CN116507729A - Sars-cov-2病毒蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了用于检测生物样品中的SARS‑CoV‑2抗原特异性抗体的组合物和免疫测定。组合物是与发光蛋白融合的来自SARS‑CoV‑2的抗原，如蛋白N、M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8。组合物可用于检测针对SARS‑CoV‑2抗原的抗体的免疫测定。优选的免疫测定是荧光素酶免疫沉淀***(LIPS)，其以高灵敏度和特异性检测SARS‑CoV‑2抗原特异性抗体。可以使用所公开的组合物和方法检测和/或诊断当前或现在暴露于SARS‑CoV‑2或被SARS‑CoV‑2感染。通常，与对照相比，个体生物样品中SARS‑CoV‑2抗体的存在和/或量的增加指示本文所讨论的当前或过去暴露于SARS‑CoV‑2或被SARS‑CoV‑2感染。

Description

SARS-COV-2病毒蛋白及其用途
1.领域
本发明总体上属于SARS-CoV-2抗原的免疫原性组合物和COVID 19的血清学测试的领域。
2.背景
急性流行性呼吸道疾病COVID-19是由一种新型冠状病毒引起的，该冠状病毒属于严重急性呼吸综合征相关冠状病毒(SARS-CoV-2)物种(1,2)。SARS-CoV-2已成为一种大流行病毒，导致全世界报告了300万人死亡和1.47亿例COVID-19病例(截至2021年4月27日)，并产生了深刻的社会经济影响。
迫切需要通过加速开发和大规模生产针对SARS-CoV-2的有效疫苗来控制大流行，这已经导致在疫苗学方面的前所未有的努力，在不同的开发阶段和人类临床试验中有超过300种的候选疫苗(5)。不过，疫苗开发和部署以减轻大流行的紧迫性留下了一些基本的免疫学研究问题悬而未决，特别是关于引发抗体应答和保护的病毒免疫原的范围，其动力学、特异性、广度、寿命和对长期保护或免疫病理学的影响。然而，近几个月来，努力已经指向更好地了解人对SARS-CoV-2感染的体液应答。
SARS-CoV-2属于β-冠状病毒属，该属还包括2002年出现的SARS-CoV和2012年出现的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，它们都是动物传染病来源的严重人类疾病，三者都导致急性呼吸道综合征(4)。正在进行的研究已经报告了所有新变异株的全基因组序列(GISAID)(1)、转录组(https://doi.org/10.1038/s41392-020-00237-0)(6)和对感染的免疫应答(7)。开发强效且可靠的血清学测定，以表征暴露于病毒的个体中抗体的丰度和持续时间，同时将当前/过去的感染与疫苗接种相区分已经变得至关重要。血清学测试主要用于诊断，但也用于SARS-CoV-2病毒感染和疫苗的血清流行病学。
目前使用的几种血清学测试主要评估刺突蛋白(S)，有时评估核衣壳蛋白(N)抗体(Yong,S.E.F.等人，Connecting clusters of COVID-19:an epidemiological andserological investigation.Lancet Infect Dis 20,809-815(2020))。S和N的血清转化一般发生在患病的第二或第三周，不适合用于诊断急性疾病，而且这些测定的灵敏度和特异性不是最佳的。此外，开发中的针对COVID-19的大多数疫苗靶向刺突蛋白以引发中和抗体来阻断感染(Paules,C.I.,Marston,H.D.&Fauci,A.S.Coronavirus Infections-MoreThan Just the Common Cold.JAMA 323,707-708(2020))，因为S蛋白含有对病毒进入至关重要的受体结合结构域(RBD)(Yuan,M.等人，A highly conserved cryptic epitope inthe receptor-binding domains of SARS-CoV-2and SARS-CoV.Science 368,630-633(2020))。因此，个体中存在抗S抗体可能是感染和疫苗接种两者的结果。然而，不清楚针对S蛋白的中和抗体是否是保护性免疫应答的主要贡献因素(Wu,F.等人，Neutralizingantibody responses to SARS-CoV-2in a COVID-19recovered patient cohort andtheir implications medRxiv(2020))。在大多数COVID-19患者中产生中和抗体，然而，一些研究报告一部分RT-PCR证实的COVID-19患者不产生通过中和测试测量到的强效抗体应答。
而且，在过去的几个月中，已经报道了在以前感染的和疫苗接种的人中的许多再感染病例，称为“突破性感染”，仅在美国就已经鉴定出5700个病例(https://www.cdc.gov/ vaccines/covid-19/health-departments/breakthrough-cases.html)，提出了来自原发性感染的低抗体应答的问题(Paul K.S.Chan,Serologic Responses in Healthy Adultwith SARS-CoV-2Reinfection,Hong Kong,August 2020.Emerg Infect Dis.2020Dec)。
传统的血清学方法检测到的抗体应答低或没有抗体应答的可能性可能导致对过去无症状和轻度感染的低估。
因此，为了更好地检测SARS-CoV-2感染的免疫原性，区分既往感染和疫苗接种，以及了解发病机制和免疫力，需要评估更广泛的对一系列病毒蛋白的抗体应答的状况。
3.概述
提供了用于检测生物样品中SARS-CoV-2抗原特异性抗体的组合物和免疫测定。组合物是免疫原性的，包含来自SARS-CoV-2的抗原。在优选的实施方案中，免疫原性组合物包含SARS-CoV-2抗原ORF8、ORF3b和/或N蛋白或其片段作为抗原。在一些形式中，所包括的免疫原性组合物是融合蛋白，其包含与发光蛋白融合的SARS-CoV-2抗原蛋白N、M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8。在一些形式中，所包括的免疫原性组合物是融合蛋白，其包含与发光蛋白融合的非结构蛋白ORF8、ORF3b和/或结构蛋白N。在一些形式中，所包括的免疫原性组合物是融合蛋白，其包含与发光蛋白融合的非结构蛋白ORF8和/或ORF3b。所公开的组合物还包含表达载体，其包含编码SARS-CoV-2N、M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8的核酸序列，其被表达为与发光蛋白的融合体。
在一个优选的实施方案中，免疫测定利用荧光素酶免疫沉淀***(LIPS)以高灵敏度和特异性检测SARS-CoV-2抗原特异性抗体。方法包括提供包含与发光蛋白融合的抗原的融合蛋白；使生物流体样品与融合蛋白接触。如果生物流体样品中存在抗原特异性抗体，则形成与发光蛋白融合的SARS-CoV-2抗原与特异性抗体的复合物，并使用珠将其沉降(pulldown)。然后可以通过与结合的抗体数量成比例的底物添加来检测抗体水平。免疫球蛋白结合蛋白可以是蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或第二免疫球蛋白分子。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白是蛋白A/G。发光蛋白优选为荧光素酶，例如海肾荧光素酶。在一些实施方案中，LIPS测定包括ORF8作为唯一的SARS-CoV-2抗原，并且基于包括ORF8作为唯一的SARS-CoV-2抗原的LIPS和ELISA测定，将受试对象鉴定为COVID-19阳性。在一些其他实施方案中，SARS-CoV-2抗原是ORF8、ORF3b和/或N。在一些实施方案中，检测SARS-CoV-2抗原特异性抗体是在自暴露/感染起第14天之前的早期时间点。在一些实施方案中，生物流体样品来自儿童。
在其它实施方案中，免疫测定包括但不限于放射免疫测定、ELISA、免疫沉淀测定、Western blot和荧光免疫测定。所公开的免疫原性组合物可用于产生针对ORF8、ORF3b的抗体，其可应用于免疫测定，如ELISA和浸渍片测定(dipstick assay)。在这些实施方案中，免疫测定优选检测SARS-CoV-2抗原ORF8、ORF3b和/或N蛋白。
例如，在优选的实施方案中，ELISA是“间接ELISA”。间接ELISA可以包括一个或多个以下步骤。添加(多种)SARS-CoV-2蛋白或其(多种)片段或(多种)融合体(即抗原)，将其连接或以其它方式结合到表面。可加入生物样品(其可含有SARS-CoV-2抗体)，并使存在的任何抗体与抗原特异性结合。添加可以检测SARS-CoV-2抗体(例如，对从其获得样品的受试对象产生的抗体的恒定区(即，人Ig恒定区)具有特异性的抗体)的存在的第二抗体，所述第二抗体具有连接的(偶联的)酶或其他可检测的标记。如果检测需要，则加入可检测标记(例如酶)的底物。测定可包括孵育和清洗步骤。
在一些实施方案中，测定为浸渍片形式。浸渍片可含有SARS-CoV-2抗原。将浸渍片与生物样品接触，使样品中存在的抗体，例如来自作为生物样品的唾液或血液(如干快速印迹测试)的抗体与抗原结合，并可类似于ELISA进行处理。在浸渍片形式中，可使用比色皿进行测定。例如，为了检测免疫球蛋白G(IgG)，可通过含有生物样品、酶偶联的第二抗体(例如，抗人IgG和IgM抗体等)和任选的底物等的反应比色皿处理浸渍片。
可以使用所公开的组合物和方法检测和/或诊断和/或治疗当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染。通常，与对照相比，个体的生物样品中SARS-CoV-2抗体的存在和/或量的增加提示本文所讨论的过去、当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染。例如，用于辅助检测或诊断受试对象当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染的方法可以包括确定来自受试对象的生物样品中针对一种或多种SARS-CoV-2蛋白、片段或融合蛋白的抗体的存在或水平，其中相对于对照中抗体的水平，生物样品中抗体的存在或水平升高提示过去、当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染。
在一些实施方案中，方法与检测SARS-CoV-2的方法组合。如果检测到病毒，受试对象可能具有当前的暴露或感染。如果未检测到病毒，则受试对象可能没有当前的暴露或感染，并且抗体的存在可能是由于先前的暴露或感染。
任何方法可与治疗方法组合。在优选的实施方案中，治疗方法包括向受试对象施用有效量的抗病毒疗法、止痛疗法、退热剂、咳嗽抑制剂和/或呼吸辅助(例如，呼吸机治疗)。
还提供了包括用于检测和定性或定量测量受试对象的生物样品中SARS-CoV-2抗体的试剂的测定和试剂盒。例如，如果通过ELISA检测SARS-CoV-2抗体，则测定或试剂盒的组分可以包括(多种)SARS-CoV-2蛋白或其(多种)片段或(多种)融合体，其任选地固定在诸如珠或测定皿或其孔的表面上，以及任选地包括诸如可与SARS-CoV-2抗体结合的抗体(例如，对从其获得样品的受试对象产生的抗体的恒定区(即，人IgG恒定区)具有特异性的抗体)的检测装置，其带有连接的(偶联的)酶或其他可检测的标记，例如荧光染料或放射性标记。
4.附图说明
图1A-1E显示通过LIPS检测SARS-CoV-2结构蛋白抗体。图1A说明SARS-CoV-2基因组ORF组织，显示3’端的AAAAA(未按比例)。图1B-1E是显示通过LIPS测量的来自COVID-19患者和年龄匹配的健康阴性对照的针对四种SARS-CoV-2结构蛋白刺突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)的抗体的结果的条形图。数据表示平均值+/-标准差和个体应答(n＝15)。减去背景值。实验重复两次。使用曼-惠特尼U检验(Mann-Whitney U test)计算P值。*显示COVID-19患者相对健康对照之间的统计显著性。ns p＝0.0591*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。实验重复两次。
图2A-2C显示针对SARS-CoV-2S蛋白亚基的抗体水平的LIPS检测。图2A：通过LIPS测得的来自COVID-19患者和健康对照的针对S亚基S1、S2和S2’的抗体。图2B：具有低微量中和(MN)滴度(<160)与高MN滴度(≥160)的COVID-19患者中完整S、S1、S2、S2’Abs LIPS滴度的对比。图2C：具有低ELISA S IgG滴度(<1)与高ELISA S IgG滴度(≥1)的COVID-19患者中完整S Abs LIPS滴度的对比。数据表示平均值+/-标准差和个体应答(n＝15)。减去背景值。实验重复两次。使用曼-惠特尼U检验计算P值。*显示COVID-19患者相对健康阴性对照之间的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
图3A-3J显示通过LIPS检测SARS-CoV-2非结构蛋白抗体。图3A-3H：通过LIPS测量针对NSP1(在ORF1ab中)和其它ORF(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF10)的抗体，以覆盖病毒的所有ORF。数据表示平均值+/-标准差和个体应答(n＝15)。图3I显示11项LIPS测试的灵敏度和特异性性能。图3J：COVID-19和阴性对照群体之间的抗体滴度平均值的差异。
图4A-4I显示组合LIPS测试作为COVID-19的诊断工具。对于(图4A)11种相关抗原(N、M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b、ORF10)、(图4B)3种最敏感抗原(N、ORF3b和ORF8)、(图4C)选择性抗原(ORF3b和ORF8)和(图4D)3种S相关抗原(S、S1、S2’)而言，在COVID-19患者和健康对照中对SARS-CoV-2抗原的累积抗体LIPS水平。图4E-4F：仅以(图4E)11种相关抗原和(图4F)3种最敏感抗原(N+ORF3b+ORF8)的总和检测早期时间点患者。数据表示平均值+/-标准差和个体应答(n＝15)。总和的临界值由虚线显示，并且是基于阴性对照组的平均值+三个标准差。蓝色点代表第14天前的COVID-19患者数据点。图4H-4I为包括11种相关抗原的散点图(图4H)，以及为不包括N的饼形图(图4I)。每个符号代表以光单位(LU)计的11个相关抗体水平在COVID-19和健康阴性组之间差异的平均值+/-标准差。****相对于所有其它抗原p<0.0001，另有说明。
图5A-5D显示由ELISA和LIPS测得的S和N IgG应答。图5A显示COVID-19患者和健康阴性对照的完整S IgG ELISA。图5B显示COVID-19患者的完整S ELISA和LIPS的皮尔逊斯皮尔曼相关性(Pearson Spearman correlation)。图5C显示COVID-19患者和健康对照的NIgG ELISA。数据表示平均值+/-标准差和个体应答(n＝15)。实验重复两次。使用曼-惠特尼U检验计算P值。*显示COVID-19患者相对健康对照之间的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。图5D显示COVID-19患者的N ELISA和LIPS的皮尔逊斯皮尔曼相关性。图5E：COVID-19患者(n＝3)的吸附前和吸附后LIPS抗体结果。实验重复两次。
图6A和6B显示LIPS测得对SARS-CoV-2抗体产生没有性别和年龄相关的影响。在COVID-19患者中通过LIPS测量针对SARS-CoV-2抗原的抗体，并按性别(图6A)和年龄(<60岁和>60岁年龄)分层(图6B)。数据表示平均值+/-标准差和个体COVID-19应答(n＝15)。实验重复两次。使用曼-惠特尼U检验计算P值。*显示COVID-19患者相对健康对照之间的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
图7A-G：组合LIPS测试作为COVID-19的诊断工具。图7F：代表每个COVID-19患者的红色点和代表每个阴性对照的灰色点(ORF3b，ORF8)在平面中的聚类。直线的方程0.2187x+0.5927y＝4643.19。图7G：N、ORF3b、ORF8及它们的总和(来自图7A-E)的灵敏度和特异性表现和聚类分析(来自图7F)。红色轮廓线显示最高的灵敏度和特异性。使用曼-惠特尼U检验计算双侧P值。*显示COVID-19患者相对阴性对照之间的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005。
图8A-8F：SARS-CoV-2抗体随时间的应答。图8A：早期时间点(第14天之前)N、ORF3b、ORF8及它们的总和的灵敏度表现。红色轮廓线显示最高的灵敏度和特异性。仅用三种最敏感抗原(N+ORF3b+ORF8)(图8B)和ORF3b+ORF8(图8C)的总和检测早期时间点患者(≤第14天)。图8D：纵向时间点患者(n＝14)对N(红色)、ORF3b(粉色)、ORF8(绿色)和刺突蛋白(蓝色)的应答。x轴代表每个患者症状发作后的时间点(按比例)，以天为单位。在y轴上，每个单位代表103个ORF3b、ORF8和刺突蛋白，和106个N(为了清楚，原点移位)。图8E：COVID-19患者(来自图8D)的完整S LU与ORF8 LU的线性回归对比(R2＝0.66902，p<0.0001，双侧P值)。图8F：S、N、ORF8和ORF3b LU从最早可用的急性时间点样品(图8D)到恢复期(症状发作后14-30天)和长期记忆(症状发作后>31天)的倍数变化。*显示一个样品t检验相对1倍变化的假设值的统计学显著性*p<0.05。
图9：仅检测早期时间点患者(≤第14天)的N、ORF3b和ORF8。LIPS结果来自采用N(图9A)、ORF3b(图9B)、ORF8的LIPS测试(图9C)和采用N+ORF8的LIPS测试(图9D)。数据表示个体应答(n＝51)。总和的临界值由虚线表示，并且是基于阴性对照组的平均值+三个标准差。实验重复两次。
图10：α-和β-HCoV阳性样品不与N、ORF3b和ORF8 SARS-CoV-2LIPS测定交叉反应。对n＝176个COVID-19阴性对照队列样品(本研究中使用的阴性大流行前对照)进行OC43、229E和NL63刺突蛋白ELISA。图(图10a-c)表示根据在COVID-19阴性样品队列中通过ELISA测得的对OC43刺突蛋白的阳性/阴性，SARS-CoV-2N、ORF3b和ORF8的LIPS结果。图(图10d-f)表示根据通过ELISA测得的对229E刺突蛋白的阳性/阴性，N、ORF3b和ORF8的LIPS结果。图(图10g-i)表示在COVID-19阴性样品队列中，根据通过ELISA测得的对NL63刺突蛋白的阳性/阴性，SARS-CoV-2N、ORF3b和ORF8的LIPS结果。虚线表示图7中使用的临界值。图10j：阴性队列中OC43、229E和NL63刺突蛋白IgG的百分比。对n＝176个COVID-19阴性对照队列样品进行ELISA。HCoV ELISA中的阳性定义为O.D.>1，阴性定义为O.D.<1。使用曼-惠特尼U检验计算双侧P值。ns意味着无显著差异。
图11：在患有COVID-19的儿童和成人中对SARS-CoV-2结构蛋白的抗体应答的比较。通过LIPS从来自小儿COVID-19(n＝254)或成人患者(n＝36)和阴性对照(n＝33)(表6中描述的队列)的样品测量针对SARS-CoV-2结构蛋白刺突蛋白S1亚基(S1)(图11a)、刺突蛋白S2亚基(图11b)、刺突蛋白S2’亚基(图11c)、核衣壳蛋白(N)(图11d)、膜蛋白(M)和包膜蛋白(E)(图11f)的抗体。减去背景无血浆值。实验重复两次。所有数据表示个体应答和平均值+/-标准差。使用曼-惠特尼U检验计算双侧P值。*显示COVID-19患者相对阴性对照之间的统计显著性。**p<0.01，***p<0。001，****p<0.0001。
