CN116063563A - 一种融合抗原GLuc-p30及其制备方法、试剂盒和检测方法 - Google Patents

一种融合抗原GLuc-p30及其制备方法、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种融合抗原GLuc‑p30及其制备方法、试剂盒和检测方法，所述试剂盒包括：包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板、荧光素酶、融合抗原，非洲猪瘟抗体阳性血清，非洲猪瘟抗体阴性血清，荧光素酶底物、洗涤液，本发明通过慢病毒转导建立的稳定细胞株表达GLuc‑p30融合抗原，无需纯化，简化了抗原的准备过程，可以有效地检测样品中非洲猪瘟抗体，与符合国家标准非洲猪瘟抗体检测试剂盒的符合率达99％以上且有更好的检测灵敏性和特异性，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。

Description

一种融合抗原GLuc-p30及其制备方法、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明是关于一种血清学检测非洲猪瘟病毒抗体的方法，具体地说，是关于一种融合抗原GLuc-p30及其制备方法、试剂盒和检测方法，属于免疫检验技术领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的一种急性、烈性、高度接触性传染病，临床上以高热、网状内皮***出血和高死亡率为特征。自2018年8月，非洲猪瘟蔓延至我国各省市，但目前又缺少商品化的非洲猪瘟疫苗，针对该疫情只能选择清群扑杀和封锁，对我国养猪业造成严重的经济损失。非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)属于双链DNA病毒目中的非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属，也是该属的唯一成员。ASFV病毒颗粒含有囊膜并呈20面体对称，直径为175～215nm。ASFV基因组为末端共价闭合的单分子线状双链DNA，长度约170～190kb，末端碱基交互连接，形成发夹环。基因组含有约160～175个开放阅读框(ORF)，其中p30蛋白是其重要的结构蛋白之一，也是在病毒感染早期表达最多的蛋白。研究表明，p30蛋白有很强的免疫原性，是一种重要的非洲猪瘟病毒诊断抗原。
例如申请公布号为CN 111929433 A的中国发明专利，所述试剂盒的支持介质上包被有非洲猪瘟病毒抗原，所述非洲猪瘟病毒抗原为非洲猪瘟病毒p30和/或蛋白Δp54蛋白，其中非洲猪瘟病毒p30的制备过程繁琐，同时最后还需要层析纯化后使用，导致检测步骤复杂。
截至目前，我国未批准非洲猪瘟疫苗的上市使用。未经严格程序批准生产经营使用的疫苗都是假疫苗，安全风险隐患极大。因此，研发用于非洲猪瘟病毒抗体检测的试剂盒具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒及其制备方法，目的在于提供一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测非洲猪瘟病毒p30抗体的LIPS检测方法。
一种融合蛋白GLuc-p30，所述融合蛋白GLuc-p30的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；SEQ ID No.1：
MGVKVLFALICIAVAEAKPTENNEDFNIVAVASNFATTDLDADRGKLPGKKLPLEVLKEMEANARKAGCTRGCLICLSHIKCTPKMKKFIPGRCHTYEGDKESAQGGIGEAIVDIPEIPGFKDLEPMEQFIAQVDLCVDCTTGCLKGLANVQCSDLLKKWLPQRCATFASKIQGQVDKIKGAGGDDYKDDDDKGSGDIMDFILNISMKMEVIFKTDLRSSSQVVFHAGSLYNWFSVEIINSGRIVTTAIKTLLSTVKYDIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETESSASSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPSSEVPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIYGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKK。
