓度OD600＝1时，单位体积菌液产生的IAA量。
由菌株产生长素能力测定结果可知，芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02具有较强分泌生长素能力，达到3.21μg/mL。
表1芽孢杆菌1603IPR-02的促生能力
实施例2
本实施进一步验证芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02对植物SPAD值及氮营养的影响，具体步骤如下：
将本发明菌株1603IPR-02于LB液体培养基中30℃培养至109CFU/ml，于高速离心机中5000rpm离心10min，倒掉上清液，加入等量灭菌的灭菌水配置成菌悬液，备用。
移栽花生与玉米，花生品种采用鲁花14，玉米品种采用郑单958。于间苗后第一周开始每周按照50ml/株加入菌液，加菌处理中菌液浓度：1×109CFU/ml，对照组中加入等量等浓度的灭菌盐水溶液。两组处理每个处理4盆，每盆花生6个生物学重复，每盆玉米3个生物学重复。于花生及玉米移栽后三个月收样。收样前一周用SPAD仪测定花生SPAD值以表征其光合能力，收样后烘干植株样品采用凯氏定氮法测定植物氮浓度。
结果如图1-图5所示，图1及图2结果表明，施用芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02后花生缺氮黄化现象明显缓解，主要体现在花生叶片SPAD值显著提高，幅度达到3.4％。图3-图5结果说明，芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02施用后显著改善玉米氮营养，矫治失绿症状。主要表现为，施用芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02后显著提高玉米叶片SPAD值，增幅为60.1％。施用芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02后玉米叶片氮浓度明显上升，幅度达到15.0％。从以上结果中可得出结论，将芽孢杆菌(Bacillus sp.)1603IPR-02施用于植物根际，能够有效促进植物对氮营养的吸收利用，提高植物光合能力。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (7)
1.一种芽孢杆菌(Bacillus sp.) 1603IPR-02，其特征在于，保藏编号为CGMCC NO.24753。
2.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.) 1603IPR-02。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中，所述芽孢杆菌(Bacillussp.) 1603IPR-02的有效活菌数不少于1×109 CFU/mL。
4.根据权利要求2或3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂为植物光合改善剂或植物氮营养改善剂。
5.一种生物肥料，其特征在于，所述生物肥料包括如权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.) 1603IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂。
6.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.) 1603IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂，或权利要求5所述的生物肥料在提高花生或玉米固氮能力中的应用。
7.权利要求1所述的芽孢杆菌(Bacillus sp.) 1603IPR-02，或权利要求2-4任一项所述的菌剂，或权利要求5所述的生物肥料在提高花生或玉米的光合作用中的应用。
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