图12：患有COVID-19的儿童对SARS-CoV-2非结构蛋白和ORF的抗体应答强度比患有COVID-19的成人低，但在全球代表了较高比例的SARS-CoV-2体液应答。在小儿(n＝254)和成人(n＝36)COVID-19病例和阴性对照(n＝33)中通过LIPS测量针对NSP1(图12a)(在ORF1ab中)和其它ORF(ORF3a(图12b)、ORF3b(图12c)、ORF6(图12d)、ORF7a(图12e)、ORF7b(图12f)、ORF8(图12g)和ORF10(图12h))的抗体，以覆盖病毒的所有ORF。图12i：比较COVID-19小儿和成人群体和阴性者中结构(N、S、S1、S2’、S2、M、E)和辅助蛋白(NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF10)应答的平均滴度(LU)的热图。图12j：针对SARS-CoV-2抗原的单一抗体水平占COVID-19儿童和成人中14种抗原的累积SARS-COV-2抗体应答的百分比。实验重复两次。使用曼-惠特尼U检验计算双侧P值。*显示COVID-19患者相对阴性对照之间的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.0001。图12a-h中的数据表示个体应答和平均值+/-标准差，图12i中的数据表示平均值(LU)，图12j中的数据表示百分比。
图13：将小儿COVID-19群体表示为相关抗体组合和主成分分析(PCA)的点聚类(a-b)。S1、S2’、S2抗体组合的聚类表示。图13a显示小儿COVID-19群体与成人COVID-19群体的对比，图13b显示小儿COVID-19群体与阴性群体的对比。图13c：小儿COVID-19群体与成人COVID-19群体和阴性群体的N、ORF3b、ORF8抗体组合的聚类表示的对比。根据它们的SARS-CoV-2个体LIPS抗体的值在空间中以(x、y、z)表示患者。小儿COVID-19患者(n＝144)表示为红点。COVID-19成人患者(图13a-b中n＝36，图13c中n＝24)用蓝色表示。阴性群体(n＝28)用灰色表示。图13d-f：在COVID-19小儿患者中分析的14种抗体的PCA。Dim1解释了21％的变化，而Dim2解释了15％的变化。图13d：相关圆和贡献。贡献的比例显示在右边。图13e：变量对维度1和2的贡献。上图中的红色虚线显示预期的平均贡献。图13f：PCA在维度1和2上的因子图。图根据样品类型着色，每组中形状上的最大点是组平均点(圆为成人阳性，三角形为阴性，正方形为小儿阳性)。
图14：无症状和轻度有症状的儿童不显示不同的抗体状况。根据患者的症状评分(无症状的《asympto》(小儿COVID-19n＝98，成人COVID-19n＝9)与有症状的《sympto》(小儿COVID-19n＝156，成人COVID n＝27)对比)对小儿和成人样品进行分层，根据“asympto”和“sympto”分析来自图1和2的数据。图14a：通过LIPS测得的针对SARS-CoV-2结构蛋白S1、S2、S2’、N、E和M的抗体。图14b：针对SARS-COV-2NSP1(在ORF1ab中)和所有其它ORF(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF10)的抗体。使用曼-惠特尼U检验计算双侧P值。*显示COVID-19患者相对阴性对照之间的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.0001。所有数据表示个体应答和平均值+/-标准差。
图15：独特的抗体状况是早期时间点样品(<第14天)所特有的。根据收集的时间点对小儿样品进行分层，并根据急性期(<第14天，n＝119)和随后的时间点(≥第14天，n＝135)分析来自图1和2的数据。图15a：通过LIPS测得的针对SARS-CoV-2结构蛋白S1、S2、S2’、N、E和M的抗体。图15b：针对NSP1(在ORF1ab中)和所有其它ORF(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF10)的抗体。使用学生t检验计算P值。*显示急性时间点小儿COVID-19患者相对晚期时间点小儿COVID-19患者之间的统计显著性。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005，****p<0.0001。所有数据表示个体应答和平均值+/-标准差。
图16：COVID-19儿童中结构和非结构SARS-CoV-2蛋白的抗体应答的纵向稳定性。图16a：来自58例小儿COVID-19病例的2、3或4次抽血的纵向患者数量。图16b：样品收集时间线(感染后天数)。图16c：对S1、S2’、N、M、E、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b、ORF8的纵向样品(n＝58例小儿COVID-19患者)拟合log10 LIPS值上的线性趋势。
图17：产生IFN-α的小儿患者显示不同的对SARS-CoV-2辅助蛋白的抗体应答状况。图17a：COVID-19小儿样品(红色，n＝144)与COVID-19成人样品(蓝色，n＝27)的针对辅助蛋白ORF3b、ORF7a、ORF6(x、y、z)的抗体的聚类表示对比。图17b：小儿(n＝48)和成人COVID-19病例(n＝18)早期时间点样品(<第7天)的血浆IFN-α浓度(pg/ml)。数据表示个体应答和平均值+/-标准差。图17c：COVID-19小儿队列中对相关SARS-CoV-2结构蛋白抗原和非结构蛋白抗原(不包括N)的累积抗体应答的饼图，通过它们的IFN-α应答分层(阳性/阴性)。图17d：通过RT-PCR获得的IFN-α+阳性小儿病例病毒载量的个体数据，ORF3b、ORF6和ORF7bLIPSLU。使用卡方检验计算IFNα-小儿COVID-19患者(N＝45)和IFN-α+(N＝3)的平均值之间的P值。ns，p＝0.0591，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
图18：市售SARS-CoV-2抗体检测试剂盒的实例依赖于S和/或N和它们的灵敏度和特异性。
图19：ORF8和ORF3b比S/N更稳定，除了关注变异株B1.1.7和B1.351外，这些区域中的突变大多数是同义的。
图20：普通感冒冠状病毒与S和N共有高度同源性(这可导致交叉反应性)，而ORF8和ORF3b对SARS-CoV-2具有特异性。图20A-D：跨越不同聚类和结构域的SARS-CoV-2中的刺突蛋白突变率。图20E：SARS-CoV-2蛋白与其它冠状病毒的氨基酸序列同源性％对比。
图21：ORF8和ORF3b在诊断SARS-CoV-2变异株再感染中显示出较高的灵敏度。图21A：第2次感染和第1次感染的ORF8中64E终止突变的示意图。图21B-D：用LIPS测量血清中自继发感染第10天、第43天和第5天的针对S、N、ORF8+3b和ORF8的抗体。虚线表示通过阴性者的平均值加上三个标准偏差计算的临界值。
图22：ORF3b和ORF8在成人(第0天-第100天)和儿童(第0天-第204天)中随时间稳定，使它们在感染的所有时间点都是有效的血清学标志物。图22a：来自58例小儿COVID-19病例的2、3或4次抽血的纵向患者数量。图22b：样品收集时间线(感染后天数)。图22c：以ORF3b和ORF8的纵向样品(n＝58例小儿COVID-19患者)拟合log10 LIPS值上的线性趋势。图22d：成人COVID-19血浆中S、N、ORF8和ORF3b LU从最早可用的急性时间点样品到恢复期(症状发作后第14-30天)和长期记忆(症状发作后>31天)的倍数变化。*显示一个样品t检验相对1倍变化的假设值的统计学显著性*p<0.05。
图23：ORF8和ORF3b是SARS-CoV-2感染的灵敏的和特异性标志物(图23a-d)。通过LIPS从COVID-19样品(n＝84)和阴性对照(n＝176)测量针对三种相关SARS-CoV-2核衣壳蛋白(N)(图23a)、ORF3b(图23b)、ORF8(图23c)的抗体。COVID-19患者和阴性对照中针对N+ORF3b+ORF8(图23d)和ORF3b+ORF8(图23e)SARS-CoV-2抗原的抗体LIPS水平的总和。数据表示平均值+/-标准差和个体应答。减去背景值。实验重复两次。图23f：N、ORF3b、ORF8和它们总和的灵敏度和特异性表现和聚类分析。轮廓红线显示最高的灵敏度和特异性。图23g：在ELISA中，针对COVID-19患者(n＝550)和阴性者(n＝184)血浆中ORF8蛋白(来自MasashiMori，Ishiwaka University，日本)的抗体。虚线表示计算为阴性者的平均值加上三个标准偏差的临界值。图23h：COVID-19患者中抗ORF8抗体与以天数计的时间的相关性(R2＝0.05944，ns)
图24：ORF8 ELISA是COVID-19儿童和感染早期所有时间点的准确诊断工具。图24a-c：针对COVID-19儿童(n＝243)和阴性(n＝184)血浆中ORF8的抗体。将数据进一步分层，(图24b)从无症状(n＝63)和有症状患者(n＝180)，(图24c)至早期(n＝115)和晚期(n＝128)。图24d-f：针对COVID-19成人(n＝304)血浆中ORF8的抗体。将数据进一步分层，(图24e)从无症状(n＝40)和有症状患者(n＝227)，(图24c)至早期(n＝178)和晚期(n＝90)。虚线代表计算为阴性者的平均值加上三个标准偏差的临界值。
图25：利用SinoBiological蛋白进行刺突蛋白和核衣壳蛋白的内部ELISA作为诊断的比较。图25a-b：在COVID-19成人(n＝84)和阴性者(n＝100)中针对完整刺突蛋白和核衣壳蛋白(来自Sinobiological)的抗体。虚线代表计算为阴性者的平均值加上三个标准偏差的临界值。
图26：在感染的SARS-CoV-2细胞中检测到ORF8并且其与M和ERGIC-53共定位，突显了其作为抗原测试的潜力。图26a：COVID-19患者(来自图8D)的完整S LU与ORF8 LU的线性回归对比(R2＝0.66902，p<0.0001，双侧P值)。图26b：SARS-CoV-2的ORF8和结构蛋白M的免疫荧光染色揭示蛋白的共定位(MOI2，24h p.i.40x)。图24c：ORF8和结构蛋白刺突蛋白和ERGIC-53的免疫荧光染色(MOI2，24h p.i.40x)揭示与ERGIC-53的共定位和ORF8蛋白在感染细胞中的丰度。实验重复三次。
5.详细说明
SARS-CoV-2抗体测试是用于诊断近期和过去COVID-19感染的选项的一个重要组成部分。抗体测试对于确定群体中的感染发病率、群体免疫和为疫苗开发提供信息是重要的。在此首次报告了针对广谱SARS-CoV-2抗原的抗体应答的检测。已经开发了几种测量SARS-CoV-2特异性抗体的方法，包括微量中和测定(基于病毒或假病毒(25))、ELISA测定(11,26)、免疫荧光(7)、基于胶体金的免疫层析测定(27)和肽/蛋白微阵列(28,29)。大多数市售或公开的血清学测试仅使用S抗原，少数使用S和N抗原两者(11,36,37)。
本研究使用病毒抗原的广泛测试，显示另外的靶点对于早期检测抗体应答和识别COVID-19患者是重要的。因此，组合SARS-CoV-2特有的几种相关抗原的方法，还有免疫原性加强特异性抗体将克服交叉反应性的问题并提高血清学测定的灵敏度。
I.定义
如本文所用的，“载体”是复制子，例如质粒、噬菌体或粘粒，可以向其中***另一DNA片段以引起***片段的复制。本文所述的载体可以是表达载体。
如本文所用的，“表达载体”是包含一个或多个表达控制序列的载体。
如本文所用的，“表达控制序列”是控制和调节另一DNA序列的转录和/或翻译的DNA序列。
“可操作地连接”是指并列，其中组分被配置以执行其通常的功能。例如，可操作地连接于编码序列的控制序列或启动子能够影响编码序列的表达，可操作地连接于蛋白的细胞器定位序列将指导连接的蛋白被定位于特定的细胞器。
如本文所用的，术语“宿主细胞”是指向其中可引入重组载体的细胞。
如本文所用的，“转化的”和“转染的”包括通过本领域已知的许多技术将核酸(例如载体)引入细胞。
如本文所用的，“标记”或“可检测部分”是可通过光谱、光化学、生物化学、放射照相、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组成。例如，有用的标记包括32P、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如，如在ELISA中常用的)、生物素、洋地黄毒苷、或半抗原和蛋白或可以例如通过将放射性标记结合到肽中变得可检测的或用于检测与肽特异性反应的抗体的其他实体。标记可以在任何位置结合到核酸、蛋白质和抗体中。可以使用本领域已知的用于将抗体与标记偶联的任何方法，例如，使Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,AcademicPress,Inc.,San Diego.中描述的方法。
II.组合物
所公开的组合物包含SARS-CoV-2抗原，其可以在COVID 19的诊断中单独使用，或组合使用和/或检测受试对象中SARS-CoV-2特异性抗体的存在。
SARS-CoV-2具有12个推定的功能性开放阅读框(ORF)并与SARS-CoV共有82％的核苷酸同源性(8)。SARS-CoV-2存在至少四种结构蛋白：刺突蛋白(Spike(S))、包膜蛋白(Envelope(E))，膜蛋白(Membrane(M))、核衣壳蛋白(Nucleocapsid(N))。三聚体S蛋白裂解成含有受体结合结构域的S1和S2亚基(8,9)，S2进一步裂解成S2’以形成病毒融合肽(6)。SARS-CoV-2的S1亚基与SARS-CoV共有约70％的同一性，而S2亚基的同一性高达99％，有一些病毒之间交叉反应的证据(11)。除了这些结构蛋白，SARS-CoV-2基因组编码大约20种推定的非结构蛋白(8)。ORF1a/b编码大的多蛋白，其被蛋白水解裂解成16个非结构蛋白(NSP1-16)。额外的ORF，例如ORF3a、3b、6、7a、7b、8和10可以编码蛋白，但它们的功能是未知的。
A.融合蛋白
所公开的组合物包含结构蛋白N、M、S、S1、S2’、大NSP1，或由ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8 SARS-CoV-2编码的氨基酸与发光蛋白的融合蛋白。发光蛋白包括荧光蛋白或荧光素酶，例如海肾荧光素酶(Renilla luciferase)、Gaussia荧光素酶、修饰的(优化的)Oplophorus gracilirostris荧光素酶(例如NANOLUCTM(是市售的)、萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)、萤火虫荧光素酶或细菌荧光素酶。在一个优选的实施方案中，发光蛋白是海肾荧光素酶。
B.包含SARS-CoV-2抗原融合蛋白编码结构域的载体和细胞
还提供了包含编码SARS-CoV-2抗原和发光蛋白的融合体的核酸的载体，以及携带这些载体的细胞。编码SARS-CoV-2的结构蛋白N(例如由SEQ ID NO：7表示)、M(例如由SEQID NO：5表示)、S(例如由SEQ ID NO：8表示)、S1(例如由SEQ ID NO：9表示)、S2’(例如由SEQIDNO：11表示)、NSP1(例如由SEQ ID NO：12表示)、ORF3a(例如SEQ ID NO：2)、ORF3b(例如SEQ ID NO：3)、ORF7a(例如SEQ ID NO：14)、ORF7b(例如SEQ ID NO：15)和ORF8(例如SEQ IDNO：6)的核酸可以被***载体中以在细胞中表达。优选的细胞包括Cos1或其它细胞(例如HEK 293)。载体包含可操作地连接到启动子的SEQ ID NO：2、3、5-8、9、11-12和14-15中的任一个。优选的载体是质粒，如pREN2。通过克隆到pREN2载体中制备与Ruc的C端融合的抗原。而pREN3S载体产生N端融合体。
载体中的核酸可以与一个或多个表达控制序列可操作地连接。例如，可以将控制序列结合基因构建体中，使得表达控制序列有效控制目的编码序列的表达。表达控制序列的实例包括启动子、增强子和转录终止区。启动子是由DNA分子的区域组成的表达控制序列，通常在转录起始点上游的100个核苷酸内(通常靠近RNA聚合酶II的起始位点)。为了使编码序列处于启动子的控制之下，必须将多肽的翻译阅读框的翻译起始位点定位在启动子下游的一个和约五十个核苷酸之间。增强子在时间、位置和水平方面提供表达特异性。与启动子不同，增强子可以在位于距离转录位点不同距离处时起作用。增强子也可以位于转录起始位点的下游。当RNA聚合酶能够将编码序列转录成mRNA，然后可将其翻译成由编码序列编码的蛋白时，编码序列在细胞中被“可操作地连接”并“在表达控制序列的控制下”。
合适的表达载体包括但不限于来自例如噬菌体、杆状病毒、烟草花叶病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、痘苗病毒、腺病毒和腺相关病毒的质粒和病毒载体。许多载体和表达***可从诸如Novagen(Madison,WI)、Clontech(Palo Alto,CA)、Stratagene(LaJolla,CA)和Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA)的公司商购。最近的转染研究已经研究了小环DNA(mcDNA)，其是通过去除细菌序列的重组从pDNA衍生的核酸。可以使用本领域已知的方法，使用mcDNA将L1 RNA引入宿主细胞中(Mun等人，Biomaterials,2016；101:310-320)。
载体和包含载体的细胞被用于荧光素酶免疫沉淀***。
通常，荧光素酶免疫沉淀***利用发光重组抗原融合蛋白来定量测量患者抗体滴度。来源于海肾的海肾荧光素酶(Ruc)优选用于产生抗原融合体。由于其小尺寸(即分子量：30kDa，与绿色荧光蛋白大约相同的尺寸)，宽的线性检测范围(100–107光单位[LU])和完全缺乏与人和其它动物血清的抗原性，Ruc是理想的报告分子。可以使用其它荧光素酶，包括60-kDa萤火虫荧光素酶。一旦产生发光蛋白-抗原哺乳动物表达质粒，将这些构建体瞬时转染到合适的哺乳动物细胞，如Cos1或其它细胞(例如HEK 293)中以产生Ruc抗原。转染48小时后，将细胞刮到含有甘油的冷裂解缓冲液中，通过离心澄清并直接用于LIPS测定。
III.使用方法
所公开的SARS-CoV-2蛋白、片段和融合体可以用于设计用来鉴定从受试对象获得的生物样品中针对一种或多种SARS-CoV-2蛋白、片段或融合蛋白的抗体(“抗SARS-CoV-2抗体”、“SARS-CoV-2抗体”等)的存在的测定，以确定受试对象是否已经暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染。
可以从个体获得可能含有SARS-CoV-2抗体的生物样品。如果生物样品是组织或细胞来源的，则将样品溶解在任选地含有促溶剂、去污剂、还原剂、缓冲剂和盐的裂解缓冲液中。样品优选为取自受试对象的生物流体样品。生物样品的实例包括尿、往返吸注液(barbotage)、血液、血清、血浆、眼泪、唾液、脑脊液、组织、淋巴、滑液或痰液等。在优选的实施方案中，生物流体是全血，或更优选是血清或血浆。血清是全血的组分，既不是血细胞(血清不含白细胞或红细胞)，也不是凝血因子。它是去除的纤维蛋白原的血浆。因此，血清包含不用于血液凝固(凝结)的所有蛋白和所有电解质、抗体、抗原、激素和任何外源性物质(例如药物和微生物)。在将样品与抗体接触之前，可以用合适的稀释剂稀释样品。
通常，从受试对象获得的样品可以与一种或多种SARS-CoV-2蛋白，和/或其片段和/或融合体接触，如本文提供的那些，例如N、M、S、S1、S2’、NSP1、或由SARS-CoV-2的ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8编码的氨基酸。任选地，但优选地，将(多种)SARS-CoV-2蛋白，和/或其(多种)片段和/或(多种)融合体固定到固相支撑体上，以促进在与生物样品接触之前的清洗和随后的分离复合物。固相支撑体的实例包括例如微量滴定板、棒、珠或微珠形式的玻璃或塑料。(多种)SARS-CoV-2蛋白，和/或其(多种)片段和/或(多种)融合体也可以连接到探针底物或阵列，并且可以通过气相离子光谱法进行分析。
SARS-CoV-2抗体的免疫测定可以包括将生物样品与一种或多种SARS-CoV-2蛋白，和/或其片段和/或融合体，如本文提供的那些，例如N、M、S、S1、S2’、NSP1、或SARS-CoV-2的ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8编码的氨基酸在可以发生免疫特异性抗原-抗体相互作用的条件下接触，然后检测或测量该相互作用。抗体与SARS-CoV-2蛋白或其片段或融合体的结合可用于检测从其获得样品的受试对象中SARS-CoV-2抗体的存在。
免疫测定可包括检测和分析样品中的抗体的步骤。例如，方法可包括使生物样品与SARS-CoV-2蛋白和/或其片段和/或融合体接触的步骤，所述SARS-CoV-2蛋白和/或其片段和/或融合体可被抗体，优选为由暴露于SARS-CoV-2或以其他方式被SARS-CoV-2感染的受试对象产生的血清抗体结合；和检测样品中与SARS-CoV-2蛋白和/或片段和/或融合体结合的抗体复合物的存在。
