CN113215020B - 罗氏菌mgb-2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物生产丁酸技术领域。本发明提供的罗氏菌(Roseburia sp.)MGB‑2，其保藏编号为CGMCC No.1.31010，其具有产丁酸能力，因此属于丁酸产生菌(Faeciroseburia intestinalis)。本专利的罗氏菌(Roseburia sp.)MGB‑2能显著控制体重、改善血糖、血脂等代谢综合症疾病，可以用于制备治疗糖尿病、降血脂、肥胖及炎症性肠病的药品、保健品或食品。

Description

罗氏菌MGB-2及其应用
技术领域
本发明涉及微生物生产丁酸技术领域。
背景技术
代谢疾病是由于体内代谢紊乱而发生的疾病的总称。代谢疾病通常是由碳水化合物、脂质、蛋白质、维生素、电解质、水等的失衡而引起的。代谢疾病的实例包括肥胖症、高血糖、高血脂症、动脉硬化症、高血压、非酒精性脂肪性肝病等。随着社会的发展，人们生活水平的不断提高和饮食结构的调整，饮食呈富余化趋势，导致代谢类疾病的发病率不断提高，其中以肥胖、高血糖以及高血脂最引人关注。肥胖是一系列疾病的诱导因子，如高血压、高血糖、冠心病、胆囊病、骨关节炎、睡眠中呼吸窒息。目前全世界糖尿病人数为2亿人左右，并以惊人的速度每年递增。中国糖尿病人数为4千万，占世界糖尿病人群总数的1/5。另外，因血脂升高导致的动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病发病率逐年升高，并有年轻化趋势。降血糖、降血脂药品已经成为药品研究的重点之一。
肠道微生物参与营养物质的消化和降解，维持消化道的完整性，刺激宿主免疫***和调节宿主代谢。近年来，肠道微生物与某些疾病(包括糖尿病、心血管疾病、肥胖和炎症性肠病之间的关系已被确认，也开发出了一些益生菌。益生菌从发展到临床应用经历了多年的开发与探索，益生菌的类别、作用机制逐渐清晰，临床应用越发广泛，涉及内容包括脏器保护、免疫、抑菌、降血脂、降血糖、控制体重等。
丁酸产生菌是肠道中的一类重要的功能基石菌株，并且部分研究表明其在肠道内的含量在糖尿病、肥胖、***炎症患者中降低，已知的丁酸产生菌有酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum)，罗斯拜瑞氏菌(Roseburia intestinalis)等少数几个种，本发明提供一种丁酸产生能力强的新的丁酸产生菌。
乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸在下消化道中由主要来自食物的难消化性糖质通过肠内细菌发酵而产生。短链脂肪酸不仅作为大肠粘膜上皮细胞的主要能量源被利用，还显示多的生理作用。特别是丁酸，是结肠能量的首选来源，对上皮细胞的增殖有促进作用、抗炎症作用、肠道的运动促进作用等多样的生理活性。此外，丁酸对炎症性肠病具有预防和治疗的作用。
发明内容
本发明的第一目的是公开了罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2，其保藏编号为CGMCCNo.1.31010，该菌株已于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.1.31010，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的第二目的是公开了罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2，其具有产丁酸能力。
本发明第三目的是公开了罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2在制备用于预防和/或治疗代谢性疾病或炎症性肠病的药品、保健品或食品中的应用。
进一度地，所述的代谢性疾病包括肥胖、糖尿病、高血糖和高血脂。
进一步地，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎、克罗恩病。
本发明提供的菌株可以显著控制体重、改善血脂、改善血糖、维护肠道屏障完整性、缓解肠道炎症，可以用于治疗肥胖、高血糖、高血脂的药品或食品中。
附图说明
图1是罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2的显微镜下形态图。
图2是罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2体内外产丁酸图。
图3是罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2作用ob/ob小鼠后的肝脏病理切片图。
图4是罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2对ob/ob小鼠肠道炎症及肠道屏障的影响图。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究和实验，发现一株丁酸产生菌(Faeciroseburiaintestinalis)具有预防和治疗代谢相关疾病(包括肥胖、高血糖、高血脂、炎症性肠病)的作用，将含有丁酸产生菌(Faeciroseburia intestinalis)的活性菌剂饲喂实验对象ob/ob小鼠，发现该菌剂能够抑制体重增加，降低血糖，降低血脂、改善肠道炎症、维护肠道屏障完整性，有效减轻糖尿病及肥胖等病症。
