CN115137757A - 一种辅助降血糖的益生菌组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种辅助降血糖的益生菌组合物，该复合益生菌组合物主要包含有复合益生菌冻干粉，所述复合益生菌冻干粉包括有青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种构成的菌群。本发明可改善人体免疫反应并有助于预防肠道疾病，增强免疫功能，有助于调节免疫***功能，抑制病原菌的生长繁殖。
Description
技术领域
本发明涉及益生菌的领域，特别涉及一种用于改善糖尿病、辅助降血糖的益生菌组合物。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖症为特征的异质性代谢疾病，当胰腺不能产生足够的胰岛素或身体不能有效地使用它所产生的胰岛素时，就会导致糖尿病的发生。在过去的几十年里，糖尿病的发病率在全球范围内逐年增高，有研究显示其在中国不同地区的患病率可高达8.3％到12.7％。随着时间的推移，糖尿病也会损害患者的诸多身体***，进一步引发各种并发症。所以，糖尿病已成为全球健康面临的重大威胁之一，并给个人和国家带来相当大的经济和医疗负担。
糖尿病主要有1型和2型糖尿病(type 2diabetes mellitus，T2DM)两种类型，当自身反应性T细胞攻击胰岛β细胞导致胰岛素产生不足时，发生1型糖尿病；而以低度炎症、胰岛素抵抗和低度细胞衰竭为特征的2型糖尿病则是一种复杂的代谢性紊乱疾病。其中2型糖尿病又叫成人发病型糖尿病，占所有糖尿病患者的90％以上。研究表明，除了遗传因素在糖尿病易感性中发挥重要作用，还有许多决定因素可推动2型糖尿病的发展。其中，肠道微生物被认为是2型糖尿病病理生理学中一种新的、潜在的驱动因素。
随着近年来高通量测序和宏基因组分析技术以及无菌设施和无菌小鼠的应用，对肠道微生物群的信息也有了更加全面的认识，肠道微生物群的改变与患者和动物模型的疾病发展有密切联系。研究表明，每一个人的肠道微生物组成不仅是独特的，而且也可能是疾病风险的一个预测因子，肠道微生物群可能导致肥胖和2型糖尿病等代谢疾病的发展，选择特定的肠道细菌菌株对肠道微生态的平衡进行调节是一种很有前景的治疗方法。如专利申请202110878469.5公开了一种肠道宏观基因组特征作为二型糖尿病患者的粪菌移植疗效筛选标志，所述肠道微生物宏基因特征为Rinkenellaceae科和Anaerotruncus属肠道菌群，根据这些特定肠道菌群标志物的表达水平，来选择适合粪菌移植治疗的二型糖尿病患者。根据此肠道菌群生物标志物和不同的检测技术平台，设计开发相应的检测试剂盒。此***和产品可用于基于个体化的二型糖尿病精准治疗。
然而，通过药物单一的治疗手段并不能达到很好的治疗效果，在实际的治疗过程中，往往需要辅助的治疗手段。是或多或少因此，在常规药物进行治疗的基础上，选择一些患者易于接受的辅助治疗手段，如食用益生菌、益生元和合生元，可通过改善肠道微生物平衡和改变结肠微生物的组成来改善患者症状，达到辅助治疗2型糖尿病的目的。
发明内容
为解决上述问题，本发明的首要目的是提供一种辅助降血糖的益生菌组合物，该益生菌组合物在常规药物进行治疗的基础上，选择一些患者易于接受的食用益生菌、益生元和合生元，可通过改善肠道微生物平衡和改变结肠微生物的组成能有效缓解2型糖尿病症状，达到辅助治疗2型糖尿病的目的。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种辅助降血糖的益生菌组合物，该复合益生菌组合物主要包含有复合益生菌冻干粉，所述复合益生菌冻干粉包括有青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种构成的菌群。
申请人在经过深入的研究工作之后，发现上述菌种所构成的特定的益生菌菌株，能够形成良好的益生菌环境，对肠蠕动具有刺激作用，抑制病原菌的生长繁殖，从而改善人体免疫反应并有助于预防肠道疾病。
