CN113317413A - 一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法及应用；步骤为：活化菌株，得到芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌发酵种子液；将新鲜的黑水虻幼虫绞碎匀浆后与麸皮、米糠及次粉混合后添加酸性蛋白酶，混合得到发酵培养基，接种芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液以及乳酸菌发酵种子液，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到成品；本发明采用黑水虻鲜虫进行菌酶协同发酵，发酵彻底，成品小肽含量高，富含有机酸，具有抑菌活性；同时贮藏时间长，便于使用，兼具良好的经济效益。

Description

一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法及应用
技术领域
本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法及应用。
背景技术
水产饲料占水产养殖成本的40％～60％，鱼粉是水产饲料中最重要的饲料蛋白源之一，国际上超过2/3的鱼粉被用作水产饲料，在中国达60％左右。随着水产养殖业的迅速发展，全球鱼粉资源短缺的问题日益严峻，而水产饲料依赖于从饵料鱼中提取的鱼粉和鱼油，致使水产养殖成本上升，严重制约了水产养殖业的可持续发展。黑水虻是双翅目水虻科的一种昆虫，分布广泛，其幼虫含有丰富的必需氨基酸，其中亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸含量较高；此外，黑水虻具有营养富集作用，能降解餐厨垃圾以及动物粪便，并富集其中的有益营养成分，转化为高附加值的虫体蛋白，具有良好的应用前景。因此，合理开发利用黑水虻资源，利用微生物发酵技术将其转变为优质的生物饲料具有重要的意义。
目前，黑水虻饲料化已有一定研究，如专利CN 112544783A，其采用黑水虻幼虫粉替代鱼粉；专利CN 112544813A将黑水虻干燥粉碎并脱脂后，与家禽饲料按比例混合，制成家禽喂养饲料。黑水虻虫粉干燥粉碎处理设备投资大、能耗高，高温处理会破坏蛋白质，灰分含量高，导致机体消化吸收率降低；此外，黑水虻鲜虫整体或切碎饲喂，这些没有变性的蛋白可能会影响消化吸率，降低机体生长性能，部分小型水产动物口小无法直接吃进黑水虻虫体，同时黑水虻虫体存在携带病毒、病菌的风险，针对不同水产动物，黑水虻鲜虫的适宜添加量各异；黑水虻存在不同的生命周期，可以将黑水虻幼虫用于水产饲喂，黑水虻虫蛹或成虫则难以利用，因此黑水虻贮存和运输存在困难。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法及应用，将黑水虻幼虫进行发酵处理，使其蛋白质大分子转化成小肽，富含益生菌，具有酸香味和抑菌作用，同时便于贮藏。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案为：
(1)将芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基进行活化培养，分别得到芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；
(2)配制发酵培养基：将新鲜的黑水虻幼虫绞碎匀浆，得到黑水虻匀浆后与麸皮、米糠及次粉混合，再添加酸性蛋白酶，混合后得到发酵培养基；
(3)接种步骤(1)得到的芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液于步骤(2)得到的发酵培养基中，调整发酵温度以及培养基的含水量，混合均匀，得到发酵混合物，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到水产用发酵饲料。
优选的，步骤(1)中所述的芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；所述酵母菌为酿酒酵母；所述乳酸菌为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或凝结芽孢杆菌中的一种或多种。
优选的，步骤(2)中所述发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：
黑水虻匀浆45％～60％；
麸皮15％～30％；
米糠15％～30％；
次粉9.95％～18％；
酸性蛋白酶0.05％～1.5％。
优选的，步骤(2)中所述黑水虻匀浆的含水量为60％～70％。
优选的，步骤(2)中所述酸性蛋白酶的酶活力为6万u/g。
优选的，步骤(3)中所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液的接种量均为发酵培养基重量的0.1％～9％；所述芽孢杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×108～2.8×109cfu/mL；所述酵母菌发酵种子液为酿酒酵母发酵种子液。
优选的，步骤(3)中所述乳酸菌发酵种子液为植物乳杆菌发酵种子液，活菌总数为1.5×108～3.5×109cfu/mL，接种量为发酵培养基重量的0.8％～5.7％。
优选的，步骤(3)中所述乳酸菌发酵种子液还包括发酵乳杆菌发酵种子液、副干酪乳杆菌发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液或鼠李糖乳杆菌发酵种子液的一种或多种；所述发酵乳杆菌发酵种子液、副干酪乳杆菌发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液或鼠李糖乳杆菌发酵种子液的活菌总数均为1.0×108～6.1×109cfu/mL，接种量均为发酵培养基重量的0.5％～6.5％。
优选的，步骤(3)中所述发酵混合物的含水量为40％～60％。
优选的，步骤(3)中所述发酵时间为5～20天，发酵温度为24～38℃。
其中，酸性蛋白酶购自沧州夏盛酶生物技术有限公司，为普通商业化酶制剂。