本发明提供了丁酸产生菌(Faeciroseburia intestinalis)在治疗和预防代谢和炎症性肠病等相关疾病方面的用途。
根据本发明的一个优选例，经丁酸产生菌(Faeciroseburia intestinalis)菌株来治疗的肥胖模型ob/ob小鼠，与未受治疗的对照组相比，可保持体重增加缓慢，且有助于血糖、血脂下降，肠道炎症症状的改善。因此，所述丁酸产生菌(Faeciroseburiaintestinalis)能够用以预防和治疗肥胖及由肥胖引起的疾病如糖尿病、炎症性肠病等。
本发明菌剂可以以药品片剂、针剂或胶囊的任一种形式给药，所述药品制剂包括赋形剂、药品允许的媒介和载体，这些物质可根据给药途径进行选择。本发明中的药品制剂还包含辅助的组分。
其中，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等都可用作本发明中药品的载体、赋形剂或稀释剂等。
此外，本发明的药品菌剂进一步包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬乳液稳定剂、防腐剂、甜味剂和香料等。本发明的药品菌剂可通过多种公知的方法以肠衣制剂生产，以便于药品组合物的活性成分即微生物能顺利通过胃而不被胃酸所破坏。
本发明的药品制剂可制成肠衣片供口服使用。
本发明中的“肠衣”包括所有常规药品允许使用的包衣，这些包衣不被胃酸降解，但在小肠中能充分分解并快速释放出本发明的微生物。
本发明的肠衣能在合成胃酸如pH＝1的HCl溶液中36-38℃维持2小时以上，并优选在合成肠液如pH＝7.0的缓冲液中在1.0小时内分解。
本发明的肠衣以每片约16-30mg进行包衣，较佳地16-25mg，更佳地16-20mg进行包衣。本发明中肠衣厚度为5-100μm，理想的厚度为20-80μm，肠衣成分自己公开知晓的常规聚合物。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2的采集、分离、鉴定、纯化
采用无菌操作，取ob/ob小鼠新鲜粪便50mg，置于盛有9mL无菌生理盐水的玻璃试管中，充分震荡摇匀，然后吸取0.5mL混合液于盛有4.5mL无菌生理盐水的试管中，此稀释度为10-1，重复以上过程作10倍比稀释，至10-6稀释度，选择10-4，10-5，10-6三个稀释度，吸取0.1mL菌液滴于MRS培养基平板上，平板涂布后采用厌氧培养法(5％CO2)将涂好的培养皿置37℃培养箱培养48h。
所述MRS培养基成分为牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，蛋白胨10.0g，葡萄糖(或其他糖)20.0g(最好单独作过滤灭菌，并于使用前混入培养基中)，K2HPO4 2.0g，醋酸钠5.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，吐温80 1.0g，柠檬酸三铵2.0g，琼脂15.0g，加蒸馏水至1 000ml。灭菌前pH为6.2～6.6。
采用四分区划线法，用接种环挑取形态不同的菌落在MRS琼脂培养基上进行划线分离培养，经48h培养后，在四分区中挑取分离效果好的菌落用接种环接种于MRS斜面培养基上作纯培养，重复传代培养3次，而后置于4℃冰箱保存备用。
对纯培养进行16S rRNA测序确定菌种，序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。与NCBI数据库Blast比对后，鉴定为Roseburia sp.，其对应中文名称为罗氏菌，命名为MGB-2，该菌株已于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.1.31010，该保藏中心简称为CGMCC，该保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号；罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2CGMCC No.1.31010具有产丁酸能力，因此属于丁酸产生菌(Faeciroseburia intestinalis)，在本专利实施例中及附图标注中简写为FI，显微镜下形态如图1所示。
实施例2
罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2的基因组分析和产丁酸功能解析
材料与方法：
被测菌株MGB-2为丁酸产生菌(Faeciroseburia intestinalis)，(简写：FI)，对FI进行基因组分析，KEGG数据库注释，发现具有完整的丁酸产生途径(图2A)。
在YCFA培养基中厌氧培养，菌株体外培养24小时后，取菌液1ml，超声破碎5min，室温离心5000g 5min，取上清液过滤后，进样GC-MS分析菌液短链脂肪酸含量。
结果：菌株MGB-2具有显著的产丁酸能力(图2B)，改变ob/ob小鼠粪便的短链脂肪酸组成(图2C)。
表1.丁酸含量表
Figure BDA0002946496780000051
实施例3
罗氏菌(Roseburia sp.)MGB-2对肥胖、糖尿病模型小鼠ob/ob血糖、血脂及体重影响
材料：
被测菌株为：菌株MGB-2。
灌胃菌株MGB-2量定为0.15mL/10g体重，菌株MGB-2浓度为1×107cfu/mL，浓缩后浓度为1×109cfu/mL，频率为每日一次。