可以使用本领域已知的任何合适的免疫结合测定检测和/或定量抗体。有用的测定包括例如荧光素酶免疫沉淀***(LIPS)测定、酶免疫测定(EIA)如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、Western blot测定或狭缝印迹测定。参见例如Methods inCell Biology.Antibodies in Cell Biology,volume 37(Asai编，1993)；Basic andClinical Immunology,Stites和Terr编，第7版，1991；和Harlow和Lane，同上。
在将样品与(多种)SARS-CoV-2蛋白，或(多种)片段或(多种)融合体一起孵育后，清洗混合物并可以检测形成的抗体-标记物复合物。这可以通过将清洗的混合物与检测试剂一起孵育来实现。该检测试剂可以是例如用可检测标记物标记的第二抗体。示例性的可检测标记包括磁珠(例如，DYNABEADSTM)、荧光染料、放射性标记、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和常用于ELISA的其他酶)、以及量热标签(calorimetric label)，如胶体金或有色玻璃或塑料珠。在一些实施方案中，使用间接测定检测样品中的抗体，其中例如使用第二标记的抗体检测结合的SARS-CoV-2特异性抗体，和/或在竞争或抑制测定中，其中例如将结合至SARS-CoV-2蛋白，和/或其片段和/或融合体的不同表位的另一种抗体与混合物同时孵育。
示例性的SARS-CoV-2抗体在下面更详细地讨论。
A.免疫沉淀***(LIPS)测定
所公开的组合物可用于荧光素酶免疫沉淀***(LIPS)测定，以检测样品中抗体的存在，并随后诊断受试对象为已暴露于SARS-CoV-2。在一个实施方案中，在仅包括ORF8作为SARS-CoV-2抗原的免疫沉淀***(LIPS)测定中，受试对象被鉴定为呈现COVID 19。在其它实施方案中，LIPS测定包括抗原ORF3b和ORF8。在另外的其它实施方案中，LIPS测定包括SARS-CoV-2的N、M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8的总和。
LIPS的第一步涉及在室温下将含有在一起的抗体和Ruc-抗原裂解物的血清孵育1小时。尽管很少是必需的，但也可通过在4℃下孵育来实现抗体结合的增加。与血清孵育后，然后将混合物转移到含有蛋白A/G珠的微量滴定滤板中再孵育1小时，以捕获游离免疫球蛋白和Ruc-抗原-抗体复合物两者。为了捕获抗体，在微量滴定滤板中使用高结合容量的蛋白A/G珠(每毫升珠结合>20mg免疫球蛋白)。抗原-抗体复合物与蛋白A/G珠孵育后，用清洗缓冲液充分冲洗滤板以除去未结合的Ruc标记的抗原。尽管可以进行使用真空歧管的手动清洗和抽吸，但是借助于机器人工作站或具有真空过滤的洗板机更容易完成清洗。过滤后，将滤板装入配备底物注射器的平板光度计中。使用LIPS，可以将报告为LU的高定量的抗体滴度值分配给临床和实验血清样品。根据这些LIPS测试，低LU反映存在很少抗体或不存在抗体，而升高的LU反映高抗体滴度。与大多数其它免疫测定不同，LIPS滴度值经常使用几何平均滴度(GMT)进行比较，这是因为LIPS数据的宽动态范围和过度分散性质，其通常根据抗原(20)以log10标度的线性表示。
因此，提供了使用LIPS检测生物流体样品中抗原特异性抗体的方法。在一些实施方案中，方法包括提供包含与发光蛋白融合的抗原的融合蛋白；使生物流体样品与融合蛋白接触，如果生物流体样品中存在抗原特异性抗体，则形成与发光蛋白融合的SARS-CoV-2抗原与特异性抗体的复合物，使用珠将其沉降。然后可以通过与结合的抗体数量成比例的底物添加来检测抗体水平。珠优选为非磁性的，并且方法不包括钕磁棒。
发光蛋白包括荧光蛋白或荧光素酶，如海肾荧光素酶(Renilla luciferase)、Gaussia荧光素酶、修饰的(优化的)Oplophorus gracilirostris荧光素酶(例如NANOLUCTM(是市售的)、萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶)、萤火虫荧光素酶或细菌荧光素酶。当荧光素酶用作发光蛋白时，荧光素酶活性用作样品中存在的抗原特异性抗体的量的量度。例如，如果使用海肾荧光素酶-抗原融合蛋白作为发光蛋白，则通过加入腔肠素来定量抗体，并且可以例如在光度计中测量荧光素酶活性。
在其它实施方案中，发光蛋白包括荧光蛋白，如绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白、红色荧光蛋白或其修饰形式，或藻胆蛋白，如B-藻红蛋白(B-PE)、R-藻红蛋白(R-PE)或别藻蓝蛋白(APC)。当荧光蛋白用作发光蛋白时，荧光强度用作样品中存在的抗原特异性抗体的量的量度。使珠结合的免疫复合物暴露于适当波长的光并测量光发射来测量荧光强度。
在优选的实施方案中，发光蛋白是海肾荧光素酶，底物是腔肠素。
免疫球蛋白结合蛋白可以是蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或第二免疫球蛋白分子。在一个优选的实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白是蛋白A/G。在其它实施方案中，免疫球蛋白结合蛋白包括第二抗体，如抗IgG抗体、抗IgM抗体、抗IgA抗体、抗IgE抗体、抗IgD抗体、或其两种或更多种的任意组合。在具体实例中，第二抗体包括抗IgG抗体。本领域技术人员可以基于例如每种蛋白抗体的特定免疫球蛋白结合性质来选择合适的免疫球蛋白结合蛋白。
生物流体样品可以是其中可存在抗体的任何生物流体。生物流体样品可以是血清、血浆、血液、尿、唾液或支气管肺泡灌洗液样品，优选是血清样品。
B.其他免疫学测定
可用于检测SARS-CoV-2蛋白的示例性免疫测定包括但不限于放射性免疫测定、ELISA、免疫沉淀测定、Western blot、荧光免疫测定和免疫组织化学。在一些实施方案中，测定单独使用ORF8的抗原，或与ORF3b和/或SARS-CoV-2的M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8中的一种或多种组合使用ORF8的抗原。
常见的酶免疫测定是“酶联免疫吸附测定(ELISA)”。ELISA是使用抗体的标记(例如，酶连接的)形式检测和测量SARS-CoV-2抗体的浓度的技术。存在本领域技术人员熟知的不同形式的ELISA。本领域已知的用于ELISA的标准技术描述于“Methods inImmunodiagnosis”，第2版，Rose和Bigazzi编，John wiley&Sons,1980；Campbell等人，“Methods and Immunology”,W.A.Benjamin,Inc.,1964；和Oellerich，M.,J.Clin.Chem.Clin.Biochem.,22:895-904(1984)。
例如，在优选的实施方案中，ELISA是“间接ELISA”。间接ELISA可以包括一个或多个以下步骤。(多种)SARS-CoV-2蛋白或其(多种)片段或(多种)融合体(即抗原)被添加、连接或以其它方式结合到表面，例如微量滴定板的每个孔(通常是96孔板)。在一些实施方案中，将抗原加入缓冲溶液中并给予时间以例如通过电荷相互作用或另一方式附着到塑料。
可以向每个孔中加入非反应性蛋白(即封闭剂)，如牛血清白蛋白或酪蛋白的溶液，以覆盖任何保持未被抗原包被的表面。
可加入生物样品(其可能含有SARS-CoV-2抗体)，并使存在的任何抗体与抗原特异性结合。未结合的样品可从孔中洗出。
添加可以检测SARS-CoV-2抗体(例如，对从其获得样品的受试对象产生的抗体的恒定区(即，人Ig恒定区)具有特异性的抗体)的存在的第二抗体，所述第二抗体具有连接的(偶联的)酶或其他可检测的标记。如果检测需要，则加入可检测标记的底物(例如酶)。通常，该底物在与酶反应后改变颜色。在一些实施方案中，使用附加层来进一步放大信号。例如，血清抗体与平板上的抗原结合。第二抗体(例如，与生物素偶联的抗人Ig抗体)与血清抗体结合，并且可检测标记连接的第三配体结合蛋白(例如，抗生物素蛋白-HRP)与第二抗体结合。与可用作第二抗体的人抗体结合的抗体的实例包括但不限于针对人Ig、IgG、IgM、IgA、IgG重链、IgG重链恒定区、IgGκ、IgGλ、IgG轻链、IgG1、IgG1+IgG2+IgG3+IgG4、IgG2、IgG2a、IgG2c、IgG3、IgG4、IgGc或其任意组合的抗体。
血清中存在的第二抗体(或第三配体结合蛋白)的浓度越高，颜色变化越强。通常，分光计用于给出颜色强度的定量值。
酶充当放大器；即使只有很少酶连接的抗体保持结合，酶分子也将产生许多信号分子。在常识限制内，酶可以无限地继续产生颜色，但是结合的抗体越多，显色将越快。
在一些实施方案中，测定为浸渍片形式。参见，例如，Wu等人，Clinical andDiagnostic Laboratory Immunology 4(4):452-7(1997)。
浸渍片可含有SARS-CoV-2抗原。在一些实施方案中，抗原被连续稀释(例如，稀释成点阵列)。浸渍片与生物样品接触，使样品中存在的抗体与抗原结合，并可类似于ELISA进行处理。在浸渍片形式中，可使用比色皿进行测定。例如，为了检测免疫球蛋白G(IgG)，可通过含有生物样品，任选的增强子、酶偶联的第二抗体(例如，抗人IgG和IgM抗体等)和任选的底物的四种反应比色皿处理浸渍片。为了检测IgM，可以使样品通过蛋白G装置以除去IgG。然后可像以前一样处理浸渍片用于IgG检测。
ELISA可以以定性或定量形式进行。定性结果提供样品的简单的阳性或阴性结果(是或否)。阳性和阴性之间的临界值由分析人员确定并且可以是统计的。通常使用两倍或三倍的标准偏差(测试中固有的误差)来区分阳性样品与阴性样品。在定量ELISA中，将样品的光密度(OD)与标准曲线进行比较，标准曲线通常是靶分子的已知浓度溶液的连续稀释。例如，如果测试样品返回1.0的OD，则给出OD＝1.0的标准曲线上的点必须具有与样品相同的分析物浓度。
根据从业者的偏好并基于当前的公开内容，可以使用其它技术来检测抗体。一种这样的技术是Western blotting(Towbin等人，Proc.Nat.Acad.Sci.76:4350(1979))，其中将适当处理的样品在SDS-PAGE凝胶上移动，然后转移到固相支撑物，如硝酸纤维素滤膜上。然后可以使用特异性结合SARS-CoV-2抗体的可检测标记的抗体来评估抗体水平，其中来自可检测标记的信号强度对应于存在的肽的量。水平可以定量，例如通过密度测定法。
在一些实施方案中，测定包括一种或多种增加本文所述测定的灵敏度或基础检测水平的方法或试剂。例如，MESO-SCALE 技术可用于增加测定的灵敏度。MSD技术包括电化学发光检测和图案化阵列的组合。/>微孔板具有整合到板底部的由炭制成的电极。生物试剂可以通过被动吸附附着到碳并保持高水平的生物活性。/>测定使用电化学发光标记物进行检测。标记是非放射性的、稳定的，具有不同偶联化学的特征。电化学发光标记在受到电化学刺激时发光，这通过微板底部的电极检测。仅电极附近的标记被激发和检测，因此可以在没有清洗步骤的情况下进行测定。另外的共反应物存在于用于测定的缓冲液中。当这些共反应物接近微板中的电极时也被刺激，并增强电化学发光信号。
IV.检测和诊断
可以使用所公开的组合物和方法检测和/或诊断和/或治疗当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染。通常，与对照相比，个体的生物样品中SARS-CoV-2抗体的存在和/或升高的量指示如本文(例如上文)所讨论的当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染。例如，用于辅助检测或诊断受试对象当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染的方法可以包括确定来自受试对象的生物样品中针对一种或多种SARS-CoV-2蛋白、片段或融合蛋白的抗体的存在或水平，其中相对于对照中抗体的水平，生物样品中抗体的存在或升高的水平指示当前或现在暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染。
在一些实施方案中，方法与检测SARS-CoV-2的方法组合。如果检测到病毒，受试对象可能有当前的暴露或感染。如果未检测到病毒，则受试对象可能没有当前的暴露或感染，并且抗体的存在可能是由于先前的暴露或感染。
任何方法可与治疗方法组合。在优选的实施方案中，治疗方法包括向受试对象施用有效量的抗病毒疗法、止痛疗法、退热剂、咳嗽抑制剂和/或呼吸辅助(例如，呼吸机治疗)。
V.试剂盒
还提供了包括用于检测和定性或定量测量受试对象的生物样品中SARS-CoV-2抗体的试剂的测定和试剂盒。例如，如果通过ELISA检测SARS-CoV-2抗体，则测定或试剂盒的组分可以包括(多种)SARS-CoV-2蛋白或其(多种)片段或(多种)融合体，其任选地固定在诸如珠或测定皿或其孔的表面上，以及任选地包括诸如可与SARS-CoV-2抗体结合的抗体(例如，对从其获得样品的受试对象产生的抗体的恒定区域(即，人IgG恒定区)具有特异性的抗体)的检测装置，其具有连接的(偶联的)酶或其他可检测的标记，例如荧光染料或放射性标记。
6.实施例
实施例1
方法
患者和样品收集
本研究共招入了26例经RT-PCR确认COVID-19感染的患者(表1)。
表1：作为海肾抗原融合蛋白产生的ORF的列表
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在中国香港(中国，特别行政区)招入15例患者，所有患者均提供知情同意书。本研究获得了中国香港医院管理局港岛西联网伦理审查委员会(the institutional reviewboard of the Hong Kong West Cluster of the Hospital Authority of Hong Kong)的批准(批准文号：UW20-169)。从肝素化血液收集血浆样品，并在56℃下热灭活30分钟。来自在COVID-19大流行之前收集的健康受试对象的性别和年龄匹配的血浆样品用作阴性对照。
SARS-CoV-2基因克隆
基于先前描述SARS-CoV-2基因组结构的研究(1,8)，选择一组广泛的12种蛋白(S、E、M、N、NSP1、ORF3a、3b、6、7a、7b、8、10)用于通过LIPS的抗体测试。
相关核酸由SEQ ID No：2-16表示。
Orf3a
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Orf3b
ATGGCTTATTGTTGGCGTTGCACTTCTTGCTGTTTTTCAGAGCGCTTCCAAAATCATAACCCTCAAAAAGAGATGGCAACTAGCACTCTCCAAGGGTGTTCACTTTGTTTGCAACTTGCTGTTGTTGTTTGTAACAGTTTACTCACACCTTTTGCTCGTTGCTGCTGGCCT(SEQ ID NO：3)；
E
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M
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Orf8
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N
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SARS-CoV-2-2019刺突蛋白(全长)
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S1(8)
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S2(8)
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S2’(8)
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Nsp1
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Orf6
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Orf7a
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Orf7b
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Orf10
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设计用于扩增SARS-CoV-2蛋白的引物(参见表2中的蛋白序列ID和引物序列)。
表2：SARS-CoV-2蛋白和LIPS的引物
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COVID 19患者的信息在表3提供。
表3.中国香港COVID-19感染患者信息
使用Platinum SuperScriptIII一步RT-PCR***，使用提取的SARS-CoV-2vRNA进行RT-PCR以扩增对应于病毒的结构和非结构蛋白的靶基因(表1，(6))。然后使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)提取条带，并用BamHI和NotI或KpnI-HF和XhoI(New EnglandBiolabs，美国)酶切。使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)将提取的产物连接到pREN2质粒(来自Peter Burbelo NDICR，NIH)中。用DH10B感受态细胞转化质粒，用PureYield Plasmid mid-prep***(Promega)纯化。通过桑格测序(Sanger Sequencing)(3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems)确认所有构建体。
SARS-CoV-2(Ruc)-抗原表达
根据制造商的说明，使用Fugene 6(Promega)将具有包含目的SARS-CoV-2抗原的pREN2-海肾荧光素酶质粒的构建体转染到Cos1细胞中。48小时后收获细胞，裂解并超声处理，根据Burbelo等人的方案使用光度计读板仪(Luminometer plate reader，PerkinElmer)测量(Ruc)-抗原产量(20)。
使用荧光素酶免疫沉淀***(LIPS)测量抗体应答
LIPS测定按照Burbelo等人的方案进行，有以下修改(20)。简言之，将(Ruc)-抗原(每孔1e7)和血浆(热灭活并以1：100稀释)以800rpm振荡孵育2小时。将Ultralink蛋白A/G珠加到96-深孔聚丙烯微量滴定板中的(Ruc)-抗原和血清混合物中，并以800rpm振荡孵育2小时。然后将整个体积转移到HTS板中并如前所述清洗。使用QUANTI-LucTM Gold底物(Invivogen，rep-qlcg5)根据制造商的说明和MicroBeta JET光度计(PerkinElmer)读板。UANTI-LucTMGold是用于检测Lucia荧光素酶和其它利用腔肠素的荧光素酶(例如Gaussia荧光素酶和海肾荧光素酶)的优化试剂盒。
通过荧光素酶与腔肠素底物的反应产生的光信号使用光度计定量并表示为相对光单位(RLU)。实验对照包括具有抗原的空白孔和来自在COVID-19大流行之前收集的年龄匹配的未感染患者血浆的阴性对照血清。
酶联免疫吸附测定
用可用的SARS-CoV-2蛋白刺突蛋白(S1+S2)和核蛋白(N)蛋白进行ELISA测定。简言之，将重组S和N蛋白(Sinobiological)以80ng/ml的浓度在100/μl包被缓冲液(含有53％Na2CO3和42％ NaHCO3的PBS，pH 9.6)中在4℃下包被在96孔平底免疫吸附板(Nunc ImmunoMaxiSorp，Roskilde，Denmark)上过夜。使用包被有非特异性蛋白(封闭缓冲液，含5％FBS的PBS)的另外的板测量每个样品的背景结合。在FBS封闭和彻底清洗后，将稀释的血浆样品(1：100)结合2小时，进一步清洗，然后通过用IgG特异性HRP标记的抗人Ig第二抗体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)检测。
微量中和测定
