CN116509783B - 一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品或化妆品原料技术领域，公开了一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物及其制备方法和应用。本发明在第一次提取的时候提取出铁皮石斛原有的可溶性成分，第二次提取是通过采用鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母菌两种益生菌组合发酵将铁皮石斛中难溶的大分子降解为易溶的小分子，使得铁皮石斛中的活性成分能被充分提取出来。本发明不加入有机溶剂、严格控制温度、采用冷冻干燥的方式脱去水分，能避免铁皮石斛活性成分变性失活，使得新鲜铁皮石斛中的活性成分能全面地保留在产品中。铁皮石斛提取物能够很好的应用于制备具有促成纤维细胞合成胶原蛋白功能的食品或化妆品。

Description

一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于食品或化妆品原料技术领域，特别涉及一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物及其制备方法和应用。
背景技术
铁皮石斛是一种兰科草本植物，在中医药领域被视为滋阴极品。铁皮石斛属于中国国家重点二级保护野生植物，商品化的铁皮石斛主要来源于人工栽培。人工栽培的铁皮石斛模仿野生环境，以气生根附生于树木或岩石上种植，不能用泥土种植。铁皮石斛虽然已经实现人工栽培，但由于特殊的种植条件以及缓慢的生长速度，它仍然属于名贵中草药。
铁皮石斛活性成分的提取技术已日趋成熟，有多种提取方法，但都以热水提取为主要步骤。由于铁皮石斛富含粗纤维，石斛多糖粘稠，使得现有提取方法基本都存在使用溶剂量大、目标有效成分损失大的问题，这些问题进一步地又导致了纯化或浓缩工艺成本高。
近年来的研究表明，铁皮石斛中的活性成分包括多糖、多酚、糖蛋白等物质，其中以石斛多糖为主。《中国药典》记载铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热之功效，但是现有的铁皮石斛相关专利都没有通过实验来表征铁皮石斛的“滋阴”功效。现有的铁皮石斛提取技术专利，大多数都着眼于提高多糖的得率和纯度，但是并不能保证提取物还保有铁皮石斛原来的功效。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物的制备方法。
本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物。
本发明的又一目的在于提供一种上述促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)第一次提取：将0.8～1.2重量份新鲜铁皮石斛茎切段，投入5.6～8.4重量份100℃沸水中，混合，剪切搅拌使其均质化；用100～400目滤布，加0.2～0.4MPa压力过滤，得到石斛滤液和石斛滤渣；
(2)第二次提取：将0.016～0.024重量份葡萄糖、0.08～0.12重量份甘露醇和5.184～7.776重量份水混合后加热至100℃，加入步骤(1)所得石斛滤渣，搅拌均匀，降温至25～30℃；再加入0.16～0.24重量份鼠李糖乳杆菌种子液和0.16～0.24重量份酿酒酵母菌种子液，在25～30℃发酵6～12小时；发酵结束后，将发酵产物通过管式换热器在30秒内加热至90～110℃，维持10～30秒，然后在30秒内降温至80℃以下；然后用100～400目滤布，加0.2～0.4MPa压力过滤，得到发酵滤液和发酵滤渣；
(3)将步骤(1)所得石斛滤液和步骤(2)所得发酵滤液混合，用0.45μm滤膜过滤，得到混合滤液；
(4)将步骤(3)所得混合滤液置于冷冻干燥机中，干燥至水分质量含量低于6％，得到铁皮石斛提取物。
步骤(1)所述新鲜铁皮石斛茎为1重量份，所述100℃沸水为7重量份；步骤(2)所述葡萄糖为0.02重量份，所述甘露醇为0.1重量份，所述水为6.48重量份，所述鼠李糖乳杆菌种子液为0.2重量份，所述酿酒酵母菌种子液为0.2重量份。
步骤(1)所述切段是将新鲜铁皮石斛茎切成长度≤3cm的小段。
步骤(2)所述鼠李糖乳杆菌种子液按照以下步骤制备得到：将冻藏的鼠李糖乳杆菌菌种按接种量1％～4％接种到MRS液体培养基中，36～38℃、无氧或微氧条件下培养至菌浓度为1～9×108CFU/mL，得到鼠李糖乳杆菌种子液。