菌种来源：(1)芽孢杆菌：纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)CGMCC1.1086、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.921
(2)酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1527
(3)乳酸菌：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)CGMCC1.557、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CGMCC1.15608、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)CGMCC1.12731、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC 1.577、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)CGMCC1.10823；
上述菌种均购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。
本发明的有益效果是：
(1)本发明采用菌酶协同发酵以及一步厌氧发酵的模式，发酵彻底，小肽含量高，酸香味，适口性好，动物采食量高。
(2)本发明采用多种益生菌，所用的酵母菌通过自身繁殖来增加发酵培养基菌体蛋白、维生素、多种消化酶等营养物质；芽孢杆菌能分泌丰富的胞外酶系，在其繁殖过程中，大量分泌蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶等，有助于降解饲料原料中蛋白质、多糖、脂肪等有机物，提高饲料消化率；乳酸菌通过自身代谢产生有机酸、游离氨基酸、维生素、功能性生物活性肽及未知生长因子等益生性物质，具有抗菌效用，改善肠道菌群生长环境，提高机体免疫力。
(3)本发明方法获得的产品便于储存、运输；可以和其它饲料方便配比混合，而且可以部分替代鱼粉而不影响动物生长性能，饲料效果良好，且经济效益突出。
附图说明
图1是发酵成品与发酵原料蛋白分子量分布图；其中M为蛋白Marker，F1指的是实施例1发酵原料的蛋白条带，F2是发酵成品的蛋白条带。
图2是水产用发酵饲料的体外抑菌活性测定图；其中PC为阳性对照；NC为阴性对照；SF为发酵饲料控制福氏志贺氏菌的实验组；SA为发酵饲料控制金黄色葡萄球菌的实验组；AH为发酵饲料控制嗜水气单胞菌的实验组；O157为发酵饲料控制大肠杆菌O157:H7的实验组；ET为发酵饲料控制迟钝爱德华菌的实验组。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
实施例1：
(1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养：
A、首先配置芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的培养基；
芽孢杆菌液体和固体培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，蒸馏水1L，pH自然，121℃灭菌20min，芽孢杆菌固体培养基的成分同液体培养基；区别是加入琼脂15g。
酵母菌液体和固体培养基：200g马铃薯煮软后8层纱布滤汁，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，蒸馏水定容至1L，pH自然，121℃灭菌20min；酵母菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g；
乳酸菌液体和固体培养基：牛肉膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min；乳酸菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g；
B、芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养方法：
芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至芽孢杆菌固体培养基，30℃培养18h复苏菌种，挑取单菌落接种到装有100mL芽孢杆菌液体培养基的摇瓶(250mL)中，180r/min，30℃培养12h，得到芽孢杆菌发酵种子液；按实际需要再以2％的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述芽孢杆菌包括纳豆芽孢杆菌CGMCC1.1086和枯草芽孢杆菌CGMCC1.921。
酵母菌液体菌种培养：无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至酵母菌固体培养基，28℃培养20h复苏菌种，然后挑取单菌落接种到装有100mL酵母液体培养基的摇瓶(250mL)中，180r/min，28℃培养12h，得到酵母菌发酵种子液；按实际需要再以2％的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述酵母菌为酿酒酵母CGMCC 2.1527。
乳酸菌液体菌种培养：无菌条件下分别将-80℃保存的甘油菌接种至乳酸菌固体培养基，37℃培养24h复苏菌种，挑取单菌落接种到装有50mL乳酸菌液体培养基的厌氧瓶(50mL)中，静置37℃培养18h，得到乳酸菌发酵种子液，按实际需要再以2％的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述乳酸菌包括植物乳杆菌CGMCC1.557、发酵乳杆菌CGMCC1.15608、鼠李糖乳杆菌CGMCC1.577、凝结芽孢杆菌1.10823和副干酪乳杆菌CGMCC1.12731。