从1：10的稀释度开始，以连续的两倍稀释度稀释血浆样品，并与等体积的SARS-CoV-2混合，SARS-CoV-2的剂量分别为由Vero E6细胞测定的200组织培养感染剂量50％(TCID50)。在37℃下孵育1小时后，将35μl病毒-血清混合物一式四份添加至96孔微量滴定板中的Vero或Vero E6细胞单层中。吸附1小时后，除去病毒-血清混合物，并在各孔中用150μl病毒生长培养基替换。将板在37℃下在5％ CO2中在加湿培养箱中孵育3天。在接种后第3天观察到细胞病变效应。保护50％重复孔的最高血浆稀释度表示为中和抗体滴度。每批测试中均包括输入病毒的病毒反向滴定。
冠状病毒的多重比对
使用CLUSTAL 2.1进行HKU1(AY597011.2)、HCoV-229E(AF304460.1)、HCoV-OC43(AY391777.1)和HCoV-NL63(AY567487.2)相对于SARS-CoV-2(MN908947)的多氨基酸比对。
统计
使用GraphPad Prism 6软件(San Diego，CA)进行统计学分析。抗体水平表示为几何平均值+/-标准偏差(标准差)。对于灵敏度和特异性的计算，从对照的平均值加上三个标准偏差得出每种抗原的临界值限度。使用GraphPad 8Prism软件，使用非参数曼-惠特尼U检验比较COVID-19和阴性组之间的抗体水平。
结果
一组15种SARS-CoV-2ORF被制成海肾荧光素酶-抗原融合蛋白，以使用LIPS与一组健康阴性对照相比，评估来自中国香港的15名COVID-19感染患者的体液免疫应答。四种SARS-CoV-2结构蛋白显示出与SARS-CoV的高氨基酸序列同源性，但不与引起普通感冒的其它人冠状病毒具有高氨基酸序列同源性(表4)。
表4.SARS-CoV-2结构蛋白与其它人冠状病毒的氨基酸序列同源性％对比。
*NB：来自(8)Chan JF,Kok KH,Zhu Z,Chu H,To KK,Yuan S等人，Emerg MicrobesInfect.2020；9(1):221-3。
与健康对照相比，在COVID-19患者中检测到显著更高的对完整刺突蛋白(S)、核蛋白(N)和膜蛋白(M)的抗体应答(分别为p<0.0001，p＝0.023和p＝0.0116，图1B-D)。与健康对照(p＝0.0591，图1D)相比，COVID-19患者没有显示任何增加的包膜蛋白抗体产生(图1E)。
结果通过传统的IgG ELISA证实，其与完整S的LIPS LU滴度(R2＝0.5289)很好地相关(图6A和B)。通过ELISA测得的N-特异性IgG在COVID-19患者中也升高(图6C)，但与LIPS结果不强相关(图6D)，但按照通过对N蛋白的免疫吸收进行的证实，相似的抗原区被结合(图6E)。
在COVID-19患者中检测到的关键病毒免疫原S1亚基的抗体显著高于健康对照(5191+/-1469LU相对4003+/-1062LU，p＝0.0288，图2A)。有趣的是，在LIPS测定中，COVID-19患者和健康对照之间针对S2的抗体没有差异(p＝0.5683)。在COVID-19患者中，针对S2’裂解亚基的抗体显著较高(S2’的p＝0.0391，图2A-B)，但组之间的总体抗体水平相当可观。通过LIPS测得，具有较高SARS-CoV-2微量中和(MN)滴度(>160血清稀释度倒数)的患者也具有较高的对完整-S的应答，而在高或低MN COVID-19患者中对亚基S1、S2和S2’的LIPS应答中没有观察到差异(图2B，p＝0.0049)，但是通过ELISA测得具有较高S应答的受试对象也具有通过LIPS测得的较高S应答(图2C)。
接下来研究对先前未表征的SARS-CoV-2的ORFS具有特异性的抗体的存在。因为完整的ORF1ab由于其延伸的长度(>21000bp，(1))而不能产生，我们克隆并表达了代表性抗原，非结构蛋白1(NSP1)。生物信息学预测已经揭示了NSP1在抑制抗病毒宿主应答中的推定作用(8)。
使用LIPS检测对NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF10具有特异性的抗体(图3A-I)。COVID-19患者与健康对照相比具有显著更高的NSP1抗体水平(5301+/-854.7LU相对于3683+/-726.4LU的平均值，p<0.0001，图3A)。此外，在COVID-19患者中检测到针对ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8的显著更高的抗体水平(p＝0.0302，p<0.0001，p<0.0001，p＝0.0019，p<0.0001，图3B、C、D、F、G)。对于ORF3b(7712+/-2947LU相对3599+/-1029LU)和ORF8(16933+/-7489LU相对5440+/-1096LU)，观察到COVID-19和健康对照之间在ORF间平均抗体信号的最大差异(图3C和G)。同时，COVID-19患者和健康对照之间的ORF6和ORF10抗原没有显著差异(图3D和H)。
总的来说，在该LIPS测定中测试的抗体应答之间，我们在第4天至第22天的所有感染时间点检测到COVID-19群体中对11种抗原有特异性的显著水平的抗体(表1)(参见下文图4A-L中早期时间点检测)。未检测到针对所测试的4种SARS-CoV-2抗原的抗体的显著产生：E、S2、ORF6和ORF10蛋白。因此，不同SARS-CoV-2抗原的灵敏度和特异性(图3I)显示N、ORF3b和ORF8胜过其它病毒抗原。
来自15名COVID-19患者的总体SARS-CoV-2抗体应答的比较揭示抗-N抗体支配通过LIPS检测的体液应答(图3J)，而其它抗原对大量抗-SARS-CoV-2抗体应答作出较低和类似的贡献(图4H、I)。
在我们队列中没有性别和年龄影响
许多国家的流行病学数据表明，男性比女性发展出更严重的COVID-19相关症状(21)。因此，评价了所研究的COVID-19患者队列中性别对抗体应答的影响，并发现所有测试的抗原靶点之间没有差异(p＝0.6289，图6A)。类似地，SARS-CoV-2抗体应答在年龄低于和高于60岁的患者间是相当的(p＝0.9363，图6B)。
作为COVID-19的潜在诊断工具的组合抗原测试组
在COVID-19群体中发现所测试的15种抗原中有11种的水平显著较高。接下来，确定它们正确鉴定COVID-19患者的能力。因此，基于健康阴性对照组的平均值加上三个标准偏差(22-24)，计算这11种抗原中每一种的LIPS抗体信号的临界值，以及每项测试的灵敏度和特异性(表5和图3I、4A-G)。
表5：通过LIPS测得对11种相关SARS-CoV-2抗原的临界值和灵敏度，以及11种相关测试的总和，N+ORF3b+ORF8测试的总和，ORF3b+ORF8测试的总和，以及S+S1+S2’测试的总和。
所有11项测试的临界值显示SARS-CoV-2LIPS测定的高特异性，阴性对照组没有样品高于临界值。另一方面，8种抗原显示低灵敏度(M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF7a、ORF7b低于75％，图4A)，因此不足以正确鉴定所有具有高假阴性率的COVID-19患者(表5)，限制了它们用于LIPS诊断。另一方面，N、ORF3b和ORF8抗原显示分别为93.3％、86.6％和100％的良好灵敏度水平(表5)。值得注意的是，ORF8是正确鉴定包括疾病发作后第4天在内的所有COVID-19患者的11项测试的唯一抗原(图3I)。
由于许多LIPS测试显示低灵敏度，因此基于用于11项不同的SARS-CoV-2抗原测试的LIPS抗体LU信号的组合的方法则被用于有效地检测该群体中的SARS-CoV-2暴露(22-24)。这种组合来自11项LIPS测试的LU值的方法将诊断急性感染期间COVID-19感染的灵敏度提高到100％(图4A，蓝点为<14天)。此外，仅3项LIPS测试，抗N、ORF3b和ORF8抗体的LIPS测试的组合也具有100％的灵敏度和特异性(图4B和表5)。由于ORF3b和ORF8在所有病毒蛋白间显示出与以前的SARS-CoV具有最低的同源性(8)，因此也分别研究了针对ORF3b和ORF8的应答的组合(图4C)。观察到与上述相同的趋势，所有COVID-19患者具有高于临界值的组合评分，所有阴性对照具有低于临界值的组合评分，所有早期时间点均被正确检测(图4E-G)。通过仅组合3种相关刺突蛋白LIPS测试(S，S1，S2’)，LIPS测试的灵敏度急剧下降至26.6％，因为COVID-19患者中仅有4个具有高于临界值的总组合的LU(图4D)。有趣的是，来自早期时间点(第4天至第13天)的所有样品具有低于S+S1+S2’的临界值的LU信号(蓝色点，图4D)。11种相关抗原(图4E)和N+ORF3b+ORF8(图4F)应答的强度显著提升了以早期时间点样品对患者的检测。因此，单独的ORF3b和ORF8测试的组合使用足以在感染的任何时间点检测暴露于COVID-19的受试对象。
因为地方性HCoV是普遍存在的，所以阴性对照血浆样品很可能具有针对一系列HCoV的抗体。与其它HCoV的序列同源性可导致通过LIPS检测交叉反应性抗体并降低血清学测定的特异性。SARS-CoV-2的结构蛋白与其他HCoV结构蛋白仅共有18-40％的同源性(表4)，使得现有抗体的潜在交叉反应性不可能且未确定。虽然SARS-Cov-2和SARS-CoV，N和S共有94％和76％的保守性(表4)，但以前的报告显示ORF3b和ORF8的同源性最低，分别为32％和40％的氨基酸同源性(8)，使它们成为SARS-CoV2的最独特的基因。
为了研究抗体应答对抗原组的特异性，从COVID-19感染患者的平均LU中减去健康阴性对照的平均LU水平，并比较每种抗原之间的该差异(图4H)。发现N-特异性抗体应答与所有其他相关抗体应答(M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8)相比，该差异显著更高(p<0.0001，图4I)，突显了N在SARS-CoV-2体液免疫应答中可能的优势和特异性。除了N，ORF8和ORF3b也看起来是重要的抗原靶点(图4H、I)。统计学分析(ANOVA)揭示ORF8与所有其它抗原相比显著增加(p<0.0001相对10种剩余抗原：M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、3b、7a和7b，图4H、I)。虽然ORF3b的结果针对排除ORF7a的其余8种抗原(M、S、S1、S2’、NSP1、ORF3a、3b和7b)是显著的(图4H、I)。因此，ORF3b和ORF8被新鉴定为特异性和独特的抗原靶点。
讨论
使用LIPS技术和来自转染细胞的粗裂解物，我们筛选了所有结构蛋白以及SARS-CoV-2病毒的所有ORF(ORF1ab仅NSP1)，以鉴定COVID-19患者体液免疫应答的新的和独特的抗原靶点。
在测试抗体特异性的15种蛋白中，与健康的大流行前对照相比，11种抗原在COVID-19患者中显示显著更高的应答。对于刺突蛋白亚基，通过本文进行的LIPS测试测得，在COVID-19患者中仅针对S1和S2’的抗体升高，并且S2应答与对照组没有显著差异。通过在病毒内吞作用过程中裂解S2形成S2’融合肽的病毒颗粒的三聚体S构象和成熟可导致它们的抗原性差异。具有较高MN滴度的患者具有相应较高水平的完整刺突蛋白LIPS和ELISA结果，确立了完整S蛋白测定之间的一致性。检测到的N抗体应答在患者中也升高，但LIPS和ELISA N抗体测定之间的相关性较低。
接下来，克隆病毒ORF1ab的所有可用的ORF(仅作为NSP1)，ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8和ORF10，以获得更广泛的病毒的免疫原性靶点的信息。研究显示，这8个ORF中的6个在患者中诱导体液免疫应答(NSP1(ORF1ab)、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8)。此外，通过基于阴性群体的平均值+3个标准偏差计算临界值，确定这11种抗原中只有3种可用于高性能诊断测试：N、ORF3b和ORF8。通过使用几个抗体信号的组合结果并计算这些应答的临界值，发现11个相关抗体测试的总和是高度敏感的和特异性的。此外，仅将3种最具信息和最敏感的抗原N、ORF3b和ORF8组合，获得了100％的灵敏度和特异性，相对于阴性对照正确鉴定了所有COVID-19患者。
刺突蛋白负责病毒进入宿主细胞，是引发中和抗体的主要抗原(10)。虽然通过LIPS检测到在患者和对照之间在对S、S1和S2’的应答强度上的显著差异，但这些抗原不显示高灵敏度水平，特别是对于疾病发作后早期收集的血清。S蛋白还引发靶向保守表位的非中和抗体(11)，并且在目前测试的队列中，已经观察到一些患者没有体外中和，特别是在早期时间点。
除了刺突蛋白之外，通过LIPS对多种抗原的组合可以是用于确定SARS-CoV-2暴露以克服假阴性结果的补充血清学测试的基础。本研究表明，N、S或ORF3b抗体在早期时间点(第4天至第14天)的单一测试检测导致高比例的假阴性结果，而N+ORF3b+ORF8测试的最小组合是高度灵敏的和特异性的。
重要的是，ORF3b和ORF8是与SARS-CoV最不相同的蛋白(8)，并且它们不存在于人冠状病毒的其它毒株中。然而，关于它们的功能和表达知之甚少。以前的报告发现SARS-CoV的ORF3b通过抑制1型干扰素合成在与先天免疫***的相互作用中起重要作用(33)。在SARS-CoV中，ORF8显示在内质网中积累并通过自体吞噬介导细胞死亡(32)。在SARS-CoV-2中，这些ORF的功能尚未被确定。重要的是，ORF8只能在人和蝙蝠SARS样CoV(35)中发现，本研究在阴性对照血浆中观察到非常低的背景检测，产生高度特异性的结果。虽然ORF8缺失的SARS-CoV-2病毒具有降低的复制适合度，但是这个问题可能破坏ORF8单独在血清学检测中的效用。大多数市售或公开的血清学测试仅使用S抗原，少数使用S和N抗原两者(11,36,37)。这里对病毒抗原的广泛测试显示，另外的靶点对于早期检测抗体应答和鉴定COVID-19患者是重要的。与ELISA光密度测量相比，通过我们的SARS-CoV-2LIPS测定测量的高数量级和范围的抗体量是有利的。这些优点可有助于快速筛选康复的COVID-19患者的升高的抗体，以捐献血清用于通过被动转移治疗其它患者(38)。
仅IgG与LIPS测定中使用的蛋白A/G结合，因此使用结合所有免疫球蛋白轻链的蛋白L可用于检测IgM早期应答。在我们的测定中，E、S2、ORF6和ORF10抗体在COVID-19患者中没有显示升高的水平，与Wang H等人通过微阵列的发现一致(29)。
总之，研究表明N+ORF3b+ORF8的组合使用提供了一种灵敏的和特异性的方法，其用于检测我们队列中的所有COVID-19患者，即使在早期时间点，而刺突蛋白却不提供。
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实施例2
在实施例1中，我们使用LIPS初步评估抗体对一组15种SARS-CoV-2抗原的应答，15种SARS-CoV-2抗原代表15名COVID-19患者和15个流行前阴性对照中的结构和非结构病毒蛋白。测试了针对4种结构蛋白(S、N、M和E)、3种S亚基(S1、S2、S2’)、7种可用的ORF(ORF3a、3b、6、7a、7b、8和10)和ORF1a/b(NSP1)内1种相关NSP的抗体。计算为阴性血浆样品上的结果的平均值加上3个标准偏差的临界值实现了对灵敏的和特异性测试的选择。在该第二项研究，实施例2中，我们然后进一步在来自早期(n＝51，症状发作后<14天)和晚期时间点(n＝33，症状发作后>14天)的总计84名COVID-19患者血浆和176个阴性对照的更大组血清上验证我们选择的测定，以评估相关N、ORF3b和ORF8抗原靶点的测定性能。最后，测试来自患者的连续样品以确定抗体应答的动力学。
方法
患者和样品收集
基于在中国香港具有RT-PCR确认COVID-19感染的可用患者的招募，我们的研究招入了共84名成人患者，并使用了84名COVID-19患者血浆样品，包括14名具有2-4个取样时间点的受试对象和51个早期时间点样品(≤第14天)。样品日被定义为症状发作后的当天。COVID-19患者研究获得了中国香港医院管理局港岛西联网伦理审查委员会的批准(批准文号：UW20-169)，所有患者均提供了知情同意书。
为了增加样品规模并验证在被测试的第二组样品上的发现(图8-10)，收集了来自在COVID-19大流行之前健康受试对象(最小年龄为16岁，最大年龄为65岁)的更大一组176个另外的阴性对照血浆。该阴性对照血浆来自于2017年6月至8月(在COVID-19出现之前)收集的中国香港献血者，其最近被用作中和测定的对照队列。阴性对照献血者的召集获得了中国香港大学伦理审查委员会(the Institutional Review Board of The Hong KongUniversity)和港岛医院西联网(the Hong Kong Island West Cluster of Hospitals)的批准(IRB参考号UW16-254)。从肝素化血液收集血浆样品，并且在实验使用之前56℃下热灭活30分钟。
SARS-CoV-2基因克隆
基于先前描述SARS-CoV-2基因组的结构的研究，选择一大组12种蛋白(S、E、M、N、NSP1、ORF3a、3b、6、7a、7b、8、10)用于通过LIPS的抗体测试(表1)。设计了用于扩增SARS-CoV-2蛋白的引物(表2)。使用Platinum SuperScriptIII一步RT-PCR***，使用从在VeroE6细胞中生长的SARS-CoV-2病毒株BetaCoV/Hong Kong/VM20001061/2020中提取的RNA进行RT-PCR，以扩增对应于病毒的结构和非结构蛋白的靶基因(表1)。然后使用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen，德国)提取条带，并用BamHI和NotI或KpnI-HF和XhoI(New EnglandBiolabs，美国)酶切。使用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)将提取的产物连接到pREN2质粒(来自Peter Burbelo NDICR，NIH)中。用DH10B感受态细胞转化质粒，用PureYield Plasmid mid-prep***(Promega)纯化。通过桑格测序(Sanger Sequencing，3730xl DNA Analyzer Applied Biosystems)确认构建体。
SARS-CoV-2(Ruc)-抗原表达
根据制造商的说明，使用Fugene 6(Promega)，将具有含有目的SARS-CoV-2抗原的pREN2-海肾荧光素酶质粒的构建体转染到Cos1细胞中。48小时后收获细胞，裂解并超声处理，根据Burbelo等人的方案使用光度计酶标仪(PerkinElmer)测量(Ruc)-抗原产量。在Cos1细胞中产生后，测试每种Ruc-融合抗原的LU产量。然后在每次LIPS测定之前将LU标准化为每个孔中每抗原107LU，因此在转染期间回收荧光素酶标记的蛋白的不同产量对于测定是受控的，并且血浆样品针对相同量的每种抗原进行测定。
使用LIPS测量抗体应答
LIPS测定按照Burbelo等人的方案进行，有以下修改：简言之，将(Ruc)-抗原(每种抗原的浓度相等，为每孔107)和血浆(被热灭活并稀释至1:100)以800rpm振荡孵育2小时。将Ultralink蛋白A/G珠加到96-深孔聚丙烯微量滴定板中的(Ruc)-抗原和血清混合物中，并以800rpm振荡孵育2小时。然后将整个体积转移到HTS板中并如前所述清洗。在WallacMicroBeta JET光度计1450LSC&发光计数器(Luminescence counter)和其分析软件(PerkinElmer)上使用QUANTI-luc Gold底物(Invivogen)根据制造商的说明读板。实验对照包括含有(Ruc)抗原的无血浆空白孔和来自在COVID-19大流行之前收集的年龄匹配的未感染患者血浆的阴性对照血清。背景对应于来自具有蛋白A/G的每种Ruc-融合抗原和没有血浆的底物的LU信号。
酶联免疫吸附测定
用可用的SARS-CoV-2蛋白刺突蛋白(S1+S2)和核蛋白(N)蛋白以及HCoV OC43、NL63和229E刺突蛋白(SinoBiological)进行ELISA测定。简言之，将重组S和N蛋白以500ng/ml的浓度在100/μl包被缓冲液(具有53％ Na2CO3和42％ NaHCO3的PBS，pH 9.6)中在4℃下包被在96孔平底免疫吸附板(Nunc Immuno MaxiSorp，Roskilde，Denmark)上过夜。使用包被非特异性蛋白(封闭缓冲液，含5％FBS的PBS)的另一板测量每个血浆样品的背景结合。在FBS封闭和彻底清洗后，将稀释的血浆样品(1:100)结合2小时，进一步清洗，然后以1:5000稀释度通过用HRP(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)标记的抗人IgG第二抗体检测。