其中，SEQ ID No.1由392个氨基酸组成，SEQ ID No.1的第199～392位氨基酸为ASFV p30抗原的氨基酸序列，SEQ ID No.1的第1～185位氨基酸为所述荧光素酶GLuc的氨基酸序列，SEQ ID No.1的186～198位氨基酸为连接肽的氨基酸序列。
所述融合蛋白GLuc-p30的编码基因序列如SEQ ID No.2所示；SEQ ID No.2：
ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACGATTACAAGGATGACGACGATAAGGGGAGTGGCGATATCATGGACTTCATCCTGAACATCAGCATGAAAATGGAAGTGATTTTCAAGACAGATCTGAGAAGCTCTTCTCAGGTGGTGTTCCACGCCGGATCTCTGTACAACTGGTTCAGCGTGGAAATCATCAACAGCGGCAGAATCGTGACCACCGCCATCAAGACACTGCTGAGCACCGTGAAGTACGACATCGTGAAAAGCGCTAGAATCTACGCCGGCCAGGGCTACACCGAGCACCAGGCCCAGGAGGAATGGAATATGATCCTGCACGTGCTGTTCGAGGAAGAGACAGAGAGCTCCGCCAGCTCCGAGAACATCCACGAGAAGAACGACAATGAAACCAACGAGTGCACCAGCTCCTTCGAAACCCTGTTTGAGCAGGAGCCAAGCTCTGAGGTCCCCAAGGACAGCAAGCTGTACATGCTGGCTCAAAAGACAGTGCAGCATATCGAGCAGTACGGCAAGGCCCCTGATTTTAACAAGGTGATCCGGGCCCACAACTTCATCCAGACCATCTATGGCACCCCTCTGAAGGAAGAAGAGAAAGAGGTTGTGCGGCTGATGGTGATTAAGCTGCTCAAGAAAAAGTGA。
SEQ ID No.2由1179个核苷酸组成，第595～1179位核苷酸编码SEQ ID No.1中的p30抗原；SEQ ID No.2的1～555位核苷酸编码SEQ ID No.1中的GLuc；SEQ ID No.2的556～594位核苷酸编码SEQ ID No.1中的连接肽。
一种制备所述融合蛋白GLuc-p30的方法，所述方法的步骤如下：
步骤S1：构建表达融合抗原GLuc-p30的重组慢病毒质粒pLVX-CMV-GLuc-p30；
步骤S2：经转染包装表达融合抗原GLuc-p30的慢病毒后，转导HEK-293T细胞，筛选稳定表达GLuc-p30的细胞株，培育细胞株收集培养上清，即获得融合抗原GLuc-p30。
优选的，所述步骤S1的具体步骤如下：将GLuc-p30的编码基因克隆到慢病毒载体pLVX-CMV中；PCR扩增GLuc-p30编码序列，分别用PmeⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点进行连接以构建重组慢病毒质粒pLVX-CMV-GLuc-p30。
优选的，所述步骤S2的具体步骤如下：将HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约80％时进行慢病毒包装质粒和重组慢病毒质粒的共转染实验；运用Lipofectamine 2000转染试剂将pLVX-CMV-GLuc-p30、pCMV-VSV-G、psPAX2共转染HEK-293T细胞包装慢病毒；转染后48小时，收集细胞培养上清，即获得表达GLuc-p30抗原的慢病毒溶液，冻存于-80℃；将包装好的慢病毒颗粒转导HEK-293T细胞后，在细胞培养基中加入嘌呤霉素筛选稳定表达GLuc-p30的细胞株，培育细胞株收集培养上清，即获得融合抗原GLuc-p30。
一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，包括包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板、荧光素酶、融合抗原GLuc-p30、非洲猪瘟抗体阳性的血清标准品、非洲猪瘟抗体阴性血清标准品、荧光素酶底物、洗涤液；
其中融合抗原GLuc-p30通过权利要求2所述的方法制备得到。
优选的，所述的包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板通过如下步骤制备得到：
步骤一：用金黄色葡萄球菌A蛋白包被酶标反应板；
