CN111700157A - 一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其原料质量份数组成为：益生菌发酵菌粉20～30份、牡蛎粉30～50份、环糊精5～10份、维生素2～5份、褐藻多糖1～2份、复合酶制剂0～10份。本发明采用好氧、厌氧混合菌协同发酵技术，共同发酵制备益生菌发酵饲料添加剂，通过发酵产物和微生物间的协同作用显著提升饲料添加剂的增强免疫力功效，对抑制病原微生物的侵染和生长，恢复肠道菌群平衡，增强肠道免疫功能和生理功能具有重要作用。实验结果表明，本产品能显著提高饲料添加剂对南美白对虾等水产养殖动物机体免疫力，改善动物生长性能，降低饲料系数，降低养殖风险，提高养殖经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，尤其是一种益生菌混菌发酵制备具有显著提高南美白对虾等水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，属于饲料添加剂技术领域。
背景技术
为了满足不断增长的水产品的需求，解决因水产养殖规模不断扩大和生长周期缩减而导致的生理机能紊乱、疾病频发成为水产养殖的重点问题，也是水产饲料产业发展的关键。在此背景下，抗生素类饲料添加剂受到热捧，被广泛应用于饲料业中，在一定程度上促进了水产养殖业的发展，但是抗生素带来的高残留、高污染和抗药性等问题愈发的严重。目前已经陆续开发出微生态制剂、中草药饲料添加剂等环保型饲料添加剂，但仍存在作用功效不确定、受外界环境影响较大等弊端，特别是对于海水养殖动物，现有的饲料添加剂存在益生菌萌发率低，作用持续时间短等弊端，因此开发新型益生菌饲料添加剂将有利于进一步推进水产生态养殖业的发展。
益生菌饲料添加剂在水产养殖中的应用愈加广泛，通常用以改善养殖生态环境，提高养殖动物的免疫力，抑制病原微生物，从而减少疾病的发生。近年来人们开始尝试在养殖生产中使用有益微生物调节水质，但整体上看目前水产用益生菌饲料添加剂仍以直接添加微生物菌剂为主，如专利CN201810145012.1公开了一种水产养殖用益生菌饲料的制备方法，以农产品加工下脚料和/或海产品加工下脚料为原料，经过一次发酵熟化和去杂菌，然后利用生物发酵技术，进行二次发酵，制得富含三种不同习性益生菌的益生菌饲料；专利CN201811363435.7公开了一种含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法；所述含萌发剂的水产养殖用凝结芽孢杆菌饲料添加剂组份如下：凝结芽孢杆菌菌粉，葡萄糖，海藻糖，玉米浆干粉；所述的凝结芽孢杆菌菌粉中孢子含量不低于100亿CFU/克，解决了凝结芽孢杆菌饲料添加剂因芽孢萌发慢、萌发率低造成施用后产品效果差的问题。上述益生菌饲料添加剂虽然取得了显著的技术效果，但在针对水产养殖动物综合免疫力能力提升及进一步发挥益生菌的营养作用仍存在着较大的技术瓶颈，难以满足现代高密度集约化水产养殖的需求。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提供一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，采用阶段性好氧、厌氧结合混合菌发酵技术，显著提高饲料添加剂对南美白对虾等水产养殖动物机体免疫力，改善动物生长性能，降低饲料系数，减少抗生素大量使用造成的养殖业污染，降低养殖风险，提高养殖经济效益；此外，该益生菌饲料添加剂生产工艺可操作性强，便于规模化推广应用。
本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其原料质量份数组成为：益生菌发酵菌粉20～30份、牡蛎粉30～50份、环糊精5～10份、维生素2～5份、褐藻多糖1～2份、复合酶制剂0～10份。
优选的，一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其原料质量份数组成为：益生菌发酵菌粉28份、牡蛎粉45份、环糊精6份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份。
进一步的，上述益生菌包括酿酒酵母、芽孢杆菌和乳杆菌的混合菌剂。
进一步的，所述酿酒酵母购于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC2.167。
进一步的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或几种的混合菌剂。
优选的，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均够自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号分别为CGMCC1.2163、CGMCC1.0809和CGMCC1.3533。
进一步的，所述乳杆菌为干酪乳杆菌，够自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号分别为CGMCC1.159。
进一步的，所述益生菌发酵菌粉的制备工艺具体包括如下步骤：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为1～2%、2～4%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵12～24h；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为2～4%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵12～24h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.5～1.0倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉。
上述芽孢杆菌种子液的制备工艺为：将活化后的芽孢杆菌接种至种子培养基，所述种子培养基的组分为：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母膏1%、硫酸镁0.01%、硫酸锰0.003%，pH6.5～7.0，在温度28～37℃、转速150～3000rpm条件下,培养16～24h，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
上述芽孢杆菌活化的工艺为：采用本领域常用培养基LB固体培养基，在温度28～37℃条件下,培养16～24h。