氮吸附
将血浆(n＝3)在5μg/ml N蛋白包被的96圆孔板上孵育，在37℃下以800rpm振荡2小时，两次。然后如上所述进行N LIPS。
微量中和测定
参见实施例1
冠状病毒的多重比对
参见实施例1
ORF3b-ORF8点聚类
用Hans Hagen(http://www.pragma-ade.nl)开发的LuaMetaTeXengine(2020.05.18版)，通过免费软件ConTeXt对ORF3b和ORF8全数据集进行了处理，得到图9G所示的2D云，LuaMetaTeXengine使用TeX、Metapost和Lua。红线(方程：0.2185ORF3b+0.5927ORF8＝4643.1972)实现在阴性对照(灰色点)和阳性患者(红色点)群体之间最准确的区分。
统计和重现性
使用GraphPad Prism第8版软件(San Diego，CA)进行统计学分析。抗体水平表示为几何平均值+/-标准偏差(标准差)。对于灵敏度(阳性群体中真阳性的％，真阴性不存在)和特异性(阴性群体中真阴性的％，假阳性不存在)的计算，从对照的平均值加上三个标准偏差得到每种抗原的临界值界限。还测定了阳性预测值(PPV)(真阳性的n/(真+假阳性))和阴性预测值(真阴性的n/(真+假阴性))(表5)。使用非参数双侧曼-惠特尼U检验比较COVID-19和阴性组之间的抗体水平。在图4H中，进行带有图基多重比较检验(Tukey’s multiplecomparison test)的普通单向ANOVA。由于N和所有其它10种抗原之间的比例差异，进行第二次带有图基多重比较检验的普通单向ANOVA，排除N以确定剩余10种抗原中的优势。所有实验独立地重复两次。有关研究设计的另外的信息可在与本文相关的自然研究报告概述(the Nature Research Reporting Summary)中获得。
结果
通过ORF3b和ORF8验证用于诊断的第二较大队列和二维平面中的LIPS
为了验证这些发现，我们进一步将我们的样品规模增加到84个COVID-19血浆和176名对N(图7A)、ORF3b(图7B)和ORF8(图7C)抗体应答的阴性者。我们观察到如上述的所有三项测试的高特异性(>95％)(图7D)、N(83.3％灵敏度)和ORF8(84.5％灵敏度)显示最高的灵敏度(图7C)。而N+ORF3b+8的总和将灵敏度增至87.5％(图7D)。ORF3b和ORF8抗体值在二维平面(x，y)中的表示使得COVID-19(红色)和阴性队列(灰色)的可视化和定义更清楚(图7F)。实际上，通过引入最佳判别线(在平面内平行于向量的线(0.2185；0.5927))，我们可以清楚地辨认阳性和阴性群体。176例的阴性对照组中仅有1名患者为离群值，所有其他阴性患者均明确被鉴定为阴性，特异性为99.5％。同时，聚类分析的灵敏度也提高到96.5％，相对来说，ORF3b+ORF8的总和提高到81％(图7G)。这种几何解释实现COVID-19的高度准确诊断，并强调这两种抗体应答ORF3b和ORF8的诊断相关性要一起考虑。
通过LIPS的ORF3b+ORF8特异性抗体的早期诊断应用
SARS-CoV-2的血清学诊断的主要挑战之一是在早期时间点鉴定感染。从第0天到第14天样品的N、ORF3b和ORF8测试的评估揭示25.5％、37.3％和19.6％的样品被错误鉴定(低于临界值，图8A-C、9)。然而，使用ORF3b+ORF8总和改善了这些早期时间点样品的诊断，灵敏度为86.4％，实现在症状发作的14天内正确检测51个样品中的44个(图8C)。
S、N、ORF3b和ORF8的纵向抗体应答的表征
纵向研究使得能够评估抗体应答的动力学，尤其是抗体衰减。从14名患者中收集2-4个时间点的纵向和成对样品用于纵向测量S、N、ORF3b和ORF8抗体应答。对N、S、ORF3b和ORF8的抗体应答随时间(甚至直至第100天)良好维持(图8D)。值得注意的是，在所测试的4种抗体中，ORF8和S抗体在所有患者中遵循非常相似的趋势(图8D，蓝色线(S)和绿色线(ORF8))。实际上，通过LIPS测得的ORF8和S特异性抗体应答的动力学显著相关(R2＝0.66902，p<0.0001)(图8E)，而其它抗体应答则不相关。以前，据报告SARS-CoV感染的细胞中的ORF8与刺突蛋白有强烈的联系，同时也抑制包膜蛋白的表达，这可以解释在SARS-CoV-2感染中此处观察到的血清学趋势。
从纵向样品测定抗体水平从急性期(症状发作后<14天)到恢复期(第14-30天)和长期记忆(>31天)应答的倍数变化(图8F)。在长期记忆时N应答显著增加(p＝0.0359)，而S、ORF3b和ORF8均显示出类似的维持应答的趋势，倍数变化接近1(图8F)。值得注意的是，随着时间的推移，ORF8和ORF3b应答在患者中是最稳定的(具有最窄的标准偏差)，使它们成为急性和过去感染的理想标志物。
现有HCoV应答缺乏通过LIPS对N、ORF3b和ORF8的交叉反应性
由于HCoV的高患病率，我们评估了我们的阴性队列中β-HCoV(OC43)和α-HCoV(229E和NL63)刺突蛋白抗体的阳性。我们发现，在ELISA中，我们的阴性队列中有89.6％是OC43刺突蛋白阳性的(OD>1.00，图10j)，而在我们的SARS-CoV2 LIPS测定中，这些样品是真阴性的，对OC43应答者和无应答者的应答相当(图10a-j)。对于α-HCoV229E和NL63观察到相同的趋势，具有较低的患病率(分别为21％和19％刺突蛋白IgG阳性，图10j)。类似地，在以前的研究中发现常见的βHCoV HKU-1在一般成人群体中非常普遍(HKU-1刺突蛋白抗体98％阳性)7。当我们将我们的阴性队列(n＝176)分成具有高或低刺突蛋白OC43、229E或NL63IgG应答的供体时，我们发现这些组之间对于通过LIPS测得的N、ORF3b和ORF8应答没有差异(图10)。因此，这些结果清楚地证明了我们的N、ORF3b和ORF8 LIPS测试的高特异性，尽管在大多数样品中的地方性HCoV具有高患病率。
讨论：
SARS-CoV-2抗体测试是最近和过去COVID-19感染诊断的主要组成部分。抗体测试对于确定群体中的感染发病率、群体免疫力和为疫苗开发提供信息是重要的。我们首次报告了使用LIPS技术检测针对广谱的15种SARS-CoV-2抗原的抗体应答，以鉴定COVID-19患者体液免疫应答的新的和独特的抗原靶点。在我们的小组中，11种抗原在COVID-19患者中显示升高的抗体应答。
其中，刺突蛋白结构蛋白负责病毒进入并广泛用作感染的标志物。在克隆的刺突蛋白亚基S1、S2、S2’中，通过我们的LIPS测试，在COVID-19患者中仅S1和S2’的抗体升高。
通过在病毒内吞作用过程中裂解S2形成S2’融合肽的病毒颗粒的三聚体S构象和成熟可以解释S2和S2’之间的抗原性差异。
此外，对SARS-CoV-2的独特ORF的抗体应答的评估揭示了ORF3b、ORF8和N的组合使用是在所有时间点的感染的准确标志物。ORF3b和ORF8是与SARS-CoV最不相同的蛋白，同源蛋白不存在于HCoV的其他毒株中，除了沙贝病毒。然而，关于它们在SARS-CoV-2中的功能和表达知之甚少。以前的报告发现SARS-CoV的ORF3b通过抑制1型干扰素合成在与先天免疫***的相互作用中起重要作用。在SARS-CoV中，ORF8已经显示在内质网中积累并通过自体吞噬介导细胞死亡，并与S蛋白相关。更重要的是，最近的发现报告SARS-CoV-2利用ORF8以改变MHC-I的表达以逃避免疫监视。在一些新加坡的COVID-19患者中已经报告了ORF8的缺失，但是该谱系在新加坡没有延续，在其它国家也没有维持。
地方性人冠状病毒是普遍存在的，并且与其它人冠状病毒(HCoV)，例如α-HCoV毒株：229E和NL63，和β-HCoV：HKU1和OC43的序列同源性可导致预先存在的交叉反应性抗体的检测并降低血清学测定的特异性。然而，SARS-CoV-2和其它常见的HCoV的结构蛋白仅共有18-40％的氨基酸同源性(表4)。我们在本文中显示，尽管我们的阴性队列中OC43、229E和NL63的血清阳性率高，但不存在与我们的N、ORF8和ORF3b抗体LIPS测试的交叉反应性，这对于它们广泛用于诊断是至关重要的(图10g和图13)。
我们的结果需要在来自所有洲的队列中得到确认，以解释跨不同种族和病毒株的抗体应答。LIPS平台实现针对许多抗原进行广泛的抗体筛选，但是需要将测定翻译成更简单的设置(例如ELISA)以用于大规模诊断，特别是在资源匮乏的环境中。
总之，我们的结果提供了对与COVID-19相关的抗体应答的总体谱的了解，因为患者产生针对刺突蛋白以外的结构和非结构蛋白的抗体。当发现现有的刺突蛋白和N蛋白IgELISA呈阳性时，需要改善目前的血清学诊断测试，用于在症状发作后早期检测感染，以及用于验证性测定。除了N蛋白，由于ORF8抗体的免疫优势和特异性，我们已经鉴定了ORF8抗体作为对SARS-CoV-2感染的急性期、恢复期和长期抗体应答的主要标志物。此外，ORF3b和ORF8的组合应用提供一种检测COVID-19感染的高度灵敏的和特异性的方法，既可以在感染的早期也可以在感染的晚期。尽管普通感冒HCoV的高患病率，但我们已经证明了我们的测定对SARS-CoV-2的特异性。需要进一步研究针对这些非结构靶点的抗体的保护潜力。这些信息将有助于优先考虑用于疫苗开发的抗原靶点、单克隆抗体试剂和最重要的通过标准化免疫测定对感染的早期应答的检测。
实施例3
方法
患者和样品收集
基于在中国香港对具有RT-PCR确认COVID-19感染的可用患者的招募，我们的研究共招入122名儿童患者和36名成人患者。我们使用总共254个COVID-19儿童血浆样品，包括来自58名有2-4个取样时间点的受试对象的146个纵向样品，和119个早期时间点样品(<第14天)。使用来自儿童(平均值±标准差：39±47天，范围：0-206天)和成人(平均值±标准差：54±20天，范围：24-123天)的样品，样品日被定义为症状发作后或通过接触追踪或隔离RT-PCR确认无症状病例的当天。为了测量IFNα，使用了在第7天之前采样的另一组18名COVID-19成人患者，与COVID-19小儿队列中在第7天之前收集的48个样品相比。COVID-19患者研究由各个医院的伦理审查委员会，即九龙西联网(KW/EX-20-039(144-27))，九龙中联网/九龙东联网(KC/KE-20-0154/ER2)和HKU/HA港岛西联网(UW 20-273，UW 20-169)、联合中国香港中文大学—新界东联网临床研究伦理委员会(New Territories East ClusterClinical Research Ethics Committee)(CREC 2020.229)批准。所有患者均提供了知情同意书。
该研究中使用的阴性对照血浆样品来自于2017年6月至8月(COVID-19出现前)采集的中国香港献血者，共使用33份血浆样品，包括阴性小儿样品(n＝20)和阴性成人样品(n＝13)。阴性对照献血者的召集获得了中国香港大学和港岛医院西联网的伦理审查委员会的批准(批准文号：UW16-254)。从肝素化血液收集血浆样品。来自COVID-19患者或阴性对照的所有样品在实验使用前在56℃下热灭活30分钟。关于样品队列的详情呈现于表6。
表6：受试对象队列详情
SARS-CoV-2克隆和(Ruc)-抗原表达
基于先前描述SARS-CoV-2基因组结构的研究25,36，选择一大组的14种蛋白(S1、S2、S2’、E、M、N、NSP1、ORF3a、3b、6、7a、7b、8、10)用于通过LIPS的抗体测试。用于扩增SARS-CoV-2蛋白的引物和克隆如前所述14。将含有目的SARS-CoV-2抗原的pREN2-海肾荧光素酶质粒的构建体转染到Cos1细胞中，并如前所述制备14。
使用LIPS测量抗体应答
按照Burbelo等人的方案进行LIPS测定，如前所述14，有以下修改36。简言之，将(Ruc)-抗原(每种抗原的浓度相等，每孔10^7)和血浆(热灭活和1:100稀释)在800rpm振荡下孵育2小时。将Ultralink蛋白A/G珠(Thermo-Fisher)加到96-深孔聚丙烯微量滴定板中的(Ruc)-抗原和血清混合物中，并以800rpm振荡孵育2小时。然后将整个体积转移到HTS板(Millipore)中并如前所述清洗。在Wallac MicroBeta JET光度计1450LSC&发光计数器和其分析软件(PerkinElmer)上使用QUANTI-luc Gold底物(Invivogen)根据制造商的说明读板。实验对照包括含有(Ruc)抗原的无血浆空白孔和在COVID-19大流行之前收集的来自健康供体血浆的阴性对照血清。背景对应于来自具有蛋白A/G的每种Ruc-融合抗原和没有血浆的底物的LU信号。
酶联免疫吸附测定
根据制造商的说明，使用总人IgG ELISA试剂盒(Thermo-Fisher)以1:500000的最终稀释度测量血浆样品中的总IgG。根据制造商的说明，使用人IFN-α铂ELISA试剂盒(Invitrogen)以1:5的稀释度测量血浆样品中的IFN-α。
点的聚类
SARS-CoV-2抗体数据集已经通过免费软件ConTeXt处理，免费软件ConTeXt具有由Hanshagen开发的LuaMetaTeXengine(2020.05.18版)(http://www.pragma-ade.nl)，其使用TeX、Metapost和Lua来获得图16a、b、c，图20C中显示的点的3D聚类。为了清楚，只有数据集的前144个COVID-19小儿样品以点聚类表示，连同n＝36个COVID-19成人样品和n＝28个阴性样品。
在聚类(N、ORF3b、ORF8)中，红线的公式为：(1)在平面中(N、ORF8)：830×log(N)+0.3843×ORF8＝4801和-350×log(N)+1.036×ORF 8＝790，以及(2)在平面中(ORF3b、ORF8)：0.035×ORF3b+0.1334×ORF8＝409.284和0.074×ORF3b+0.0437×ORF8＝221.812。这些直线实现在阴性对照和阳性成人群体之间最准确的区分。
主成分分析
14种抗原的LU在PCA分析之前进行对数标度转化(数据集中的负值和零值用1代替)。通过概率模型估算数据集中的缺失值37。概率模型容许10％至15％之间的缺失值的量，这适合我们的数据。使用pcaMethods(1.80.0版)估算缺失数据38。在输入标准PCA(使用FactoMineR(2.4版))之前，将完成的数据标准化(缩放)39。使用factoextra(1.0.7版)提取PCA结果并使之可视化40。
统计和重现性
使用GraphPad Prism第8版软件(San Diego，CA)进行统计学分析。所有实验独立地重复两次。抗体水平表示为个体应答和几何平均值+/-标准偏差(标准差)。进行具有图基多重比较检验的普通单向ANOVA以比较图14和15中的小儿、成人和阴性群体，以及图18中的早期和晚期样品。对于图17j，通过将每个平均抗体值除以总抗体应答的总和来计算百分比，并且使用卡方检验在“观察到的”(小儿)相对于“预期的”(成人)分布之间进行比较。
对于图19c和补充图16，拟合线性混合效果模型以解释纵向样品数据集的相关应答。Log10 LIPS用于分析(作为因变量)以减少极值/非正态性的影响。
伦理声明
COVID-19患者研究由各个医院的伦理审查委员会，即九龙西联网(KW/EX-20-039(144-27))，九龙中联网/九龙东联网(KC/KE-20-0154/ER2)和HKU/HA港岛西联网(UW 20-273，UW 20-169)、联合中国香港中文大学—新界东联网临床研究伦理委员会(CREC2020.229)批准。所有患者均提供了知情同意书。来自用作对照的献血者的血浆采集获得了中国香港大学伦理审查委员会和港岛西联网的批准(UW16-254)。
结果
SARS-CoV-2病毒于2019年12月出现，由于缺乏预先存在的免疫力，导致了大流行病。COVID-19疾病谱的范围从无症状到致死性感染。现在明显的是，免疫应答在致病性和结果COVID-19中起主要作用1。儿童在临床上受SARS-CoV-2的影响最小，并且在成人中观察到的发病率和死亡率随年龄逐渐升高，尽管据报告呼吸道中的病毒载量在所有年龄的儿童和成人之间是相当的2。在感染SARS-CoV-2后出现在儿童中的多***炎性综合征(MIS-C)对于通常观察到的较温和的临床疾病是罕见的例外(0.002％的病例)3。与疾病严重程度相关的症状，如发热、咳嗽、肺炎和C-反应蛋白升高在儿童中不常见4。大多数儿童无症状，只有少数儿童发展出轻度症状(最常见的是发热、咳嗽、咽炎、胃肠道症状和嗅觉丧失)4，造成难以鉴定小儿病例和接触追踪。这些观察结果与其他呼吸道病毒感染(呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒)相反，在其他呼吸道病毒感染中，儿童与成人相比更常见地和更严重地受到影响5。最近，Tosif等人进行的一项小型家庭病例研究表明，儿童可以以针对SARS-CoV-2的可检测抗体进行免疫应答，而无先前的可检测的病毒载量，因此避免了有症状的SARS-CoV-2感染的发展6。在儿童和成人中观察到的SARS-CoV-2感染后的临床差异可以通过几种免疫因子(在其它临床或生理因素中)来解释，如在儿童中伴随可能更新进的暴露的对普通感冒冠状病毒(CCC)预先存在的和交叉反应的免疫力7，免疫衰老和炎症状态8，先天免疫应答，自身抗体的存在9，和作为用于其它感染的活减毒疫苗的脱靶效应的结果的“训练的免疫力”5,10。
尽管越来越多的SARS-CoV-2血清学测试目前在世界范围内使用并且是SARS-CoV-2感染率数据的基础，但是没有关于在RT-PCR证实SARS-CoV-2感染的儿童中的血清学应答的信息。大流行病学研究报告，儿童仅占所有SARS-CoV-2病例的1-2％11,12，但这可能是低估的，因为在儿童中有对SARS-CoV-2的抗体应答的发展的差异和诸如学校关闭等大流行病应对措施。血清学对于确定群体的感染发病率和评估对未来疫苗的应答以控制全球大流行病是至关重要的。大多数可用的血清学测试依赖于中和抗体或依赖于靶向病毒的刺突蛋白(S)或核衣壳蛋白(N)蛋白的抗体的检测13。我们以前已经证明了针对病毒非结构蛋白，即ORF3b和ORF8的抗体可用于准确诊断SARS-CoV-2感染14。尽管在小型病例研究中，儿童的细胞免疫概况似乎与成人相当6，但在小儿病例中没有关于体液抗体状况(antibodylandscape)和动力学的报告。缺乏关于在成人或儿童中对病毒辅助蛋白，例如ORF3b、ORF6和ORF7a的SARS-CoV-2抗体应答的信息，据报告所述病毒辅助蛋白，例如ORF3b、ORF6和ORF7a是可能在免疫逃避中起作用的有效干扰素拮抗剂15-17。精细调节和平衡的抗体应答可影响COVID-19结果，对非结构蛋白的抗体应答的状况的广度和强度可显示病毒复制的程度并因此显示免疫控制。
在本研究中，使用经SARS-CoV-2RT-PCR证实感染的儿童和成人来通过LIPS研究针对一组全面的14种不同结构和辅助蛋白的抗体状况。我们在中国香港测试了122名感染的儿童和36名感染的成人的群体，包括58名具有纵向样品的患者(2-4个时间点，感染后0-206天范围)，以确定抗体应答的寿命。此外，由于中国香港的加强的接触追踪和病例发现措施，已经鉴定了具有用RT-PCR证实的感染的无症状病例，并且也绘制了它们的抗体应答图谱。这些样品收集于2020年4月至11月之间，主要包括对应于2020年7月至9月时间段的中国香港的第三波感染病例。迄今为止，我们的数据报告了关于COVID-19儿童中抗体应答的状况和动力学的最广泛的数据。
SARS-CoV-2感染的儿童对所有结构蛋白的抗体水平低于成人，除了E。
我们使用无偏的和定量的LIPS平台来测定针对一大组血浆样品中的来自结构性和非结构性SARS-CoV-2蛋白的14种抗原的抗体滴度，所述血浆样品来自一队感染的儿童，与中国香港的成人和对照对比(表6)。
我们的第一个数据集代表混合时间点和症状的COVID-19病例，以确定儿童(平均值±标准差：39±47天，范围：0-206天)，成人(平均值±标准差：54±20天，范围：24-123天)和阴性对照的总体抗体状况。S和N抗体是全世界COVID-19血清学测试中最广泛使用的抗体。因此，我们首先通过在LIPS测定中使用3种不同的S构建体确定针对不同S亚基的抗体的水平：S1含有RBD结构域、S2和S2’裂解亚基(图11)。两种刺突蛋白抗体S1和S2’的水平在儿童中显著低于成人队列(分别为p<0.0001，p＝0.0015且p<0.0001，图11a、c)，而对于S2抗体没有观察到差异(图11b)。此外，相对于阴性对照，小儿COVID-19队列中的N抗体显著升高(2.45e5±2.8e5 LU相比4.15e4±1.5e4 LU(p＝0.0045)，但未达到COVID-19成人队列中观察到的水平，所述COVID-19成人队列中观察到的水平几乎高半个对数(5.45e5±3.0e5 LU成人COVID-19队列，p<0.0001，图11d)。