步骤二：用洗涤液清洗步骤一的酶标反应板内未结合的金黄色葡萄球菌A蛋白；
步骤三：用封闭液封闭步骤二中清洗后的酶标反应板；
步骤四：用洗涤液清洗步骤三中封闭好的酶标反应板内的残余封闭液。
优选的，所述步骤一中金黄色葡萄球菌A蛋白包被酶标反应板时，包被酶标反应板的金黄色葡萄球菌A蛋白浓度为2μg/ml；使用的包被液为无菌的磷酸盐缓冲液，pH＝7.2；包被温度为4℃，包被时间为13h。
优选的，步骤三中所述封闭液为含10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，封闭条件为常温封闭1h。
所述的试剂盒在非洲猪瘟抗体检测中的非诊断目的检测方法，所述方法如下：
步骤(1)：将待检测的猪血清样品的稀释液和含有融合抗原GLuc-p30的细胞培养上清加入到包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板内孵育；
步骤(2)：用洗涤液清洗步骤(1)中的酶标反应板内未结合的融合抗原GLuc-p30以及血清残留；
步骤(3)：在步骤(2)清洗后的酶标反应板内加入荧光素酶底物溶液；
步骤(4)：将步骤(3)中的酶标反应板放入酶标仪中检测；
步骤(5)：检测结果判定标准：S/N≥71.58，判定为阳性；S/N<71.58，判定为阴性。
优选的，所述步骤(1)中血清稀释度为1：100；所述融合抗原GLuc-p30加入量为1×107光子计数RLU；所述孵育条件为37℃，1h。
试剂盒中所含的洗涤液、试剂盒制备步骤中使用的洗涤液以及检测方法步骤中所用到的洗涤液均为无菌的含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液。
试剂盒中所含的荧光素酶为经过优化的GLuc。
通过采用上述技术方案，本申请利用荧光素酶免疫沉淀原理，将金黄色葡萄球菌A蛋白包被到酶标反应板上。将待测血清样本稀释液和GLuc-p30融合抗原加入到酶标反应板的样本孔中，若待测样本为非洲猪瘟感染，GLuc-p30与p30特异性抗体形成抗原-抗体复合物，该复合物被样本孔中的金黄色葡萄球菌A蛋白捕获。利用洗涤液洗去未结合的GLuc-p30抗原，然后继续向样本孔中加入荧光素酶底物，利用酶标仪检测酶标反应板各孔对应的光子计数，从而获得非洲猪瘟病毒抗体的检测结果。
本发明具有以下有益效果：(1)本发明通过转染包装表达GLuc-p30融合抗原的慢病毒，再转导HEK-293T细胞，构建了稳定表达GLuc-p30抗原的细胞株，表达水平达到20μl细胞上清中的光子计数有2×107，将该抗原分泌到细胞外，表达的病毒抗原含有磷酸化等翻译后修饰，与感染情况下表达的病毒蛋白更相近，可以为非洲猪瘟病毒抗体检测提供充足的融合抗原。因此，使本专利试剂盒造价更便宜，能够在短时间内获得大量的重组抗原，操作简单方便。与其他常见病原(如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、塞内卡病毒(SVA)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV))的阳性血清均不发生交叉反应。
(2)本发明获得了GLuc标记的非洲猪瘟病毒p30蛋白，提高了检测的灵敏度。融合抗原在真核细胞中表达，保持了自身的天然构象。融合抗原无需纯化、可直接用于LIPS，这极大简化了抗原制备的过程。与ELISA相比，LIPS的检测灵敏度和特异性更好，可用于ASFV的抗体检测，可以有效地检测样品中非洲猪瘟病毒p30抗体的含量。
(3)本发明基于荧光素酶免疫沉淀***的非洲猪瘟血清学诊断方法，灵敏度高、特异性强，可以有效地检测样品中非洲猪瘟病毒p30抗体的含量，与符合国家标准的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒符合率达99％以上，具有广阔的市场前景和良好的经济、社会效益。
附图说明
图1本检测试剂盒的原理示意图。
图2本检测试剂盒待检血清样本稀释度优化。
图3 ROC分析确定本检测试剂盒的检测临界值及与符合国家检测标准的商品化ELISA试剂盒的符合率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：稳定表达融合蛋白GLuc-p30的HEK-293T细胞株的建立
1)重组慢病毒质粒的构建
将融合抗原表达基因(GLuc-p30的编码基因)克隆到慢病毒载体pLVX-CMV中；PCR扩增GLuc-p30编码序列，分别用PmeⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点进行连接以构建pLVX-CMV-GLuc-p30重组慢病毒质粒。