进一步，青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种，按照配比1：0.5：1.5：1：0.5：0.5：1.5：1.5：1：1配置益生菌。
进一步，所述益生菌组合物还包括D-甘露糖醇、抗性糊精、硬脂酸镁。
其中，D-甘露糖醇：目前唯一用于在临床上的糖质营养素，具有低热量、低甜度，可代替食糖用于糖尿病、肥胖症患者的特殊食品，也是口香糖添加剂。
所述益生菌组合物，进一步包括维生素C和抗性糊精，以使益生菌组合物的稳定性较好。
其中，维生素C：是一种临床常用的水溶性维生素，具有抗氧化和增强机体免疫力的作用，提高肠道粘膜屏障防御功能，并能够提高肠道内有益菌比例。
抗性糊精：是具有代表性的低粘度水溶性膳食纤维，因含有消化酶难以消化的成分，不会被消化道消化吸收，能够直接进入肠道被肠道内的微生物发酵利用，具有降低血糖与调节血脂、调整肠道环境、控制体重，预防肥胖等功能。
更进一步，所述青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种，按照配比1：0.5：1.5：1：0.5：0.5：1.5：1.5：1：1配置益生菌，将其混合均匀，再与D-甘露糖醇、抗性糊精、硬脂酸镁按照D-甘露糖醇：抗性糊精：硬脂酸镁＝0.5：2：0.2的比例进行混合，包装成产品。
本发明采用青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种构建益生菌组合物，这些菌群均为人体肠道内的有益菌，可使用于一般食品类，具有刺激肠蠕动，可改善人体免疫反应并有助于预防肠道疾病，增强免疫功能，有助于调节免疫***功能，抑制病原菌的生长繁殖。
附图说明
图1为本发明加速试验活性变化示意图。
图2为本发明益生菌对STZ小鼠的影响示意图。
图3为本发明小鼠粪便菌群丰度图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明所制作的辅助降血糖的益生菌组合物，该复合益生菌组合物主要包含有复合益生菌冻干粉，还包括D-甘露糖醇、抗性糊精、硬脂酸镁；所述复合益生菌冻干粉包括有青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种构成的菌群。
其中，青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种，按照配比1：0.5：1.5：1：0.5：0.5：1.5：1.5：1：1配置益生菌。将其混合均匀，再与D-甘露糖醇、抗性糊精、硬脂酸镁按照D-甘露糖醇：抗性糊精：硬脂酸镁＝0.5：2：0.2的比例进行混合，包装成产品。
实验部分(Ⅰ)：保质期试验。
为了确保本产品活菌活性保存，以及探究维生素C和抗性糊精是否对菌群活性有保护作用，将本实验分为两组，第一组为不添加维生素C和抗性糊精组，第二组为本产品含维生素C和抗性糊精组，将两组放在37℃的恒温箱中保存4个月，湿度为45～66％条件下，进行食品储存期(保质期)加速测试(ASLT)，分别在第14d、1m、2m、3m、4m测量其活性，此结果表明，如图1所示，在加速试验下，不含有维生素C和抗性糊精组的活性在14天后开始下降，在1一个月后达到稳定，活菌率保持在10*9的数量级上，而含有维生素C和抗性糊精组稳定性较好，在第4个月不含有维生素C和抗性糊精组活性为1.69*109，而含有维生素C和抗性糊精活性为6.69*109，两组之间存在极显著差异(P<0.01)。可能是由于添加维生素C和抗性糊精后能够降低产品的水活度，起到让产品更加稳定的作用。
实验部分(Ⅱ)：益生菌对糖尿病小鼠影响。