我们还通过LIPS评估了针对其它结构蛋白基质(M)和包膜蛋白(E)的抗体，所述抗体在血清学中没有被广泛测量。至于S1、S2’和N，我们发现与成人COVID队列相比，COVID-19儿童中的M抗体水平较低(p<0.0001，图11e)，但显著高于对照中所看到的。E抗体遵循相反的趋势，因为与成人COVID-19(p＝0.0006)和阴性对照(p<0.0001)两者相比，它们在小儿COVID-19队列中显著升高(图11f)。
小儿COVID-19群体中辅助抗原靶点的广度增加。
我们接下来研究了针对病毒的非结构蛋白1(NSP1)和所有ORF蛋白的抗体的水平。与我们先前的研究一致14，与阴性对照相比，具有COVID-19的成人显示NSP1、ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8抗体的水平升高(p<0.0001，p<0.0001，p<0.0001，p＝0.05，p＝0.0009，p<0.0001，图12a-c和e-g)。再者，在成人COVID-19群体中没有检测到可检测水平的ORF6和ORF10抗体(分别为p＝0.8691且p＝0.999，图12d和12h)。我们观察到COVID-19儿童队列表现出比成人COVID-19队列显著更低水平的ORF3a、ORF7a、ORF7b抗体(分别为p＝0.0001，p<0.0001且p<0.0001，图12b、e-f)。在小儿COVID-19和成人COVID-19群体中，针对NSP1、ORF3b和ORF8的抗体应答的强度相当，并且与阴性对照相比显著升高(图12c和g)。
然后将来自COVID-19儿童和成人群体的累积SARS-CoV-2抗体应答作为总SARS-CoV-2结构和辅助抗体应答的百分比进行比较。抗-N抗体在两个群体中基本上支配由LIPS测得的SARS-CoV-2体液应答(图12i-j)，这与我们以前在成人群体中的发现一致14。由于抗-N抗体的免疫优势效应，我们还在有或没有N的情况下进行了分析，两者都是高度显著的(p<0.0001图12j)。此外，针对整体SARS-CoV-2抗体应答的单一特异性抗体的累积百分比的表示显示，小儿COVID-19群体中相比成人COVID-19群体中，针对辅助蛋白(NSP1和ORF)的应答的量相对于针对结构蛋白的应答增加(8.81％，相对于针对辅助蛋白的应答的4.36％，p＝0.019，图12j)，尽管在两个群体中总IgG水平没有显著差异。
利用点聚类和主成分分析，解读SARS-CoV-2抗体在儿童和成人中的状况差异。
点的聚类以比单个统计比较更完整的方式描绘每个单一样品，因为它一起考虑三个(或更多个)不同参数的组合以及这些参数的相关关系。为了解读儿童中的SARS-CoV-2抗体状况，我们使用相关的抗体组合以点聚类表示COVID-19小儿样品以及阴性和COVID-19成人群体(图13a-c)。
首先，代表针对S亚基抗原S1、S2’、S2的三种抗体的聚类证实了小儿群体的S抗体谱与阴性对照(图13a)比通过LIPS测得的成人COVID-19应答(图13b)更接近地相当。用N或其它结构蛋白N、M和E，对针对S1、S2’的抗体的进一步聚类分析揭示COVID-19儿童群体看起来是相当异质的(数据未显示)。尽管具有与成人COVID-19和阴性群体两者不同的谱，但不能清楚地区分小儿群体。
然后我们选择辅助蛋白抗体作为组合以研究未充分利用的标志物的相关性。选择ORF3b和ORF8抗体以及N抗体，因为前面两者先前都显示准确地区分COVID-19成人与阴性对照14。点的(N、ORF3b、ORF8)聚类可以准确地实现小儿COVID-19病例与阴性者的阳性区分(图13c)。实际上，在(N，ORF8；x，y)平面中，通过两段直线将阴性群体与成人和小儿阳性群体分开(方程为830*log(N)0.3843*ORF8＝4801和-350*log(N)+1.036*ORF8＝790)，在这些线上方或之上表示所有阳性样品，在这些线上方只有一个阴性样品)。然后，再使用(ORF3b，ORF8；y，z)平面，直线的两段(方程为0.035*ORF3n+0.1334*ORF8＝409.284和0.074*ORF3b+0.0437*ORF8＝221.812)将阴性样品与成人和小儿阳性样品分开。因此，(N，ORF3b，ORF8)聚类揭示小儿COVID群体类似于COVID-19成人群体，并且可以与阴性的大流行前对照区分开。重要的是，这是使我们能进行这种区分的唯一组合，因为其它参数组合(例如(N、S1、S2’)，(N、E、M)数据未显示)和针对辅助蛋白的抗体的组合)也被测试并表示为点聚类，但不区分小儿样品。这些数据聚类分析显示COVID-19儿童群体的抗体状况不同于成人群体。
为了测试针对结构和辅助病毒蛋白的抗体状况驱动小儿群体的独特概况的假设，我们对完整数据集(来自图11和13)进行了14种SARS-CoV-2抗体的主成分分析(PCA)。维度(主成分)1和2分别解释了所有14种抗体类型的总差异的21％和15％(图13d-e)。辅助蛋白ORF3b、NSP1、ORF8、ORF3a、ORF7a、ORF6和ORF10具有高相关值(数据未显示)，反映针对结构蛋白的抗体不单独驱动主要成分1。特别地，ORF3b、NSP1、ORF8、ORF3a的贡献在维度1中最高(Dim1，图13d、e)。此外，PCA显示ORF3b和ORF7a抗体高度促成了两个维度上见到的差异(图13d)，突显了它们在血清学应答中的重要性。
引人注目的是，PCA揭示小儿COVID-19抗体应答也介于COVID-19成人和阴性者之间(图13f)。实际上，3个群体的正常概率表示显示只有18.9％的小儿患者与COVID-19成人的椭圆重叠，只有3.54％与阴性者的椭圆重叠(图13f)。对性别、时间点、症状和中和数据(PRNT90)值的进一步分析报告这些不是区分数据的显著因素(数据未显示)。因此，观察到的SARS-CoV-2抗体应答的差异主要由患者的年龄和类型解释：小儿COVID-19、成人COVID-19或大流行前阴性对照。
有症状和无症状COVID-19之间的抗体应答无差异
为了评估抗体对SARS-CoV-2的结构蛋白和非结构蛋白的潜在作用，我们进一步将数据(来自图11和12)分层为成人和小儿队列两者的有症状的(轻症/重症)和无症状的。
我们发现所有14种抗原的无症状的和轻症COVID-19儿童之间的抗体应答没有差异。在成人中，我们观察到相同的趋势，不包括有症状的患者的ORF3a抗体水平较高(p＝0.0403，图14b)。更重要的是，无症状的儿童相对无症状的成人的N、M、ORF3a和ORF7b抗体水平没有显著差异(分别为p＝0.5673、p＝0.2669、p＝0.9185和p＝0.0859，图14)，而有症状的成人与有症状的儿童相比对这些抗原的抗体应答上调(所有4种抗原的p<0.0001，图14)。
早期感染的抗体状况和长期稳定性
我们先前观察到SARS-CoV-2抗体应答在成人中的强度和特异性在急性期和恢复期至记忆时间点之间变化14。为了研究时间在小儿COVID-19群体中的影响，我们按照早期(<14天)相对晚期(≥14天)时间点(图15)对所有254个样品的小儿应答进行分层(图11和12)。症状发作后第14天，S2、N和ORF7a特异性抗体显著增加。相反，ORF3b和ORF7b抗体在第14天前引发更高的抗体应答(图15b)。最后，在第14天前后，针对结构蛋白S1、S2、M和E以及辅助蛋白NSP1、ORF3a、ORF6和ORF8的应答是相当的(图15a、b)。
为了进一步证实SARS-CoV-2特异性抗体的稳定性，我们使用了经过2、3或4次抽血的58名小儿患者的146个纵向配对样品(图16a)。取样的时间期限范围为症状发作后0至206天，大多数样品为<14天(n＝63)，或长期记忆样品为60天后(n＝58)(图16b)。使用线性混合效应模型，我们确定针对结构蛋白S1、S2、S2’、M和E的抗体应答随时间稳定，而N显著增加(p<0.001)(图16c)。此外，针对非结构蛋白NSP1、ORF3a、ORF3b和ORF7a的抗体也随时间显著增加(分别为p<0.001、p＝0.001、p＝0.027和p＝0.002)，而ORF6、ORF8和ORF10是稳定的(图16c)。只有ORF7b抗体应答以缓慢的速率显著纵向衰减(p<0.001，图16c)。为了确定每种血清学标志物的斜率是否能告知疾病结果，我们比较了无症状的和有症状的患者，但没有发现显著差异(所有患者的p>0.05)(数据未显示)。
不同的抗体状况可能影响IFNα水平
严重的COVID-19疾病与成人中的低IFNα应答有关，其与ORF3b、ORF7a和ORF6的I型IFN下调作用有关15-17。在点聚类(ORF3b、ORF7a、ORF6作为x、y、z)中针对这3种蛋白的抗体显示，儿童具有针对这3种I型IFN下调节物的异源体液分布(图17a)。为了评估IFNα应答，在儿童(n＝48)和成人(n＝18)中对第7天前收集的血浆进行定量ELISA(图17b)。我们观察到与成人样品相比，儿童的急性IFNα水平显著降低(p＝0.0165，图17b)，只有3个小儿样品显示可检测的IFNα水平。为了进一步研究具有IFNα应答的抗体概况，将这3名产生IFNα的儿童的总抗体应答与非应答者儿童(n＝45)进行比较，我们绘制了每组对所有14种抗原的平均抗体应答(小儿IFNα-相对小儿IFNα+，平均值：图17c，个体：数据未显示)。我们发现3名产生IFNα的儿童相对不产生IFNα的儿童的抗体分布的显著差异(IFNα+相对IFNα-，p<0.0001)，IFNα+儿童具有增加的ORF6、ORF7a和ORF3b抗体，以及较低的ORF8和E抗体水平。值得注意的是，ORF6抗体水平在具有低病毒载量的一个IFNα+无症状儿童中特别高(图17d)。
讨论
少年儿童仅占报告和医疗护理的COVID-19感染的一小部分5，这不可能由减少暴露和学校封闭来完全解释。这种差异很可能是由儿童和成人之间宿主反应的差异造成的。我们在本文提供了迄今为止最全面的SARS-CoV-2特异性抗体在儿童中的强度、特异性和持续时间的研究。
尽管对COVID-19免疫的理解正在以快速的步伐增长，但关于小儿群体的信息仍然有限，主要是因为与成人群体相比，他们的无症状和轻度疾病。深化我们对导致这种轻度临床表现的免疫机制的理解可以代表新的替代疗法、预防方法或改进的诊断。我们的工作使得能够对长期反应和无症状感染有独特的血清学理解，因为中国香港的大流行病控制策略对包括无症状和轻度病例在内的所有COVID-19病例进行了深入测试、接触追踪和隔离，并进行了纵向随访。这为我们提供了调查一队有症状的和无症状儿童的机会。我们描述了症状发作后第0天和第206天之间的抗体多样性，并揭示了与成人相比COVID-19儿童的体液免疫应答所靶向的抗原的主要差异，这可能表明病毒蛋白增殖动力学、发病机理和IFN免疫逃避方面的差异。
重要的是，我们报告了靶向辅助蛋白的抗体应答的比例在儿童中相对于成人显著增加。针对N结构蛋白的抗体在儿童和成人两者中都主要支配体液免疫应答，尽管儿童中N-特异性抗体的总强度显著低于成人。在我们的聚类表示中N抗体水平的可视化清楚地显示，只有一半的小儿病例具有与成人相当的这些抗体水平。其他人也报告了儿童中N抗体的强度减弱，并且他们提示这种观察结果可能与儿童中与较低复制相关的N蛋白的较低释放有关18。相反，我们的数据显示，儿童以与成人相似的水平产生针对一些辅助蛋白(即NSP1、ORF3b和ORF8)的抗体，并以比成人更高的比例产生针对结构蛋白E的抗体，后者由于其在病毒繁殖中的关键作用而因高转换而臭名昭著(综述见19)。因此，这些辅助蛋白在儿童中没有较小程度地释放，但在儿童中与成人相比可反映不同的病毒发病机理。已显示病毒载量在儿童和成人中是相当的，这可反映类似水平的病毒复制2。
对于刺突蛋白亚基抗体，(S1，S2’，S2)聚类揭示儿童群体类似于阴性的大流行前群体，而不是COVID-19成人群体。最近的研究描述了小儿群体中较低的抗-S IgG、IgM、IgA，这与我们的发现相关20。关于儿童和成人之间的临床差异的一个解释提出，与SARS-CoV-2交叉反应的针对季节性人冠状病毒(HCoV)的预先存在的免疫力在儿童中更高，因为他们比成人具有更高的季节性HCoV感染率21。暴露于和未暴露于SARS-CoV-2的个体具有针对SARS-CoV-2和季节性HCoV的蛋白的交叉反应性抗体22 , 23。此外，因为循环的HCoV具有与非结构蛋白(如果它们存在的话)24 , 25相比更高的与SARS-CoV-2结构蛋白的同源性，我们将预期基于预先存在的免疫力对结构蛋白更高的交叉反应性。SARS-CoV-2感染后-加强针对保守表位，包括刺突蛋白S2亚基的相对保守的融合肽的抗体22,23。在我们的手中，COVID-19儿童和成人具有相当水平的S2抗体，与S1和S2’相反，这表明对S的更保守结构域如S2的预先存在的HCoV免疫力的可能作用。
我们对COVID-19儿童中较低的核衣壳蛋白和刺突蛋白抗体的观察结果可以表明，当使用基于单独的S和/或N的测定时，SARS-CoV-2的血清学检测的灵敏度可能较低，导致对暴露于SARS-CoV-2的儿童的低估。已报告大多数轻度成人感染中S抗体的强度较低，严重病例中产生的水平较高26，这与我们关于儿童中的低S抗体水平的数据一致，儿童也是无症状的或轻度临床评分。低抗体水平和低亲和力与通过促进宿主细胞对病毒摄取的抗体依赖性增强有关27，然而，还没有提出既不在成人中也不在儿童中SARS-CoV-2的ADE的明确证据28，但是有必要进一步研究。
点聚类(N、ORF3b、ORF8)中的平面(ORF3b/ORF8)揭示儿童样品具有这两种抗体的特异性组合值，这与成人群体一致，并使它们可与阴性者区分开。与NSP1相似，我们报告所有非结构抗体的比例在儿童中比在成人中对SARS-CoV-2应答贡献更大。我们数据集的主要成分分析进一步证实了针对辅助蛋白的抗体在表征小儿样品中的重要性。这些针对辅助蛋白的抗体在病毒感染性中或在疾病的发病中以及在儿童SARS-CoV-2感染的更温和结果中是否起作用对研究提出了另外的问题。
之前已经报道ORF3b、ORF7a和ORF6蛋白在细胞1型IFN下调中起作用15-17。ORF3b、ORF7a和ORF6抗体的聚类表示显示成人和儿童群体之间的不同模式。此外，PCA揭示ORF7a和ORF3b对组分1和2(Dim1和Dim2)贡献很大，其分别占观察到的差异的21％和15％，指向这些抗原的潜在关键作用。在感染的早期时间点(<第7天)测试的所有COVID-19感染的儿童或成人中，大多数没有引发可检测的IFNα应答，与先前的发现一致30，但总体儿童IFNα应答显著低于成人IFNα应答。在儿童中的IFNα应答者和非应答者中，不同的抗体状况表明这些标志物在抵消病毒IFN下调中的可能的功能，其中ORF6抗体应答在IFNα+儿童中加倍。Bastard等人报告了在严重COVID-19患者子集中的抗I型干扰素自身抗体9。此外，最近的研究已经将成人中高水平的自身免疫与COVID-19严重病例联系起来31。由于儿童比成人更不容易进行自身免疫32，这可能有助于他们较温和的临床表现以及在我们研究中观察到的多样化抗体状况。
我们在儿童中报告了早期样品相对于晚期样品中的不同抗体概况，以及在感染后至少6个月维持或增加除ORF7b抗体外的所有针对结构和辅助蛋白的抗体。许多因素在抗体长期持久性中起作用，如抗原释放、抗原呈递、生发中心反应的诱导和记忆B细胞池33。需要对病毒蛋白释放、它们的作用和它们的特异性B细胞进行另外的研究以充分理解儿童的抗体状况。
我们的队列不包括任何儿童多炎症***(MIS-C)病例。尽管一项研究报告在MIS-C和轻度或无症状的儿童之间没有观察到明显的抗体应答18，但它仅测量S和N抗体。因此，研究该群体中的全部抗体谱，特别是靶向辅助蛋白的那些将是有意义的。在我们的手中，有症状的儿童相对于有症状的成人仅在选择的抗体(N、M、ORF3a和ORF7b)的抗体水平上具有显著差异，这表明这些标志物可在感染控制或感染性中起作用。
随着仅亚基刺突蛋白疫苗的推出，针对SARS-CoV-2内部蛋白抗体的兴趣可能会增加，以便实现区分特定群体中的SARS-CoV-2过去的暴露和疫苗接种，并考虑到不同特异性减弱的独特速率，创建估计的暴露日期。某些病毒突变体如ORF8截短34或最近的ORF3b缺失35的出现可改变某些ORF的贡献，它们的抗体应答也可用于对不同病毒株的爆发的流行病学研究。
总之，我们报告了与成人相比COVID-19儿童群体中更多样化抗体状况的描述，其中对病毒的所有辅助蛋白的体液应答增加且持续。该抗体谱的研究提供了对应答广度的重要性以及它在具有不同感染结果的儿童和成人之间如何不同的了解，并且可以为用于小儿群体的改进的SARS-CoV-2诊断提供信息。
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实施例4
在SARS-CoV-2再感染的情况下，ORF8抗原在ELISA中作为重组蛋白被进一步测试，并测试其在感染细胞中的存在。
在LIPS中测试来自初次感染(SARS-CoV-2毒株)和二次感染(ORF864E终止)的再感染患者的血浆的刺突蛋白、核衣壳蛋白、ORF8和ORF3b抗体。患者最初具有次优抗体应答；而针对刺突蛋白和核衣壳蛋白的抗体不会实现准确诊断，而ORF8和ORF8+ORF3b LIPS在第43天是SARS-CoV-2感染的准确标志物。此外，我们的内部ORF8 ELISA巩固了该发现(图23g)，其特异性为98％，灵敏度为71％，相比之下，刺突蛋白(S)的内部ELISA的特异性和灵敏度分别为99％和11％，核衣壳蛋白(N)的内部ELISA的特异性和灵敏度分别为97％和88％(图25)。
在儿童中，S和N抗体的产生是次优的，可以导致该群体中SARS-CoV-2感染率的误诊和不正确的评估。我们对儿童血浆的ORF8ELISA揭示了98.4％的特异性和79％的灵敏度，突显了其对所有年龄和所有时间点的患者的准确诊断(图24a-f)。
由于ORF8抗体的丰度以及刺突蛋白和ORF8抗体滴度的相关性，我们研究了ORF8在VeroE6感染细胞中的表达。免疫荧光染色(IF)显示ORF8在感染细胞中被大量检测到并与膜蛋白和ERGIC-53共定位(图26b和c)。因此，我们的数据支持ORF3b和ORF8在唾液和/或干血液中作为抗原检测用于快速检测的潜力。
方法
患者样品
来自SARS-CoV-2再感染病例(Chan EID ref)的血清在3个时间点在LIPS测定中评估S、N、ORF3b和ORF8抗体应答。
在ELISA测定中评估来自实施例2和3的血浆样品：针对大流行前健康对照评估304名成人COVID-19血浆和243名儿童COVID-19血浆(n＝184)。
酶联免疫吸附测定
参见实施例1，修改是使用来自Masashi Mori的烟草BY-2细胞产生的重组ORF8蛋白(https://doi.org/10.1007/s00299-020-02654-5)，在包被缓冲液中以300ng/mL的包被浓度使用。
使用LIPS测量抗体应答
参见实施例1。
SARS-CoV-2感染细胞中的ORF8检测
简言之，将感染的Vero E6细胞以MOI 2 24p.i用富集的患者血浆的ORF8抗体、SARS-CoV-2刺突蛋白单克隆抗体(Sinobiological)、SARS-CoV-2膜蛋白小鼠单克隆抗体(Thermofisher)、ERGIC-53小鼠单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)按照制造商的说明并进行以下修改进行染色：在所有缓冲液中使用10％ NGS，在每个步骤洗涤3次，每次20mn。然后使用Carl Zeiss LSM 980使载玻片可视化。
结果
在GISAID上可用的超过5000个序列中，在ORF8和ORF3b中仅发现有限的突变(图19)。重要而值得注意的是，新加坡出现的ORF8缺失突变体在消失前仅感染约10人—显示ORF8在病毒体形成中的重要性。ORF8缺失已经不是稳定的谱系(图19)。
普通感冒冠状病毒与S和N具有高度同源性(这可以导致交叉反应性)，而ORF8和ORF3b对SARS-CoV-2有特异性(图20)。
图21：对COVID-19再感染病例的研究，其中第2次感染在ORF8中具有64E终止，和第1次感染，显示当S和N抗体检测未鉴定出初次感染时，ORF3b+ORF8或ORF8可鉴定初次感染。
图22：ORF3b和ORF8抗体应答在成人(第0-100天)和儿童(第0-204天)中随时间稳定，使它们在感染的所有时间点都是良好的血清学标志物。
图23：LIPS和ELISA形式两者都证实通过LIPS的ORF3b+ORF8测试在儿童的SARS-CoV-2感染的诊断中比S和N的作用更好。ORF8ELISA翻译证实了我们最初的LIPS发现。ORF3b蛋白与ELISA测试的组合一旦蛋白是可用的就将进行。
图24：对来自ORF8 ELISA的数据按年龄和感染时间点的进一步分层：在儿童中作用良好，且＞14天。
图25：使用用于比较的SinoBiological蛋白的刺突蛋白和核衣壳蛋白的内部ELISA。
图26：通过ELISA测得ORF8 IgG应答是随时间稳定的。
图27：ORF8具有作为基于感染细胞的病毒定位的抗原测试的潜力，使用富集的患者抗体直接检测ORF8。我们还看到ORF8和刺突蛋白的抗体滴度相关，表明感染细胞的ORF8的表面表达(Hachim和Kavian等人，Nature Immunology,2020)。