上述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mL PDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
最优的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1。
进一步的，所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶中的一种或几种的混合物。
最优的，所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶的混合物，其质量比为3:1:2。
本发明还提供一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）制备牡蛎粉颗粒，先将牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（2）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（3）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（4）混合后在60～65℃下加热、超声振荡1～2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
本发明提供一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具有预防、保健、治疗和调节免疫等多种功效，是替代抗生素药物的理想、绿色、环保、安全、新型饲料添加剂。该发明饲料添加剂一是可以高效调理南美白对虾等水产动物肠道健康，标本兼治，固本培元，保持肠道微生态平衡和最佳免疫状态，提高营养物质的消化吸收率，提高动物机体免疫力；二是可抑制和阻止病原大肠菌、梭状芽孢杆菌、沙门氏菌等有害菌的发生，增加肠道益生菌，维持健康的肠道菌群；三是增强免疫作用，通过刺激肠道内免疫系细胞，增加局部抗体的形成，增加巨噬细胞活性；四是饲料添加剂进入肠内抵制有害菌，降低恶臭及有害成分形成，使排出的粪便消除恶臭，在保护养殖环境的同时提高南美白对虾等水产养殖动物的肉质品质。
本发明提供一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，所述益生菌饲料添加剂产品在水产饲料全价料中使用的质量比例为0.1～0.5%：或所述的饲料添加剂在预混料、浓缩料以全价料中所需的比例添加使用。
本发明提供一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，与现有技术相比，具有以下显著优势：
（1）本申请利用好氧菌（酿酒酵母、芽孢杆菌）和厌氧菌（干酪乳杆菌）共同发酵制备益生菌发酵饲料添加剂，通过微生物间的协同作用显著提升饲料添加剂的增强免疫力功效，进入动物肠道后，对促进乳酸菌等肠道益生菌的生长，抑制副溶血弧菌等病原菌的生长，恢复肠道菌群平衡，增强肠道免疫功能和生理功能具有重要作用；产品功效显著高于单一发酵菌种饲料添加剂；
（2）本申请将牡蛎壳粉应用于饲料添加剂，牡蛎壳含大量2-10μm微孔结构,含有多种生物活性的氨基多糖及特性蛋白,具有较强的吸附能力,能容纳一定大小的分子，牡蛎壳粉与β-环糊精交联，能够很好的吸附和包裹益生菌、维生素、褐藻多糖和复合酶制剂，构建了稳定的饲料添加剂反应体系，延长了饲料添加剂的作用时间；
（3）本发明在饲料添加中加入了褐藻多糖，不仅能够发挥专利CN201811363435.7公开的促进益生菌萌发的作用，而且可以发挥褐藻多糖本申请的生理活性，进一步提升产品的增强免疫功能；同时，实验数据表明海藻多糖功能的发挥与复合酶制剂的组成密切相关；
（4）本申请益生菌饲料添加剂生产工艺简单，便于规模化推广应用。
具体实施方式
在以下实施例中，芽孢杆菌种子液的制备工艺为：将活化后的芽孢杆菌接种至种子培养基，所述种子培养基的组分为：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母膏1%、硫酸镁0.01%、硫酸锰0.003%，pH6.5～7.0，在温度28～37℃、转速150～3000rpm条件下,培养16～24h，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；其中芽孢杆菌活化的工艺为：采用本领域常用培养基LB固体培养基，在温度28～37℃条件下,培养16～24h。
酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
所述酿酒酵母购于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC2.167；所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均够自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号分别为CGMCC1.2163、CGMCC1.0809和CGMCC1.3533；所述乳杆菌为干酪乳杆菌，够自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号分别为CGMCC1.159。
实施例1
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将45份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入6份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉28份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶的混合物，其质量比为3:1:2；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例2
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将50份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入5份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖按比例益生菌发酵菌粉30份、维生素2份、褐藻多糖2份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡1～2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例3