将24只7周龄的雄性昆明小鼠随机分为3组，每组8只，实验分为正常组，造模组，益生菌治疗组。在实验室在通风笼进行为其一周的适应，自由饮食和饮水。适应性饲养1周后，给予模型组和益生菌治疗组连续5天腹腔注射STZ(链脲佐菌素40mg/kg)处理，正常组连续5天腹腔注射生理盐水做对照组处理。经过连续5天腹腔注射后，待小鼠血糖稳定一周，对小鼠进行尾静脉取血测量其血糖。待小鼠血糖≥11mmol/L并稳定超过两周，即认为造模成功。造模成功后，治疗组每天给予200μL上述益生菌复合物进行治疗。每天记录各组小鼠的血糖、体重和粪便葡萄糖浓度。在7周后收集小鼠粪便，使用QIAamp Fast DNA Stool MiniKIT(QIAGEN)试剂盒提取DNA样本，基于16S rRNAV3-V4区段进行PCR文库构建，通过Illumina HiSeq2500仪器进行高通量测序，对测序数据通过Usearch进行OTU聚类分析，以获得菌群丰度和组成信息。
其中，小鼠腹腔注射用1ml的注射器，配合4号针头；腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。进针的动作要轻柔，防止刺伤腹部器官；腹腔注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，从腹部一侧进针，穿过腹中线后在腹部的另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。
然后，将新的直线灌胃针头适量弯曲，角度与鼠食道生理弯曲度相似即可；左手保定动物，右手持注射器，注射器的刻度朝前；灌胃针头从动物嘴角进入，压住舌头，抵住上颚，轻轻向内推进；将灌胃针沿咽后壁慢慢***食道，回抽注射器无空气逆流方可注入益生菌；观察鼠的反应，如无过度挣扎，可尝试推注益生菌，如阻力较小可推注所有益生菌，如阻力过大或动物反应剧烈，呼吸受阻，退针后***；松开小鼠，观察动物呼吸，如无呼吸异常，确定灌胃成功。
对糖尿病的治疗效果评价的直接指标是血糖值和体重因此，在造模成功开始治疗之后，每隔一段时间检测各组小鼠的血糖值、粪便葡萄糖浓度以及体重。在图2中如图A所示，正常对照组的小鼠体重比较稳定，第7周达到50g。造模组(STZ)小鼠体重逐渐减轻(p＜0.05)，第7周为32g，益生菌治疗组(STZ+P)小鼠体重得到缓解，第7周上升至41g，和造模组存在明显差异；如图B所示，正常组小鼠的粪便葡萄糖浓度维持正常值2mmol/L，造模组(STZ)和益生菌治疗组组(STZ+P)的粪便葡萄糖浓度在第三周达到了4mmol/L，造模组(STZ)且有逐渐上升的趋势，治疗组(STZ+P)小鼠的粪便葡萄糖浓度在第三周开始下降，第七周降至正常浓度。如图C所示，正常组小鼠维持正常血糖水平，而造模组(STZ)和益生菌治疗组(STZ+P)小鼠血糖值逐渐攀升，第四周开始维持在20mmol/L，但是益生菌治疗组(STZ+P)小鼠血糖值在经过治疗后血糖值得到缓解，逐渐有降低的趋势，和造模组(STZ)存在明显的差异，以上结果表明，上述益生菌复合物的治疗一定程度上缓解了STZ诱导的糖尿病模型小鼠的病情。
7周后收集了小鼠的粪便，同时结合高通量测序进一步从菌群相对丰度进行评估，根据图3(图3中，注：N代表正常组小鼠，DM代表糖尿病造模组小鼠，Treatment代表益生菌治疗组)，发现糖尿病组Sphingomonas和Alistipes属相比正常小鼠相对丰度增加，Lachnospiraceae和Bifidobacterium属相对分度减少，而经过益生菌治疗组的小鼠Sphingomonas和Alistipes属相比正常小鼠相对丰度减少，而Bifidobacterium属相对丰度增加。Bifidobacterium属的细菌作为人和动物肠道菌群的重要组成成员之一，能抑制人体有害细菌的生长，抵抗病原菌的感染，合成人体需要的维生素，促进人体对矿物质的吸收，产生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有机酸刺激肠道蠕动，防止便秘以及抑制肠道腐败作用、净化肠道环境、刺激人体免疫***，从而提高抗病能力等方面有着重要作用。