实施例1-4的结论：
该血清学测试是基于COVID-19患者中独特抗原ORF8和ORF3b的开创性发现，并能够产生将天然感染与疫苗接种区分的诊断数据，目前基于对刺突蛋白和核衣壳蛋白的Ab应答的血清学测试尚不能够起作用。
在此描述的抗体测试实现：
在早期和晚期时间点的感染的检测。检测ORF8抗体的时间段比S抗体的更长。
这些抗原可用于区分感染和疫苗接种—ORF8是非结构蛋白且仅在感染期间存在，ORF3b是SARS-CoV-2特有的，与其它病毒ORF3的同源性很小。
在儿童中检测感染，对S的抗体应答是次最佳的，因此ORF3b和ORF8可用作对临界病例的进一步确证测试。
开发作为抗原测试以检测感染的潜力。
除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有与所公开的发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文所引用的出版物和它们所引用的材料通过引用具体并入。
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文的发明的具体实施方案的许多等同方案。这样的等同方案旨在被包括在以下权利要求中。
序列表（Sequence Listing）
<110> 港大科桥有限公司
巴斯德研究院
<120> SARS-COV-2病毒蛋白及其用途
<130> FIC22210099P
<150> 63/016898
<151> 2020-04-28
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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tcttttgaac ttctacatgc accagcaact gtttgtggac ctaaaaagtc tactaatttg 1560
gttaaaaaca aatgtgtcaa tttcaacttc aatggtttaa caggcacagg tgttcttact 1620
gagtctaaca aaaagtttct gcctttccaa caatttggca gagacattgc tgacactact 1680
gatgctgtcc gtgatccaca gacacttgag attcttgaca ttacaccatg ttcttttggt 1740
ggtgtcagtg ttataacacc aggaacaaat acttctaacc aggttgctgt tctttatcag 1800
gatgttaact gcacagaagt ccctgttgct attcatgcag atcaacttac tcctacttgg 1860
cgtgtttatt ctacaggttc taatgttttt caaacacgtg caggctgttt aataggggct 1920
gaacatgtca acaactcata tgagtgtgac atacccattg gtgcaggtat atgcgctagt 1980
tatcagactc agactaattc tcctcggcgg gcaatgtttg tttttcttgt tttattgcca 2040
ctagtctcta gtcagtgtgt taatcttaca accagaactc aattaccccc tgcatacact 2100
aattctttca cacgtggtgt ttattaccct gacaaagttt tcagatcctc agttttacat 2160
tcaactcagg acttgttctt acctttcttt tccaatgtta cttggttcca tgctatacat 2220
gtctctggga ccaatggtac taagaggttt gataaccctg tcctaccatt taatgatggt 2280
gtttattttg cttccactga gaagtctaac ataataagag gctggatttt tggtactact 2340
ttagattcga agacccagtc cctacttatt gttaataacg ctactaatgt tgttattaaa 2400
gtctgtgaat ttcaattttg taatgatcca tttttgggtg tttattacca caaaaacaac 2460
aaaagttgga tggaaagtga gttcagagtt tattctagtg cgaataattg cacttttgaa 2520
tatgtctctc agccttttct tatggacctt gaaggaaaac agggtaattt caaaaatctt 2580
agggaatttg tgtttaagaa tattgatggt tattttaaaa tatattctaa gcacacgcct 2640
attaatttag tgcgtgatct ccctcagggt ttttcggctt tagaaccatt ggtagatttg 2700
ccaataggta ttaacatcac taggtttcaa actttacttg ctttacatag aagttatttg 2760
actcctggtg attcttcttc aggttggaca gctggtgctg cagcttatta tgtgggttat 2820
cttcaaccta ggacttttct attaaaatat aatgaaaatg gaaccattac agatgctgta 2880
gactgtgcac ttgaccctct ctcagaaaca aagtgtacgt tgaaatcctt cactgtagaa 2940
aaaggaatct atcaaacttc taactttaga gtccaaccaa cagaatctat tgttagattt 3000
cctaatatta caaacttgtg cccttttggt gaagttttta acgccaccag atttgcatct 3060
gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc tgtcctatat 3120
aattccgcat cattttccac ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa attaaatgat 3180
ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga agtcagacaa 3240
atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct gattataatt ataaattacc agatgatttt 3300
acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg tggtaattat 3360
aattacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag agatatttca 3420
actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt taattgttac 3480
tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc actaatggtg ttggttacca accatacaga 3540
gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa ctgtttgtgg acctaaaaag 3600
tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc aatttcaact tcaatggttt aacaggcaca 3660
ggtgttctta ctgagtctaa caaaaagttt ctgcctttcc aacaatttgg cagagacatt 3720
gctgacacta ctgatgctgt ccgtgatcca cagacacttg agattcttga cattacacca 3780
tgttcttttg gtggtgtcag tgttataaca ccaggaacaa atacttctaa ccaggttgct 3840
gttctttatc aggatgttaa ctgcacagaa gtccctgttg ctattcatgc agatcaactt 3900
actcctactt ggcgtgttta ttctacaggt tctaatgttt ttcaaacacg tgcaggctgt 3960
ttaatagggg ctgaacatgt caacaactca tatgagtgtg acatacccat tggtgcaggt 4020
atatgcgcta gttatcagac tcagactaat tctcctcggc gggcacgtag tgtagctagt 4080
caatccatca ttgcctacac tatgtcactt ggtgcagaaa attcagttgc ttactctaat 4140
aactctattg ccatacccac aaattttact attagtgtta ccacagaaat tctaccagtg 4200
tctatgacca agacatcagt agattgtaca atgtacattt gtggtgattc aactgaatgc 4260
agcaatcttt tgttgcaata tggcagtttt tgtacacaat taaaccgtgc tttaactgga 4320
atagctgttg aacaagacaa aaacacccaa gaagtttttg cacaagtcaa acaaatttac 4380
aaaacaccac caattaaaga ttttggtggt tttaattttt cacaaatatt accagatcca 4440
tcaaaaccaa gcaagaggtc atttattgaa gatctacttt tcaacaaagt gacacttgca 4500
gatgctggct tcatcaaaca atatggtgat tgccttggtg atattgctgc tagagacctc 4560
atttgtgcac aaaagtttaa cggccttact gttttgccac ctttgctcac agatgaaatg 4620
attgctcaat acacttctgc actgttagcg ggtacaatca cttctggttg gacctttggt 4680
gcaggtgctg cattacaaat accatttgct atgcaaatgg cttataggtt taatggtatt 4740
ggagttacac agaatgttct ctatgagaac caaaaattga ttgccaacca atttaatagt 4800
gctattggca aaattcaaga ctcactttct tccacagcaa gtgcacttgg aaaacttcaa 4860
gatgtggtca accaaaatgc acaagcttta aacacgcttg ttaaacaact tagctccaat 4920
tttggtgcaa tttcaagtgt tttaaatgat atcctttcac gtcttgacaa agttgaggct 4980
gaagtgcaaa ttgataggtt gatcacaggc agacttcaaa gtttgcagac atatgtgact 5040
caacaattaa ttagagctgc agaaatcaga gcttctgcta atcttgctgc tactaaaatg 5100
tcagagtgtg tacttggaca atcaaaaaga gttgattttt gtggaaaggg ctatcatctt 5160
atgtccttcc ctcagtcagc acctcatggt gtagtcttct tgcatgtgac ttatgtccct 5220
gcacaagaaa agaacttcac aactgctcct gccatttgtc atgatggaaa agcacacttt 5280
cctcgtgaag gtgtctttgt ttcaaatggc acacactggt ttgtaacaca aaggaatttt 5340
tatgaaccac aaatcattac tacagacaac acatttgtgt ctggtaactg tgatgttgta 5400
ataggaattg tcaacaacac agtttatgat cctttgcaac ctgaattaga ctcattcaag 5460
gaggagttag ataaatattt taagaatcat acatcaccag atgttgattt aggtgacatc 5520
tctggcatta atgcttcagt tgtaaacatt caaaaagaaa ttgaccgcct caatgaggtt 5580
gccaagaatt taaatgaatc tctcatcgat ctccaagaac ttggaaagta tgagcagtat 5640
ataaaatggc catggtacat ttggctaggt tttatagctg gcttgattgc catagtaatg 5700
gtgacaatta tgctttgctg tatgaccagt tgctgtagtt gtctcaaggg ctgttgttct 5760
tgtggatcct gctgcaaatt tgatgaagac gactctgagc cagtgctcaa aggagtcaaa 5820
ttacattaca cataa 5835
<210> 9
<211> 2013
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 9
atgtgtgtta atcttacaac cagaactcaa ttaccccctg catacactaa ttctttcaca 60
cgtggtgttt attaccctga caaagttttc agatcctcag ttttacattc aactcaggac 120
ttgttcttac ctttcttttc caatgttact tggttccatg ctatacatgt ctctgggacc 180
aatggtacta agaggtttga taaccctgtc ctaccattta atgatggtgt ttattttgct 240
tccactgaga agtctaacat aataagaggc tggatttttg gtactacttt agattcgaag 300
acccagtccc tacttattgt taataacgct actaatgttg ttattaaagt ctgtgaattt 360
caattttgta atgatccatt tttgggtgtt tattaccaca aaaacaacaa aagttggatg 420
gaaagtgagt tcagagttta ttctagtgcg aataattgca cttttgaata tgtctctcag 480
ccttttctta tggaccttga aggaaaacag ggtaatttca aaaatcttag ggaatttgtg 540
tttaagaata ttgatggtta ttttaaaata tattctaagc acacgcctat taatttagtg 600
cgtgatctcc ctcagggttt ttcggcttta gaaccattgg tagatttgcc aataggtatt 660
aacatcacta ggtttcaaac tttacttgct ttacatagaa gttatttgac tcctggtgat 720
tcttcttcag gttggacagc tggtgctgca gcttattatg tgggttatct tcaacctagg 780
acttttctat taaaatataa tgaaaatgga accattacag atgctgtaga ctgtgcactt 840
gaccctctct cagaaacaaa gtgtacgttg aaatccttca ctgtagaaaa aggaatctat 900
caaacttcta actttagagt ccaaccaaca gaatctattg ttagatttcc taatattaca 960
aacttgtgcc cttttggtga agtttttaac gccaccagat ttgcatctgt ttatgcttgg 1020
aacaggaaga gaatcagcaa ctgtgttgct gattattctg tcctatataa ttccgcatca 1080
ttttccactt ttaagtgtta tggagtgtct cctactaaat taaatgatct ctgctttact 1140
aatgtctatg cagattcatt tgtaattaga ggtgatgaag tcagacaaat cgctccaggg 1200
caaactggaa agattgctga ttataattat aaattaccag atgattttac aggctgcgtt 1260
atagcttgga attctaacaa tcttgattct aaggttggtg gtaattataa ttacctgtat 1320
agattgttta ggaagtctaa tctcaaacct tttgagagag atatttcaac tgaaatctat 1380
caggccggta gcacaccttg taatggtgtt gaaggtttta attgttactt tcctttacaa 1440
tcatatggtt tccaacccac taatggtgtt ggttaccaac catacagagt agtagtactt 1500
tcttttgaac ttctacatgc accagcaact gtttgtggac ctaaaaagtc tactaatttg 1560
gttaaaaaca aatgtgtcaa tttcaacttc aatggtttaa caggcacagg tgttcttact 1620
gagtctaaca aaaagtttct gcctttccaa caatttggca gagacattgc tgacactact 1680
gatgctgtcc gtgatccaca gacacttgag attcttgaca ttacaccatg ttcttttggt 1740
ggtgtcagtg ttataacacc aggaacaaat acttctaacc aggttgctgt tctttatcag 1800
gatgttaact gcacagaagt ccctgttgct attcatgcag atcaacttac tcctacttgg 1860
cgtgtttatt ctacaggttc taatgttttt caaacacgtg caggctgttt aataggggct 1920
gaacatgtca acaactcata tgagtgtgac atacccattg gtgcaggtat atgcgctagt 1980
tatcagactc agactaattc tcctcggcgg gca 2013
<210> 10
<211> 1770
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 10
atgcgtagtg tagctagtca atccatcatt gcctacacta tgtcacttgg tgcagaaaat 60
tcagttgctt actctaataa ctctattgcc atacccacaa attttactat tagtgttacc 120
acagaaattc taccagtgtc tatgaccaag acatcagtag attgtacaat gtacatttgt 180
ggtgattcaa ctgaatgcag caatcttttg ttgcaatatg gcagtttttg tacacaatta 240
aaccgtgctt taactggaat agctgttgaa caagacaaaa acacccaaga agtttttgca 300
caagtcaaac aaatttacaa aacaccacca attaaagatt ttggtggttt taatttttca 360
caaatattac cagatccatc aaaaccaagc aagaggtcat ttattgaaga tctacttttc 420