所述MRS液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸三铵2g/L，醋酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温1g/L，余量为水。
步骤(2)所述酿酒酵母菌种子液按照以下步骤制备得到：将冻藏的酿酒酵母菌菌种按接种量1％～4％接种到麦芽汁培养基中，25～30℃、有氧条件下培养至菌浓度为1～9×107CFU/mL，得到酿酒酵母菌种子液。
所述麦芽汁培养基的组成为：麦芽提取物40g/L，余量为水。
一种由上述的制备方法制备得到的促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物。所述铁皮石斛提取物的外观状态为白色或类白色冻干粉，具有铁皮石斛特殊气味；所述铁皮石斛提取物具有水溶性，其10g/100mL水溶液为黄色至红色粘稠液体，pH4～6；所述铁皮石斛提取物能发生酸碱变色反应，遇酸变红，遇碱变绿。
上述的促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物在制备具有促成纤维细胞合成胶原蛋白功能的食品或化妆品中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
1、本发明用促胶原蛋白合成活性来表征“滋阴”功效，在此基础上提供一种具有较高功效活性的铁皮石斛提取物。
2、本发明在第一次提取的时候提取出铁皮石斛原有的可溶性成分，第二次提取是通过发酵将铁皮石斛中难溶的大分子降解为易溶的小分子，使得铁皮石斛中的活性成分能被充分提取出来。
3、本发明第二次提取采用鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母菌两种益生菌组合发酵，产生的益生素(益生菌的代谢产物和灭活菌体)可以增加产品活性，这一点实施例6可以说明。
4、本发明技术方案不加入有机溶剂、严格控制温度、采用冷冻干燥的方式脱去水分，能避免铁皮石斛活性成分变性失活，使得新鲜铁皮石斛中的活性成分能全面地保留在产品中。这一点可以通过酸碱变色反应来体现，因为酸碱变色说明产品保留了具有活性的铁皮石斛花色苷(或花青素)，而花色苷(或花青素)是一类很不稳定的活性成分。
5、本发明整个提取工艺只用水作为溶剂，而且溶剂用量少，使得生产成本较低。
附图说明
图1为实施例1所制备的产品图。
图2为实施例1所制备的产品的10g/100mL水溶液图。
图3为实施例1所制备的产品的酸碱变色反应图。
图4为细胞中I型胶原蛋白的mRNA水平柱状图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1
本实施例为铁皮石斛提取物的制备，具体制备步骤如下：
(1)第一次提取：将1重量份新鲜铁皮石斛茎切成长度小于等于3cm的小段，投入7重量份100℃沸水中，混合，剪切搅拌使其均质化；用200目滤布，加0.3MPa压力过滤，得到大约5重量份石斛滤液和大约3重量份石斛滤渣；
(2)第二次提取：将0.02重量份葡萄糖、0.1重量份甘露醇和6.48重量份水混合后加热至100℃，加入步骤(1)所得石斛滤渣，搅拌均匀，降温至28℃；再加入0.2重量份鼠李糖乳杆菌种子液和0.2重量份酿酒酵母菌种子液，在28℃发酵9小时；发酵结束后，将发酵产物通过管式换热器在30秒内加热至100℃，维持20秒，然后在30秒内降温至80℃以下；然后用200目滤布，加0.3MPa压力过滤，得到大约9.5重量份发酵滤液和大约0.5重量份发酵滤渣；
(3)过滤：将步骤(1)所得石斛滤液和步骤(2)所得发酵滤液混合，用0.45μm滤膜过滤，得到混合滤液；
(4)冷冻干燥：将步骤(3)所得混合滤液置于冷冻干燥机中，干燥至水分质量含量低于6％，得到大约0.4重量份铁皮石斛提取物。
步骤(2)所述鼠李糖乳杆菌种子液按照以下步骤制备得到：将冻藏的鼠李糖乳杆菌菌种按接种量2％接种到MRS液体培养基中，37℃、无氧或微氧条件下培养至菌浓度为5×108CFU/mL，得到鼠李糖乳杆菌种子液。
步骤(2)所述酿酒酵母菌种子液按照以下步骤制备得到：将冻藏的酿酒酵母菌菌种按接种量2％接种到麦芽汁培养基中，28℃、有氧条件下培养至菌浓度为5×107CFU/mL，得到酿酒酵母菌种子液。
所述MRS液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸三铵2g/L，醋酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温1g/L，余量为水。
所述麦芽汁培养基的组成为：麦芽提取物40g/L，余量为水。