菌株MGB-2液需提前培养，每周活化保证新鲜，并分别测定浓度。
Ob/ob小鼠购自中国医学科学院北京协和医学院动物研究所，温度20-24摄氏度，恒湿50-60％，光照12小时(8:00-20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。
血糖试纸(三诺生物传感股份有限公司)、血糖仪(三诺生物传感股份有限公司)、血清总胆固醇TC试剂盒(货号A111-2-1)，低密度脂蛋白LDL-C试剂盒(货号A113-1-1)，高密度脂蛋白HDL-C试剂盒(货号A112-1-1)，甘油三酯TG试剂盒(货号A110-2-1)购自南京建成生物工程研究所。
方法：雄性C57BL/6J小鼠6-8周，体重25-28克，10只，作为正常对照组(1)；雄性ob/ob小鼠6-8周，体重40-42克，测定空腹血糖，依据血糖值和体重情况平均分组：(2)模型对照组，(3)菌株MGB-2 1×109cfu/mL(简写：FI)，(4)灭活菌株MGB-2 1×109cfu/mL(简写：KFI)，每组10只，连续给菌4周。
模型对照组给予等量的厌氧PBS。各组小鼠分别灌胃给与0.15mL/10g体重的菌株MGB-2菌液，连续4周。分别计算各组小鼠体重数据，如表2数据。
表2菌株MGB-2对肥胖小鼠ob/ob的体重影响
Figure BDA0002946496780000061
冰上取肝脏，并迅速放入***中固定，准备组织切片，做HE染色和油红染色肝脏病理切片(图3)。
口服葡萄糖耐量实验(OGTT)：OGTT是一种葡萄糖负荷试验，用以了解胰岛β细胞功能和机体对血糖的调节能力。动物禁食12后，测0分钟基础血糖后灌胃给予葡萄糖2g/kg，自鼠尾静脉采血用三诺安准型血糖仪测定给予葡萄糖后40，80，120min血糖，如表3数据；绘制血糖-时间曲线，并根据各个时间点中血糖值计算各组曲线下面积(AUC)，如表3数据。
表3菌株MGB-2对肥胖小鼠ob/ob的糖耐量的影响
Figure BDA0002946496780000062
胰岛素耐量实验(ITT)：动物禁食8后，测0分钟基础血糖后腹腔注射胰岛素0.6U/kg，自鼠尾静脉采血用三诺安准型血糖仪测定胰岛素注射后40，80，120min血糖，如表4数据；绘制血糖-时间曲线，并根据各个时间点中血糖值计算各组曲线下面积(AUC)，如表4数据。
表4菌株MGB-2对肥胖小鼠ob/ob的胰岛素耐量的影响
Figure BDA0002946496780000063
Figure BDA0002946496780000071
末次给菌株MGB-2后，麻醉处死小鼠，取血，4摄氏度3000rpm离心10min，测定血清总胆固醇TC，低密度脂蛋白LDL-C，甘油三酯TG，如表5数据。
结果：
(1)与对照组和模型组比较，菌株MGB-2可以显著控制体重，但灭活的菌株MGB-2不能显著降低体重，如表2数据所示，菌株MGB-2组显著降低了ob/ob肥胖小鼠的体重增加量86.2％。
(2)菌株MGB-2改善小鼠血糖情况，与模型组相比，菌株MGB-2组显著降低了ob/ob小鼠OGTT曲线下面积13.6％和ITT曲线下面积21.3％，结果见表3，4；菌株MGB-2可以改善小鼠血脂情况,与模型组相比，菌株MGB-2组显著降低了ob/ob小鼠，显著降低了血浆的甘油三酯3.7％,以及胆固醇21.1％，低密度脂蛋白胆固醇39.2％，结果见表5。
表5菌株MGB-2对肥胖小鼠ob/ob的血脂影响
Figure BDA0002946496780000072
实施例4
菌株MGB-2对肥胖模型小鼠ob/ob肠道炎症及肠道屏障完整性的影响
材料：被测菌株为：菌株MGB-2。
灌胃菌株MGB-2菌量定为0.15mL/10g体重，菌株MGB-2菌浓度为1×107cfu/mL，浓缩后浓度为1×109cfu/mL，频率为每日一次。
菌株MGB-2菌液需提前培养，每周活化保证新鲜，并分别测定浓度。
Ob/ob小鼠购自中国医学科学院北京协和医学院动物研究所，温度20-24摄氏度，恒湿50-60％，光照12小时(8:00-20:00)，隔音，自由摄食、饮水，适应环境一周后进行实验。
方法：雄性C57BL/6J小鼠6-8周，体重25-28克，10只，作为正常对照组(1)，雄性ob/ob小鼠6-8周，体重40-42克，测定空腹血糖，依据血糖值和体重情况平均分组：(2)模型对照组，(3)菌株MGB-2 1×109cfu/mL，(4)灭活菌株MGB-2 1×109cfu/mL，每组10只，连续给菌4周。
模型对照组给予等量的厌氧PBS。各组小鼠分别灌胃给与0.15mL/10g体重的菌液，连续4周。给菌四周后，麻醉处死小鼠，取肠组织和血。
测定指标：
1)回肠病理切片AB-PAS染色。
2)测定血浆中的炎症因子脂多糖(LPS)和肿瘤坏死因子(TNF-α)。
3)测定小鼠回肠粘膜完整性基因muc1、muc5和紧密连接蛋白Zo-1、Occludin的表达水平。
实验结果，与模型组比较，给予菌株MGB-2后能显著降低ob/ob小鼠的代谢综合征导致的肠道低浓度炎症所介导的炎症因子的表达(表6)，相应的回肠粘膜完整性基因表达上调，回肠紧密连接蛋白表达提高(表7)，结合回肠切片结果(图4)，可以看到给予菌株MGB-2干预后，肠道粘膜屏障厚度增加，肠道完整性提高，因此，菌株MGB-2可以改善肥胖小鼠肠道环境的慢性炎症维护肠道内环境稳态。