(2)配置好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：黑水虻匀浆50％(含水量70％)；麸皮17.5％；米糠16.5％；次粉15％；酸性蛋白酶1％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、发酵乳杆菌发酵种子液、副干酪乳杆菌发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液和鼠李糖乳杆菌发酵种子液接种到发酵培养基中，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的1.5％，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为1.7×109cfu/mL，植物乳杆菌接种量为发酵培养基重量的2％，活菌总数为2.3×109cfu/mL，发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和鼠李糖乳杆菌接种量均为发酵培养基重量的1％，活菌总数为1.8×109cfu/mL，混合均匀，调整含水量为54％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为30℃，发酵7天后获得成品，即为水产用发酵饲料，并检测各项指标验证饲料品质，结果如表1所示。
表1是实施例1的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(％) 54.83
纤维素 15.17
半纤维素 19.65
pH 4.51
乳酸菌活菌数 1.29×10<sup>9</sup>cfu/g
实施例2：
(1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1；
(2)配置好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：黑水虻匀浆55％(含水量70％)；麸皮11.2％；米糠20％；次粉13％；酸性蛋白酶0.8％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。
(3)将步骤(1)活化培养后的纳豆芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、发酵乳杆菌种子液和鼠李糖乳杆菌种子液接种到发酵培养基，纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的1.2％，纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为2.3×109cfu/mL，植物乳杆菌接种量为发酵培养基重量的3％，活菌总数为2.8×109cfu/mL，发酵乳杆菌和鼠李糖乳杆菌接种量均为发酵培养基重量的2％，两菌的活菌数均为4.2×109cfu/mL，混合均匀，调整含水量为50％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为33℃，发酵9天后获得成品，即为水产用发酵饲料，并检测各项指标验证饲料品质，结果如表2所示。
表2是实施例2的发酵成品各检测指标的结果
Figure BDA0003101842570000051
Figure BDA0003101842570000061
实施例3：
(1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养，具体操作同实施例1；
(2)配置好厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：黑水虻匀浆48％(含水量70％)；麸皮20％；米糠14.7％；次粉16％；酸性蛋白酶1.3％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。
(3)将步骤(1)活化培养后的纳豆芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、凝结芽孢杆菌种子液和副干酪乳杆菌种子液接种到发酵培养基，纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母的接种量均为发酵培养基重量的1％，纳豆芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌总数均为2.6×109cfu/mL，植物乳杆菌接种量为发酵培养基重量的4.2％，活菌总数为1.9×109cfu/mL，凝结芽孢杆菌和副干酪乳杆菌接种量均为发酵培养基重量的1.5％，两菌的活菌数均为5.7×109cfu/mL，混合均匀，调整含水量为45％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为36℃，发酵11天后获得成品，即为水产用发酵饲料，并检测各项指标验证饲料品质，结果如表3所示。
表3是实施例3的发酵成品各检测指标的结果
检测项目 含量
小肽(％) 48.31％
纤维素 17.41％
半纤维素 20.48％
pH 4.59
乳酸菌活菌数 6.92×10<sup>8</sup>cfu/g
表1–3是发酵成品各检测指标的结果，其中所测小肽含量指的是小肽占所测样品中粗蛋白含量的比例；测得的物质包括小肽、寡肽以及少量多肽和游离氨基酸等，结果显示，本发明发酵彻底，小肽含量高。
实施例4：
产品体外抑菌活性测定。
准确称取1g实施例1制备的水产用发酵饲料加入10mL 50％甲醇提取液，浸提1h，过滤取滤液备用，使用前将提取液通过0.22μm膜滤器过滤；采用琼脂滤纸片扩散法，50％甲醇溶液作为阴性对照，卡那霉素(0.05g/mL)作为阳性对照，得到水产用发酵饲料对大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7)NCTC 12900、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri)CMCC(B)51572、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 25923、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)CGMCC 1.1801和迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda)ATCC15947的抑菌效用。