本实验中，糖尿病造模组小鼠粪便中双歧杆菌和乳酸菌属较少，而本产品中主要是双歧杆菌和乳酸菌，所以治疗组中乳酸菌属的相对丰度较多，益生菌通过改变肠道菌群的丰度，从而辅助改善糖尿病症状。
实验部分(Ⅲ)：益生菌辅助二甲双胍改善糖尿病患者。
招募54名糖尿病患者进行研究，他们的基本特征显示在表1中。随机分为2组，治疗组和安慰剂组，进行为期60d的益生菌组和安慰剂干预，每30d测一次空腹血糖和糖化血红蛋白。益生菌组实验人员在标准二甲双胍治疗前提下，加服该益生菌。安慰剂组患者在标准二甲双胍治疗基础上，加服对应安慰剂，分组对象均给予糖尿病饮食及活动执导，了解患者基本信息及病史，采集患者身高、体重、围腰并计算BMI，安慰剂组接受仅有麦芽糊精的制剂。
血液采集：
采集志愿者0d、30d、60d餐前血液样本到真空采血管中，3000rpm离心10min，离心后取血清收集空腹血糖浓度和糖化血红蛋白，并使用全自动生化分析测定其指标。
根据表2得知，在经过30d益生菌治疗后，与安慰剂组在空腹血糖和糖化血红蛋白上存在显著差距(P＜0.05)，益生菌治疗组比安慰剂组平均空腹血糖少0.27/mmol·L，并且经过60d益生菌治疗后，与安慰剂组在空腹血糖和糖化血红蛋白上存在显著差距(P＜0.001)，并且差距拉大，加入益生菌治疗组空腹血糖相比安慰剂组少1.32mmol·L，加入益生菌治疗组的糖化血红蛋相比安慰剂组少0.48％。有研究发现二甲双胍的作用位置以肠道为主，而静脉注射二甲双胍无法调节人类血糖。这可能由于二甲双胍的降血糖作用与调节肠道菌群中的部分物种有关，该益生菌复合物能协助二甲双胍发挥降糖作用。这些菌群均为人体肠道内的有益菌，具有刺激肠蠕动，可改善人体免疫反应并有助于预防肠道疾病，增强免疫功能，有助于调节免疫***功能，抑制病原菌的生长繁殖。通过上述研究也发现，加入该复合益生菌能显著增强二甲双胍的降血糖作用。
表1糖尿病患者基本信息
表2主要测定指标
试验数据采用SPSS 22.0Univariate方法单因素分析，对F检验达到显著水平的因子，并进行方差分析并进行Duncan氏多重比较，各组试验数据均以(平均值±标准差)表示。
统计显著性水平为P<0.05，极显著性水平为P<0.01。
试验所涉及的器材包括高速离心机、移液枪、生物安全柜、血液生化仪、电子天平、涡旋振荡器、灌胃针、1ml注射器均是采用现有技术实现，在此不再赘述。
由上述试验可知，本发明所实现的复合益生菌能够通过调节肠道菌群，配合二甲双胍使用进而改善糖尿病人的血糖指标。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种辅助降血糖的益生菌组合物，其特征在于该复合益生菌组合物主要包含有复合益生菌冻干粉，所述复合益生菌冻干粉包括有青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种构成的菌群。
2.根据权利要求1所述的辅助降血糖的益生菌组合物，其特征在于青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种，按照配比1：0.5：1.5：1：0.5：0.5：1.5：1.5：1：1配置益生菌。
3.根据权利要求2所述的辅助降血糖的益生菌组合物，其特征在于所述益生菌组合物还包括D-甘露糖醇、抗性糊精、硬脂酸镁。
4.根据权利要求3所述的辅助降血糖的益生菌组合物，其特征在于所述青春双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、两岐双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜热链球菌，德氏乳杆菌保加利亚亚种，按照配比1：0.5：1.5：1：0.5：0.5：1.5：1.5：1：1配置益生菌，将其混合均匀，再与D-甘露糖醇、抗性糊精、硬脂酸镁按照D-甘露糖醇：抗性糊精：硬脂酸镁＝0.5：2：0.2的比例进行混合，包装成产品。
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