表6菌株MGB-2对肥胖小鼠ob/ob的血浆中炎症因子影响
Figure BDA0002946496780000081
表7菌株MGB-2对肥胖小鼠ob/ob的回肠中粘膜完整性和紧密连接蛋白相关基因表达的影响
Figure BDA0002946496780000082
序列表
<110> 中国科学院微生物研究所
<120> 罗氏菌MGB-2及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1423
<212> DNA
<213> 罗氏菌(Roseburia sp.)
<400> 1
ggctgcttac acatgcagtc gacgaagcac ggggacggaa gccctccggg gcggaaggcc 60
gcgtgactga gtggcggacg ggtgagtaac gcgtgggtaa cctgccccat acagggggat 120
aacagccgga aacggctgct aataccgcat gcacatgcgg gggcgcatgc ccctgcatgg 180
aaagctttcg cggtatggga tgggcccgcg tctgattagg cagttggcgg ggtaacggcc 240
caccaaaccg acgatcagta gccggcctga gagggcaacc ggccacattg ggactgagac 300
acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg gggaaccctg 360
atgcagcgac gccgcgtggg tgaaggagta tttcggtatg taaagcccta tcagcaggga 420
agaacaatga cggtacctga ctaagaagca ccggctaaat acgtgccagc agccgcggta 480
atacgtatgg tgcaagcgtt atccggattt actgggtgta aagggagcgc aggcggcgcg 540
ttaagcctgg tgtgaaagcc cgcggcccaa ccgcgggact gcattggaac tggcgcgctg 600
gagtgccgga ggggtaggcg gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag atattaggag 660
gaacaccagt ggcgaaggcg gcctactgga cggtgactga cgctgaggct cgaaagcgtg 720
gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacggtgaa tactaggtgt 780
cgggccccat tgggggccgg tgccgcagca aacgcagtaa gtattccacc tggggagtac 840
gttcgcaaga atgaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg 900
gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggccttg acatctgcct gacagggtat 960
gtaatgtacc ttccctccgg ggcaggcaag acaggtggtg catggttgtc gtcagctcgt 1020
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cctgcccaca gtagccagcg 1080
cgcaaaggcg ggcactctgt ggggactgcc agggacaacc tggaggaagg tggggatgac 1140
gtcaaatcat catgcccctt atggcctggg ctacacacgt gctacaatgg cgtaacagag 1200
ggaggcgaag ccgcgaggcg gagcaaaccc caaaaataac gtcccagttc ggactgcagc 1260
ctgcaacccg gctgcacgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagaa tgccgcggtg 1320
aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagccgg gaatgcccga 1380
agtcagtggc ccaaccgcaa ggggggagct gccgaagcag ccc 1423

Claims (4)

1.罗氏菌（Roseburia sp.）MGB-2，其保藏编号为CGMCC No. 1.31010。
2.罗氏菌（Roseburia sp.）MGB-2在制备用于预防和/或治疗代谢性疾病或炎症性肠病的药品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的代谢性疾病包括肥胖、糖尿病、高血糖和高血脂。
4.根据权利要求2所述的应用，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎、克罗恩病。
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