表4是黑水虻饲料提取物对不同有害菌的抑制效果
Figure BDA0003101842570000071
注：++表示抑菌圈直径为10-13mm；+表示抑菌圈直径7-10mm；-为无抑菌圈。
由图2和表4可知，实施例1制备的水产用发酵饲料提取液对嗜水气单胞菌有较明显的抑制作用，抑菌圈直径大于10mm；对金黄色葡萄球菌和福氏志贺氏菌的抑制效果次之；对大肠杆菌O157:H7和迟钝爱德华菌无抑制作用。
实施例5：
产品饲喂效果实验；
本发明制备的水产用发酵饲料添加到普通水产饲料中用于特种水产动物的喂养，添加量为普通水产饲料的5％～25％(以重量计)。
选择实施例1制备的水产用发酵饲料，以中华鳖为实验对象，进行饲喂实验；试验点为浙江康星生物科技有限公司。取成鳖阶段的中华鳖60只，平均体重700g左右，随机组合成2组，每种饲料的饲养组设3个平行，连续饲喂60天，饲料配方如表5，实验结果如表6。
本次以重量计10％的实施例1制备的黑水虻发酵饲料，代替普通饲料中10％的鱼粉，结果显示，中华鳖增重率和饲料系数与对照组相比均无显著差异(P＞0.05)，说明本发明所制备的饲料效果良好，且经济效益突出。
表5是试验用中华鳖饲料配方
Figure BDA0003101842570000072
Figure BDA0003101842570000081
表6实施例1制备的成品饲料饲喂试验结果
饲料种类 对照组 试验组
初始质量(g) 741.4±1.31 730.2±2.07
终末质量(g) 805.1±8.31 793.7±9.46
增重率(％) 8.6±0.01<sup>a</sup> 8.7±0.06<sup>a</sup>
饲料系数 1.68±0.05<sup>b</sup> 1.66±0.03<sup>b</sup>
注：同行数据标记相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标记不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，制备步骤如下：
(1)将芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基进行活化培养，分别得到芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；
(2)配制发酵培养基：将新鲜的黑水虻幼虫绞碎匀浆后与麸皮、米糠及次粉混合，再添加酸性蛋白酶，混合后得到发酵培养基；
(3)接种步骤(1)得到的芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液于步骤(2)得到的发酵培养基中，调整发酵温度以及培养基的含水量，混合均匀，得到发酵混合物，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到水产用发酵饲料。
2.根据权利要求1所述的一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，步骤(1)中所述的芽孢杆菌为纳豆芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌；所述酵母菌为酿酒酵母；所述乳酸菌为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或凝结芽孢杆菌中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：
黑水虻匀浆45％～60％；
麸皮15％～30％；
米糠15％～30％；
次粉9.95％～18％；
酸性蛋白酶0.05％～1.5％；
其中所述黑水虻匀浆的含水量为60％～70％。
4.根据权利要求1所述的一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，步骤(2)中所述酸性蛋白酶的酶活力为6万u/g。
5.根据权利要求1所述的一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，步骤(3)中所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液的接种量均为发酵培养基重量的0.1％～9％；所述芽孢杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×108～2.8×109cfu/mL；所述酵母菌发酵种子液为酿酒酵母发酵种子液。
6.根据权利要求1所述的一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，步骤(3)中所述乳酸菌发酵种子液为植物乳杆菌发酵种子液，活菌总数为1.5×108～3.5×109cfu/mL，接种量为发酵培养基重量的0.8％～5.7％。
7.根据权利要求6所述的一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，所述乳酸菌发酵种子液还包括发酵乳杆菌发酵种子液、副干酪乳杆菌发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液或鼠李糖乳杆菌发酵种子液的一种或多种；所述发酵乳杆菌发酵种子液、副干酪乳杆菌发酵种子液、凝结芽孢杆菌发酵种子液或鼠李糖乳杆菌发酵种子液的活菌总数均为1.0×108～6.1×109cfu/mL，接种量均为发酵培养基重量的0.5％～6.5％。
8.根据权利要求1所述的一种基于黑水虻的水产用发酵饲料加工方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵混合物的含水量为40％～60％；所述发酵时间为5～20天，发酵温度为24～38℃。
9.根据权利要求1～8任一项所述的方法制备的发酵饲料用于水产养殖的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，具体操作是：将发酵饲料添加到水产饲料中，所述添加量以重量计，为5％～25％。
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