2)慢病毒包装与转导
将HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约80％时进行慢病毒包装质粒(pCMV-VSV-G、psPAX2)和重组慢病毒质粒的共转染实验。运用Lipofectamine 2000转染试剂(ThermoFisher Scientific)将pLVX-CMV-GLuc-p30、pCMV-VSV-G、psPAX2共转染HEK-293T细胞包装慢病毒。转染后48小时，收集细胞培养上清，即获得表达GLuc-p30抗原的慢病毒溶液，冻存于-80℃。
3)慢病毒转导HEK-293T细胞及抗性筛选稳定细胞株
用含有8μg/mL polybrene的慢病毒液转导HEK-293T细胞。48小时后，更换含有4μg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基，经抗性筛选获得慢病毒转导的细胞。由于慢病毒载体还表达绿色荧光蛋白，慢病毒转导的细胞都能表达绿色荧光蛋白。因此，基于嘌呤霉素筛选和绿色荧光信号筛选，我们成功建立了稳定表达GLuc-p30的多克隆HEK-293T细胞株。经GLuc荧光素酶活性测定，20μL细胞培养上清中的光子数为2×107。在含有1μg/mL嘌呤霉素的培养基中连续传代10次后，所有细胞都能表达绿色荧光蛋白，并且培养液中的GLuc-p30表达水平维持不变。因此，成功建立了稳定表达GLuc-p30的HEK-293T细胞株。
实施例2：一种基于LIPS的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的反应条件优化
如图1所示，本发明提供的一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的基本操作流程包括：将金黄色葡萄球菌A蛋白包被到酶标反应板上，并且封闭非特异性结合反应；将待测血清样本稀释后和GLuc-p30融合抗原加入到酶标反应板的样本孔中孵育；利用洗涤液(无菌的含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液)洗去未结合的GLuc-p30抗原；向样本孔中加入荧光素酶底物，利用酶标仪检测酶标反应板各孔对应的光子计数，从而获得非洲猪瘟病毒抗体的检测结果。为了达到最佳的检测效果，对基于LIPS的非洲猪瘟血清学诊断方法的反应条件进行优化，包括金黄色葡萄球菌A蛋白的包被条件、酶标反应板的封闭条件、待检血清样本和融合抗原孵育条件的优化、融合抗原用量的优化以及血清样本稀释系数。三个ASFV抗体阳性和一个ASFV抗体阴性的猪血清用于反应条件的优化试验，当阳性血清荧光素酶信号/阴性血清荧光素酶(P/N)信号最大时，该反应条件为最佳反应条件。
1)酶标反应板包被条件的优化
仅对金黄色葡萄球菌A蛋白包被酶标反应板的包被条件进行优化，尝试如下6个包被条件：磷酸盐缓冲液(PBS，0.1M，PH＝7.2)、Tris-HCl缓冲液(0.1M，PH＝8)和碳酸盐缓冲液(CBS，0.1M，PH＝9.6)三种包被缓冲液，37℃包被1h或者4℃包被13h。如表一所示，包被条件为PBS，4℃包被13h时，LIPS检测的P/N均最大。因此，本申请提供的一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中，金黄色葡萄球菌A蛋白的最佳包被条件为PBS，4℃包被13h。
表一 不同包被条件下LIPS检测的P/N值。
Figure BDA0003872471730000071
2)酶标反应板封闭条件的优化
酶标反应板蛋白包被后，仅对封闭条件进行优化，尝试如下包被条件：含5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液、含10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液以及含1％BSA的磷酸盐缓冲液分别常温封闭1h。如表二所示，封闭条件为含10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液常温封闭1h时，LIPS检测的P/N均最大。因此，本申请提供的一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒中，最佳封闭条件是在常温用150μL含10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液封闭1h时。
表二 不同封闭条件下LIPS检测的P/N值