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将30份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入10份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉20份、维生素5份、褐藻多糖1份、复合酶制剂10份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶的混合物，其质量比为3:1:2；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡1～2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例4
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将45份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入6份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉28份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶的混合物，其质量比为3:1:2；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例5
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将45份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入6份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉28份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶的混合物，其质量比为3:1:2；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例6
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为短小芽孢杆菌；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将45份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入6份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉28份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶的混合物，其质量比为3:1:2；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例7
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将45份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入6份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉28份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；所述复合酶制剂为淀粉酶和纤维素酶的混合物，其质量比为3:2；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例8
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将45份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入6份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉28份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；所述复合酶制剂为甘露聚糖酶；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例9
一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，具体制备工艺步骤包括：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为2%、3%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵24h；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为3%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵18h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.8倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉；
（6）制备牡蛎粉颗粒，先将45份牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（7）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入6份环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（8）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例益生菌发酵菌粉28份、维生素3份、褐藻多糖1.8份加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（9）混合后在60～65℃下加热、超声振荡2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
实施例10
实验动物：南美白对虾；
地址：青岛贝宝海洋科技有限公司琅邪养殖基地；
实验组：分别采用实施例1-9、对比例1-2所述的饲料添加剂按0.5%的比例添加到饲料中，混合均匀，进行投喂，其中对比例1为空白对照组，饲料中不添加饲料添加剂，对比例2添加的饲料添加剂好氧发酵中不添加芽孢杆菌；
每组实验设3个平行，池子大小为4.2×5.4×1.2m，每池投放20000尾虾苗，喂养时间3个月。酶活力指标：每个池子随机选取10头虾，检测超氧化物歧化酶（SOD）和溶菌酶的含量（由上海通蔚实验室有限公司检测）；