本实施例制备的铁皮石斛提取物，外观状态为类白色冻干粉(图1)，具有铁皮石斛特殊气味。
本实施例制备的铁皮石斛提取物，可溶于水，其10g/100mL水溶液为黄色至红色的粘稠液体(图2)，pH4.7。
本例制备的铁皮石斛提取物，能发生酸碱变色反应：10g/100mL铁皮石斛提取物溶液50μL与pH2缓冲液150μL混合，显红色；10g/100mL铁皮石斛提取物溶液50μL与pH7缓冲液150μL混合，显微紫色；10g/100mL铁皮石斛提取物溶液50μL与pH12缓冲液150μL混合，显绿色(图3)。
实施例2
本实施例为与本发明技术方案有偏差的铁皮石斛提取物的制备，其制备方法在实施例1的基础上删减发酵工艺，具体制备步骤如下：
(1)第一次提取：将1重量份新鲜铁皮石斛茎切成长度小于等于3cm的小段，投入7重量份100℃沸水中，混合，剪切搅拌使其均质化；用200目滤布，加0.3MPa压力过滤，得到大约5重量份石斛滤液和大约3重量份石斛滤渣；
(1)第二次提取：将0.02重量份葡萄糖、0.1重量份甘露醇、6.88重量份水混合后加热至100℃，加入步骤(1)所得石斛滤渣，搅拌均匀；然后用200目滤布，加0.3MPa压力过滤，得到大约8.5重量份滤液和大约2.5重量份滤渣；
(3)过滤：将步骤(1)所得石斛滤液和步骤(2)所得滤液混合，用0.45μm滤膜过滤，得到混合滤液；
(4)冷冻干燥：将步骤(3)所得混合滤液置于冷冻干燥机中，干燥至水分质量含量低于6％，得到大约0.3重量份铁皮石斛提取物。
本实施例制备的铁皮石斛提取物，外观状态为类白色冻干粉，具有铁皮石斛特殊气味。
本实施例制备的铁皮石斛提取物，可溶于水，其10g/100mL水溶液为黄色至红色的粘稠液体，pH5.8。
本实施例制备的铁皮石斛提取物，能发生酸碱变色反应：10g/100mL铁皮石斛提取物溶液50μL与pH2缓冲液150μL混合，显红色；10g/100mL铁皮石斛提取物溶液50μL与pH7缓冲液150μL混合，显微紫色；10g/100mL铁皮石斛提取物溶液50μL与pH12缓冲液150μL混合，显绿色。
实施例3
本实施例比较不同菌种组合发酵对产品的抗氧化活性的影响。
样品信息见表1。
表1抗氧化活性实验的样品信息
样品 菌种组合 制备方法
1 鼠李糖乳杆菌+酿酒酵母 同实施例1。
2 副干酪乳杆菌+酿酒酵母 在实施例1的基础上，将鼠李糖乳杆菌改为副干酪乳杆菌。
3 植物乳杆菌+酿酒酵母 在实施例1的基础上，将鼠李糖乳杆菌改为植物乳杆菌。
4 单一鼠李糖乳杆菌 在实施例1的基础上，删减酿酒酵母菌。
5 单一酿酒酵母菌 在实施例1的基础上，删减鼠李糖乳杆菌。
6 无 同实施例2。
抗氧化活性用超氧阴离子自由基清除率这个指标来表征。超氧阴离子自由基是人体内产生的一种活性氧自由基，人体通过超氧化物歧化酶(SOD)将其除去。超氧阴离子自由基清除率是表征SOD及其他抗氧化物活性的指标，采用连苯三酚自氧化法测定。
超氧阴离子自由基清除率测试方法：
(1)溶液配制
Tris-HCl溶液(0.05mol/L)：精确称取6.0575g Tris溶于水，定容至250mL；取25mLTris溶液加25mL 0.1mol/L HCl溶液，加水定容至100mL。
邻苯三酚溶液(3mmol/L)：精确称取0.0378g邻苯三酚，用水溶解定容至100mL。
(2)样品检测
准确吸取样品溶液(表1中的样品制备成浓度为1g/100mL的样品溶液)0.5mL置于试管中，加Tris-HCl溶液4.5mL，去离子水4mL。摇匀后室温静置10min，再加入邻苯三酚溶液0.3mL，混匀后立即测320nm吸光度。每30s计一次数，记录3min内的数值，求其变化斜率(Excel中的斜率函数是SLOPE)。以去离子水作为空白。
(3)计算
超氧阴离子自由基清除率计算公式：
式中：
K空白——空白管吸光度变化斜率；K样品——样品管吸光度变化斜率。
不同菌种组合发酵得到的铁皮石斛提取物的抗氧化测试结果见表2。
表2不同菌种组合对铁皮石斛提取物的抗氧化活性的影响
样品 菌种组合 超氧阴离子自由基清除率(1g/100mL样品溶液)
1 鼠李糖乳杆菌+酿酒酵母 45.00％
2 副干酪乳杆菌+酿酒酵母 25.57％
3 植物乳杆菌+酿酒酵母 10.75％
4 单一鼠李糖乳杆菌 10.11％
5 单一酿酒酵母 9.85％
6 无 9.06％
结果表明，鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母菌组合发酵能增加铁皮石斛发酵提取物的抗氧化活性。
实施例5
本实施例测试铁皮石斛提取物促胶原蛋白合成的活性。
样品信息见表3。