5％脱脂奶粉 10％脱脂奶粉 1％BSA
P1/N 357.1 474.6 39.6
P2/N 299.2 421.7 45.6
P3/N 289.3 393.5 48.3
3)待检血清样本和融合抗原孵育条件的优化
尝试的待检血清样本和融合抗原孵育条件为37℃孵育0.5h、1h、2h或者常温孵育0.5h、1h、2h。如表三所示，当酶标反应板中孵育条件是37℃孵育1h时，LIPS检测的P/N最大。因此，最佳孵育条件是37℃孵育1h。
表三 不同孵育条件下LIPS检测的P/N值
Figure BDA0003872471730000081
4)融合抗原加入量的优化
尝试不同剂量的融合抗原GLuc-p30，分别为1×109、1×108、1×107、1×106和1×105光子计数/反应。如表四所示，当酶标反应板中融合抗原加入量是1×107光子计数时，LIPS检测的P/N均最大。因此，最佳融合抗原加入量是1×107光子计数/反应。
表四 不同融合抗原剂量下LIPS检测的P/N值
抗原 <![CDATA[1×10<sup>9</sup>]]> <![CDATA[1×10<sup>8</sup>]]> <![CDATA[1×10<sup>7</sup>]]> <![CDATA[1×10<sup>6</sup>]]> <![CDATA[1×10<sup>5</sup>]]>
P1/N 525.1 470.3 496.9 367.5 2.5
P2/N 320.5 495.7 552.4 421.01 2.4
P3/N 580.5 553.4 577.7 471.3 2.5
5)待检猪血清样品的稀释度优化
尝试的血清稀释倍数为1/50、1/100、1/200、1/400、1/800、1/1600、1/3200、1/6400、1/12800、1/25600、1/51200、1/102400、1/204800、1/409600、1/819200和1/1638400。如图2所示，随着稀释倍数的增加，LIPS检测的P/N值呈先增大后降低的趋势，并且血清稀释度为1/100和1/200时，P/N值最大。因此最佳血清稀释度设为1/100。
6)确定检测临界值
通过使用优化后的LIPS检测试剂盒对81份非洲猪瘟病毒阴性血清样本和38份非洲猪瘟病毒阳性血清样本进行检测，结果如图3(A)所示。根据检测结果进行ROC曲线分析(图3(C))，确定LIPS检测试剂盒的检测临界值。当S/N(未知血清样本/标准阴性样本)的检测临界值设置为71.58时，LIPS检测试剂盒的特异性为100％、检测灵敏度为100％。
7)基于LIPS的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的标准操作流程
上述试剂盒包括：包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板，融合抗原GLuc-p30，非洲猪瘟阳性血清及阴性血清，荧光素酶底物、洗涤液、样品稀释液。基于以上反应条件优化结果，本发明的LIPS检测方法的标准操作流程如下：
a)将1μL待检猪血清样本与20μL含有107光子计数荧光素酶活性的融合蛋白GLuc-p30加入79uL的含10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液中，形成100μL的终体系，加入试剂盒提供的包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板中，37℃孵育1h；
b)洗涤酶标反应板五次，每孔加入200μL无菌的含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液，每次5min；
c)加入荧光素酶底物(懋康生物，Coelenterazine h，MX4608)，50μL/孔，放入化学发光检测仪，设置整合时间为1秒，延迟时间为1秒，测试方式选用光子计数，并记录数据。
d)检测结果判定标准：S/N(临床样品/标准阴性样品)≥71.58，判定为阳性；S/N<71.58，判定为阴性。
实施例3、一种基于LIPS的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒的检测可重复性
在制备好的酶标反应板内的不同的孔位进行7次样本的批内重复性检测，在不同批次制备好的酶标反应板内的相同孔位进行3次样本的批间重复性检测。如表五所示，批间与批内的相关变异小于15％，说明本发明的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒具有良好的检测可重复性。
表五LIPS的检测重复性结果