经检测，各实验组的有关实验结果如表1所示：
表1 养殖实验结果
上述实验结果表明，实施例1饲料添加剂可以显著促进南美白对虾的生长，并提高超氧化物歧化酶和溶菌酶的含量，与空白对照组（对比实施例1）相比，差异极显著；实施例2-3实验结果表明当改变饲料添加剂的原料组成会显著降低饲料添加剂的增强免疫作用效果，特别是实施例2实验结果表明当添加剂原料不含复合酶制剂时，尽管在原料中添加了褐藻多糖，但作用效果与实施例1差异显著；实施例4-6实验结果表明，当芽孢杆菌为单一的枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或短小芽孢杆菌时，添加剂的免疫增强功效受到严重影响，与不含芽孢杆菌的对照组（对比实施例2）相比，差异不显著，特别是短小芽孢杆菌实验组（实施例6），出现了负效应；实施例7-9实验结果表明，复合酶制剂的组成对添加剂的免疫增强功效影响显著，淀粉酶、纤维素酶和甘露聚糖酶具有显著的协同增效作用，分析原因可能是甘露聚糖酶能够将褐藻多糖降解为活性更强的褐藻寡糖原因。综合比较，实施例1为本发明最佳实施例。
以上实施例仅用于说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对被发明进行了详细的说明，但对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而对这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述添加剂的原料质量份数组成为：益生菌发酵菌粉20～30份、牡蛎粉30～50份、环糊精5～10份、维生素2～5份、褐藻多糖1～2份、复合酶制剂0～10份。
2.根据权利要求1所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述添加剂的原料质量份数组成为：益生菌发酵菌粉28份、牡蛎粉45份、环糊精6份、维生素3份、褐藻多糖1.8份、复合酶制剂8份。
3.根据权利要求1所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述益生菌包括酿酒酵母、芽孢杆菌和乳杆菌的混合菌剂；所述酿酒酵母购于广东省微生物菌种保藏中心，编号为GDMCC2.167。
4.根据权利要求3所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的一种或几种的混合菌剂；所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌均够自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号分别为CGMCC1.2163、CGMCC1.0809和CGMCC1.3533。
5.根据权利要求3所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述乳杆菌为干酪乳杆菌，够自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；编号分别为CGMCC1.159。
6.根据权利要求1所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述所述益生菌发酵菌粉的制备工艺具体包括如下步骤：
（1）发酵液制备：按照质量百分比麸皮2%、豆粕2%、蛋白胨1%、玉米浆1%、磷酸二氢钾0.02%、磷酸氢二钾0.01%、硫酸镁0.02%、氯化钙0.01%，余量比为水的比例配制液体发酵液，调节pH至6.5～7.0；
（2）好氧发酵：接种酿酒酵母和芽孢杆菌种子液，接种量分别为1～2%、2～4%，控制发酵温度28～37℃，转速150～300rpm；在此发酵条件下发酵12～24h；
（3）厌氧发酵：好氧发酵结束后，接种乳杆菌菌粉，接种量为2～4%，发酵温度28～37℃，控温厌氧发酵12～24h；
（4）低温浓缩：厌氧发酵结束后对发酵液进行低温浓缩；
（5）吸附干燥：浓缩后用0.5～1.0倍质量比的麸皮吸附，在40～60℃鼓风干燥机中干燥，水分控制在8～10%，即得益生菌发酵菌粉。
7.根据权利要求6所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述芽孢杆菌种子液的制备工艺为：将活化后的芽孢杆菌接种至种子培养基，所述种子培养基的组分为：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母膏1%、硫酸镁0.01%、硫酸锰0.003%，pH6.5～7.0，在温度28～37℃、转速150～3000rpm条件下,培养16～24h，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL；所述芽孢杆菌活化的工艺为：采用本领域常用培养基LB固体培养基，在温度28～37℃条件下,培养16～24h；所述酵母菌种子液制备方法为：在无菌操作条件下，从酵母菌YDP斜面上用接种环挑取两环菌种，接种到500mL装300mLPDA液体培养基的三角瓶内，28℃～32℃，140r/min振荡培养24h后，然后按照上述工艺接种种子罐扩大培养制备酵母菌种子液，要求种子液的有效活菌数≥109cfu/mL。
8.根据权利要求6所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和短小芽孢杆菌中的混合菌剂，其接种比例为1:2:1。
9.根据权利要求1所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶中的一种或几种的混合物；最优的，所述复合酶制剂为淀粉酶、甘露聚糖酶、纤维素酶的混合物，其质量比为3:1:2。
10.根据权利要求1所述的一种提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂，其特征在于所述益生菌饲料添加剂的制备方法具体包括如下步骤：
（1）制备牡蛎粉颗粒，先将牡蛎壳粉进行超声震荡，分别形成40～80nm的颗粒；
（2）将牡蛎粉加入质量比10倍的去离子水，然后加入环糊精，搅拌分散均匀，得到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（3）将益生菌发酵菌粉、维生素、褐藻多糖、复合酶制剂按比例加入到牡蛎粉与环糊精的混合溶液；
（4）混合后在60～65℃下加热、超声振荡1～2h后，冷却、过滤、低温真空烘干，得到提高水产动物免疫力的益生菌饲料添加剂。
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