表3促胶原合成实验的样品信息
促胶原蛋白合成的测试方法参考标准《TSHRH 031-2020化妆品紧致、抗皱功效测试-体外成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白含量测定》。体外培养成纤维细胞NIH3T3，将药物作用于细胞24小时，测试细胞中I型胶原的mRNA水平。如果给药组的mRNA水平大于空白组(不给药)，则表示药物具有促胶原合成的活性。
测试结果见图4。结果表明，实施例1的产品在0.01g/L浓度下就有明显的促胶原蛋白合成的活性，在0.1g/L浓度下活性与阳性对照接近，在0.01～1g/L浓度范围内浓度与活性正相关；同在0.1g/L浓度下比较实施例1的产品、实施例2的产品以及买来的铁皮石斛多糖，实施例1的产品活性最高，其次铁皮石斛多糖，其次实施例2的产品。
实施例6
本实施例为实施例1、2所得产品的比较，具体见表4。
表4比较实施例1和实施例2
结果表明，实施例1在产出比、所得产品的抗氧化活性和促胶原蛋白合成的活性这几方面都比实施例2高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
（1）将0.8～1.2重量份新鲜铁皮石斛茎切段，投入5.6～8.4重量份100℃沸水中，混合，剪切搅拌使其均质化；用100~400目滤布，加0.2~0.4MPa压力过滤，得到石斛滤液和石斛滤渣；
（2）将0.016～0.024重量份葡萄糖、0.08～0.12重量份甘露醇和5.184～7.776重量份水混合后加热至100℃，加入步骤（1）所得石斛滤渣，搅拌均匀，降温至25~30℃；再加入0.16～0.24重量份鼠李糖乳杆菌种子液和0.16～0.24重量份酿酒酵母菌种子液，在25~30℃发酵6~12小时；发酵结束后，将发酵产物通过管式换热器在30秒内加热至90~110℃，维持10~30秒，然后在30秒内降温至80℃以下；然后用100~400目滤布，加0.2~0.4MPa压力过滤，得到发酵滤液和发酵滤渣；其中，
所述鼠李糖乳杆菌种子液按照以下步骤制备得到：将冻藏的鼠李糖乳杆菌菌种按接种量1%~4%接种到MRS液体培养基中，36~38℃、无氧或微氧条件下培养至菌浓度为1~9×108CFU/mL，得到鼠李糖乳杆菌种子液，其中，所述MRS液体培养基的组成为：蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，酵母浸粉4g/L，葡萄糖20g/L，磷酸二氢钾2g/L，柠檬酸三铵2g/L，醋酸钠5g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，吐温1g/L，余量为水；
所述酿酒酵母菌种子液按照以下步骤制备得到：将冻藏的酿酒酵母菌菌种按接种量1%~4%接种到麦芽汁培养基中，25~30℃、有氧条件下培养至菌浓度为1~9×107 CFU/mL，得到酿酒酵母菌种子液；所述麦芽汁培养基的组成为：麦芽提取物40g/L，余量为水；
（3）将步骤（1）所得石斛滤液和步骤（2）所得发酵滤液混合，用0.45µm滤膜过滤，得到混合滤液；
（4）将步骤（3）所得混合滤液置于冷冻干燥机中，干燥至水分质量含量低于6%，得到铁皮石斛提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述新鲜铁皮石斛茎为1重量份，所述100℃沸水为7重量份；步骤（2）所述葡萄糖为0. 02重量份，所述甘露醇为0.1重量份，所述水为6.48重量份，所述鼠李糖乳杆菌种子液为0.2重量份，所述酿酒酵母菌种子液为0.2重量份。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述切段是将新鲜铁皮石斛茎切成长度≤3cm的小段。
4.一种由权利要求1～3任一项所述的制备方法制备得到的促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物。
5.根据权利要求4所述的促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物，其特征在于：所述铁皮石斛提取物的外观状态为白色或类白色冻干粉，具有水溶性，其10g/100mL水溶液为黄色至红色粘稠液体，pH4~6；所述铁皮石斛提取物遇酸变红，遇碱变绿。
6.根据权利要求5所述的促胶原蛋白合成的铁皮石斛提取物在制备具有促成纤维细胞合成胶原蛋白功能的食品或化妆品中的应用。
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