Figure BDA0003872471730000101
实施例4、基于LIPS的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒与商品化ELISA试剂盒的符合率试验
采用符合国家标准非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒和本申请的检测试剂盒同时对55份健康猪血清、36份病毒感染血清同时进行检测，比较2种试剂盒检测结果的符合率。
符合国家标准非洲猪瘟病毒抗体试剂盒操作方法：
1.1加样取出抗原包被板(根据待检样品的多少，可将板条拆开分次使用)，分别加入100μl阴性对照、100μl阳性对照，对照孔每次检测各加两孔；在相应的样品孔中加入100μl已稀释好的样品。
1.2温育：37℃条件下温育30分钟(±1分钟)。
1.3洗板：将各孔的液体弃入废液筒，用300μl洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次，每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上拍干。
1.4加酶：每孔加入100μl酶标记物。
1.5温育：37℃条件下温育30分钟(±1分钟)。
1.6洗板：将各孔的液体弃入废液筒，用300μl洗涤液洗涤板孔，共洗涤5次，每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上拍干。
1.7显色：每孔加入100μl显色液。在37℃条件下避光温育15分钟(±1分钟)。
1.8终止：每孔加入50μl终止液，终止反应。
1.9读值：立即测量并且记录样品孔和对照孔的OD值(450nm)。
2判定
2.1试验成立判断
阴性对照OD平均值(NC X)≤0.2；
阳性对照OD平均值(PC X)-阴性对照OD平均值(NC X)≥0.5；
如果试验无效，应按照操作说明书重做一次试验。
2.2 S/P计算
样品S/P＝(样品OD值-NC X)/(PC X-NCX)
2.3结果判定
如果S/P≤0.3，判定为抗体阴性；
如果S/P≥0.4，判定为抗体阳性；
如果0.3＜S/P＜0.4，则为可疑。对于可疑样品，应重新采样并进行检测。
本申请检测试剂盒和符合国家标准非洲猪瘟病毒检测试剂盒对55份健康猪血清、37份病毒感染血清的检测结果见图3(B)，本申请检测方法和符合国家标准非洲猪瘟病毒检测试剂盒检测为阳性的血清份数均为37份，检测为阴性的血清份数均为55份。92份待检血清中，两种试剂盒检测结果一致的血清份数是92份，符合率为100％。
实施例5、基于LIPS的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒与其他常见猪病原的交叉反应性
基于一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒以及符合国家标准的非洲猪瘟病毒检测试剂盒，对5份猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性血清、2份猪瘟病毒阳性血清、5份塞内卡病毒阳性血清、3份猪德尔塔冠状病毒阳性血清、2份猪流行性腹泻病毒阳性血清，分别进行检测。
特异性检测结果如表九、表十显示，对5份猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒阳性血清、2份猪瘟病毒阳性血清、5份塞内卡病毒阳性血清、3份猪德尔塔冠状病毒阳性血清、2份猪流行性腹泻病毒阳性血清的检测结果均显示为阴性，因此本发明的检测试剂盒对这17份相关病原阳性血清检测的特异性均为100％，而符合国家标准非洲猪瘟病毒检测试剂盒的检测结果中存在一份非洲猪瘟病毒感染假阳性结果，因此符合国家检测标准的非洲猪瘟病毒检测试剂盒对这17份相关病原阳性血清检测的特异性为94.1％。
表六 一种基于试剂盒在非洲猪瘟抗体检测中的交叉反应性的检测结果
Figure BDA0003872471730000111
Figure BDA0003872471730000121
表七 符合国家检测标准的非洲猪瘟抗体检测试剂盒特异性检测结果
血清种类 总份数 阳性份数 阴性份数 特异性
PRRSV 5 1 4 80％
CSF 2 0 2 100％
SVA 5 0 5 100％
PDCoV 3 0 3 100％
PEDV 2 0 2 100％

Claims (10)

1.一种融合蛋白GLuc-p30，其特征在于：所述融合蛋白GLuc-p30的氨基酸序列如SEQID No.1所示；所述融合蛋白GLuc-p30的编码基因序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种制备如权利要求1所述融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述方法的步骤如下：
步骤S1：构建表达融合抗原GLuc-p30的重组慢病毒质粒pLVX-CMV-GLuc-p30；
步骤S2：经转染包装表达融合抗原GLuc-p30的慢病毒后，转导HEK-293T细胞，筛选稳定表达GLuc-p30的细胞株，培育细胞株收集培养上清，即获得融合抗原GLuc-p30。
3.根据权利要求2所述的制备融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述步骤S1的具体步骤如下：将GLuc-p30的编码基因克隆到慢病毒载体pLVX-CMV中；PCR扩增GLuc-p30编码序列，分别用PmeⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点进行连接以构建重组慢病毒质粒pLVX-CMV-GLuc-p30。
4.根据权利要求2所述的制备融合蛋白GLuc-p30的方法，其特征在于：所述步骤S2的具体步骤如下：将HEK-293T细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞密度约80％时进行慢病毒包装质粒和重组慢病毒质粒的共转染实验；运用Lipofectamine 2000转染试剂将pLVX-CMV-GLuc-p30、pCMV-VSV-G、psPAX2共转染HEK-293T细胞包装慢病毒；转染后48小时，收集细胞培养上清，即获得表达GLuc-p30抗原的慢病毒溶液，冻存于-80℃；将包装好的慢病毒颗粒转导HEK-293T细胞后，在细胞培养基中加入嘌呤霉素筛选稳定表达GLuc-p30的细胞株，培育细胞株收集培养上清，即获得融合抗原GLuc-p30。
5.一种非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：包括包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板、荧光素酶、融合抗原GLuc-p30、非洲猪瘟抗体阳性的血清标准品、非洲猪瘟抗体阴性血清标准品、荧光素酶底物、洗涤液；
其中融合抗原GLuc-p30通过权利要求2所述的方法制备得到。
6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板通过如下步骤制备得到：
步骤一：用金黄色葡萄球菌A蛋白包被酶标反应板；
步骤二：用洗涤液清洗步骤一的酶标反应板内未结合的金黄色葡萄球菌A蛋白；
步骤三：用封闭液封闭步骤二中清洗后的酶标反应板；
步骤四：用洗涤液清洗步骤三中封闭好的酶标反应板内的残余封闭液。
7.根据权利要求6所述的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：所述步骤一中金黄色葡萄球菌A蛋白包被酶标反应板时，包被酶标反应板的金黄色葡萄球菌A蛋白浓度为2μg/ml；使用的包被液为无菌的磷酸盐缓冲液，pH＝7.2；包被温度为4℃，包被时间为13h。
8.根据权利要求6所述的非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于：步骤三中所述封闭液为含10％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液，封闭条件为常温封闭1h。
9.利用权利要求5-8任一项所述的试剂盒在非洲猪瘟抗体检测中的非诊断目的检测方法，其特征在于：所述方法如下：
步骤(1)：将待检测的猪血清样品的稀释液和含有融合抗原GLuc-p30的细胞培养上清加入到包被金黄色葡萄球菌A蛋白的酶标反应板内孵育；
步骤(2)：用洗涤液清洗步骤(1)中的酶标反应板内未结合的融合抗原GLuc-p30以及血清残留；
步骤(3)：在步骤(2)清洗后的酶标反应板内加入荧光素酶底物溶液；
步骤(4)：将步骤(3)中的酶标反应板放入酶标仪中检测；
步骤(5)：检测结果判定标准：S/N≥71.58，判定为阳性；S/N<71.58，判定为阴性。
10.根据权利要求9所述的试剂盒在非洲猪瘟抗体检测中的非诊断目的检测方法，其特征在于：所述步骤(1)中血清稀释度为1：100；所述融合抗原GLuc-p30加入量为1×107光子计数；所述孵育条件为37℃，1h。
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