aacaaagtga cacttgcaga tgctggcttc atcaaacaat atggtgattg ccttggtgat 480
attgctgcta gagacctcat ttgtgcacaa aagtttaacg gccttactgt tttgccacct 540
ttgctcacag atgaaatgat tgctcaatac acttctgcac tgttagcggg tacaatcact 600
tctggttgga cctttggtgc aggtgctgca ttacaaatac catttgctat gcaaatggct 660
tataggttta atggtattgg agttacacag aatgttctct atgagaacca aaaattgatt 720
gccaaccaat ttaatagtgc tattggcaaa attcaagact cactttcttc cacagcaagt 780
gcacttggaa aacttcaaga tgtggtcaac caaaatgcac aagctttaaa cacgcttgtt 840
aaacaactta gctccaattt tggtgcaatt tcaagtgttt taaatgatat cctttcacgt 900
cttgacaaag ttgaggctga agtgcaaatt gataggttga tcacaggcag acttcaaagt 960
ttgcagacat atgtgactca acaattaatt agagctgcag aaatcagagc ttctgctaat 1020
cttgctgcta ctaaaatgtc agagtgtgta cttggacaat caaaaagagt tgatttttgt 1080
ggaaagggct atcatcttat gtccttccct cagtcagcac ctcatggtgt agtcttcttg 1140
catgtgactt atgtccctgc acaagaaaag aacttcacaa ctgctcctgc catttgtcat 1200
gatggaaaag cacactttcc tcgtgaaggt gtctttgttt caaatggcac acactggttt 1260
gtaacacaaa ggaattttta tgaaccacaa atcattacta cagacaacac atttgtgtct 1320
ggtaactgtg atgttgtaat aggaattgtc aacaacacag tttatgatcc tttgcaacct 1380
gaattagact cattcaagga ggagttagat aaatatttta agaatcatac atcaccagat 1440
gttgatttag gtgacatctc tggcattaat gcttcagttg taaacattca aaaagaaatt 1500
gaccgcctca atgaggttgc caagaattta aatgaatctc tcatcgatct ccaagaactt 1560
ggaaagtatg agcagtatat aaaatggcca tggtacattt ggctaggttt tatagctggc 1620
ttgattgcca tagtaatggt gacaattatg ctttgctgta tgaccagttg ctgtagttgt 1680
ctcaagggct gttgttcttg tggatcctgc tgcaaatttg atgaagacga ctctgagcca 1740
gtgctcaaag gagtcaaatt acattacaca 1770
<210> 11
<211> 1380
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 11
atgaggtcat ttattgaaga tctacttttc aacaaagtga cacttgcaga tgctggcttc 60
atcaaacaat atggtgattg ccttggtgat attgctgcta gagacctcat ttgtgcacaa 120
aagtttaacg gccttactgt tttgccacct ttgctcacag atgaaatgat tgctcaatac 180
acttctgcac tgttagcggg tacaatcact tctggttgga cctttggtgc aggtgctgca 240
ttacaaatac catttgctat gcaaatggct tataggttta atggtattgg agttacacag 300
aatgttctct atgagaacca aaaattgatt gccaaccaat ttaatagtgc tattggcaaa 360
attcaagact cactttcttc cacagcaagt gcacttggaa aacttcaaga tgtggtcaac 420
caaaatgcac aagctttaaa cacgcttgtt aaacaactta gctccaattt tggtgcaatt 480
tcaagtgttt taaatgatat cctttcacgt cttgacaaag ttgaggctga agtgcaaatt 540
gataggttga tcacaggcag acttcaaagt ttgcagacat atgtgactca acaattaatt 600
agagctgcag aaatcagagc ttctgctaat cttgctgcta ctaaaatgtc agagtgtgta 660
cttggacaat caaaaagagt tgatttttgt ggaaagggct atcatcttat gtccttccct 720
cagtcagcac ctcatggtgt agtcttcttg catgtgactt atgtccctgc acaagaaaag 780
aacttcacaa ctgctcctgc catttgtcat gatggaaaag cacactttcc tcgtgaaggt 840
gtctttgttt caaatggcac acactggttt gtaacacaaa ggaattttta tgaaccacaa 900
atcattacta cagacaacac atttgtgtct ggtaactgtg atgttgtaat aggaattgtc 960
aacaacacag tttatgatcc tttgcaacct gaattagact cattcaagga ggagttagat 1020
aaatatttta agaatcatac atcaccagat gttgatttag gtgacatctc tggcattaat 1080
gcttcagttg taaacattca aaaagaaatt gaccgcctca atgaggttgc caagaattta 1140
aatgaatctc tcatcgatct ccaagaactt ggaaagtatg agcagtatat aaaatggcca 1200
tggtacattt ggctaggttt tatagctggc ttgattgcca tagtaatggt gacaattatg 1260
ctttgctgta tgaccagttg ctgtagttgt ctcaagggct gttgttcttg tggatcctgc 1320
tgcaaatttg atgaagacga ctctgagcca gtgctcaaag gagtcaaatt acattacaca 1380
<210> 12
<211> 540
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 12
atggagagcc ttgtccctgg tttcaacgag aaaacacacg tccaactcag tttgcctgtt 60
ttacaggttc gcgacgtgct cgtacgtggc tttggagact ccgtggagga ggtcttatca 120
gaggcacgtc aacatcttaa agatggcact tgtggcttag tagaagttga aaaaggcgtt 180
ttgcctcaac ttgaacagcc ctatgtgttc atcaaacgtt cggatgctcg aactgcacct 240
catggtcatg ttatggttga gctggtagca gaactcgaag gcattcagta cggtcgtagt 300
ggtgagacac ttggtgtcct tgtccctcat gtgggcgaaa taccagtggc ttaccgcaag 360
gttcttcttc gtaagaacgg taataaagga gctggtggcc atagttacgg cgccgatcta 420
aagtcatttg acttaggcga cgagcttggc actgatcctt atgaagattt tcaagaaaac 480
tggaacacta aacatagcag tggtgttacc cgtgaactca tgcgtgagct taacggaggg 540
<210> 13
<211> 186
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 13
atgtttcatc tcgttgactt tcaggttact atagcagaga tattactaat tattatgagg 60
acttttaaag tttccatttg gaatcttgat tacatcataa acctcataat taaaaattta 120
tctaagtcac taactgagaa taaatattct caattagatg aagagcaacc aatggagatt 180
gattaa 186
<210> 14
<211> 366
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 14
atgaaaatta ttcttttctt ggcactgata acactcgcta cttgtgagct ttatcactac 60
caagagtgtg ttagaggtac aacagtactt ttaaaagaac cttgctcttc tggaacatac 120
gagggcaatt caccatttca tcctctagct gataacaaat ttgcactgac ttgctttagc 180
actcaatttg cttttgcttg tcctgacggc gtaaaacacg tctatcagtt acgtgccaga 240
tcagtttcac ctaaactgtt catcagacaa gaggaagttc aagaacttta ctctccaatt 300
tttcttattg ttgcggcaat agtgtttata acactttgct tcacactcaa aagaaagaca 360
gaatga 366
<210> 15
<211> 132
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 15
atgattgaac tttcattaat tgacttctat ttgtgctttt tagcctttct gctattcctt 60
gttttaatta tgcttattat cttttggttc tcacttgaac tgcaagatca taatgaaact 120
tgtcacgcct aa 132
<210> 16
<211> 117
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 16
atgggctata taaacgtttt cgcttttccg tttacgatat atagtctact cttgtgcaga 60
atgaattctc gtaactacat agcacaagta gatgtagtta actttaatct cacatag 117
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 17
ctgagcggat ccatggagag ccttgtccct g 31
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 18
ctgagcggcc gcccctccgt taagctcacg 30
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 19
ctgactcgag atgtttgttt ttcttgtttt attgc 35
<210> 20
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 20
ctgaggtacc ttatgtgtaa tgtaatttga ctcc 34
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 21
ctgactcgag atgtgtgtta atctt 25
<210> 22
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 22
ctgaggtacc tgcccgccga ggagaatta 29
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 23
ctgactcgag atgcgtagtg tagctagtca at 32
<210> 24
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 24
ctgaggtacc tgtgtaatgt aatttgactc 30
<210> 25
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 25
ctgactcgag atgaggtcat ttattgaaga 30
<210> 26
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 26
ctgaggtacc tgtgtaatgt aatttgactc 30
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 27
ctgagcggat ccatgtctga taatggacc 29
<210> 28
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 28
ctgagcggcc gcttaggcct gagttgagtc ag 32
<210> 29
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 29
ctgagcggat cctgtactca ttcgtttcgg aaga 34
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 30
ctgagcggcc gcgaccagaa gatcaggaac tc 32
<210> 31
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 31
ctgagcggat ccatggcaga ttccaacggt act 33
<210> 32
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 32
ctgagcggcc gcgcaaagca atattgtcac tgctac 36
<210> 33
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 33
ctgagcggat ccatggattt gtttatgag 29
<210> 34
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 34
ctgagcggcc gcttacaaag gcacgctagt agtc 34
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 35
ctgagcggat ccatggctta ttgttggcg 29
<210> 36
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 36
ctgagcggcc gcaggccagc agcaacgag 29
<210> 37
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 37
ctgagcggat ccatgtttca tctcgttg 28
<210> 38
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 38
ctgagcggcc gcttaatcaa tctccattg 29
<210> 39
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 39
ctgagcggat ccatgaaaat tattctt 27
<210> 40
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 40
ctgagcggcc gctcattctg tctttcttt 29
<210> 41
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 41
ctgagcggat ccatgattga actttcatt 29
<210> 42
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 42
ctgagcggcc gcttaggcgt gacaagtttc 30
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 43
ctgagcggat ccatgaaatt tcttgttttc 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 44
ctgagcggcc gcttagatga aatctaaaac 30
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 45
ctgagcggat ccatgggcta tataaacgt 29

Claims (30)

1.一种免疫原性组合物，其包含一种或多种SARS-CoV-2抗原，所述SARS-CoV-2抗原选自SARS-CoV-2蛋白或其活性片段，其任选地与发光蛋白融合。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述SARS-CoV-2抗原与发光蛋白融合。
3.权利要求1或2所述的组合物，其中所述发光蛋白是荧光蛋白或荧光素酶。
4.权利要求3所述的组合物，其中所述荧光素酶选自海肾荧光素酶、Gaussia荧光素酶、修饰的(优化的)Oplophorus gracilirostris荧光素酶、萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶。
5.权利要求3所述的组合物，其中所述荧光素酶是海肾荧光素酶。
6.权利要求1-5中任一项所述的组合物，其中所述SARS-CoV-2蛋白选自结构蛋白N、M、S、S1、S2’和NSP1；以及非结构蛋白ORF3a、ORF3b、ORF7a、ORF7b和ORF8。
7.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述SARS-CoV-2蛋白是非结构蛋白ORF8、ORF3b和/或结构蛋白N。
8.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述SARS-CoV-2蛋白是非结构蛋白ORF8和/或ORF3b。
9.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述SARS-CoV-2蛋白是非结构蛋白ORF8和ORF3b，以及结构蛋白N。
10.权利要求1-6中任一项所述的组合物，其中所述SARS-CoV-2蛋白是非结构蛋白ORF8、ORF3b、NSP1和ORF7a。
11.一种表达权利要求1-10中任一项所述的SARS-CoV-2抗原的表达载体。
12.权利要求11所述的载体，其中所述载体包含至少一条SEQ ID No：2、3、5-9、11-12、14和15的核酸序列。
13.权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID No：3和/或SEQ ID NO：6的核酸序列。
14.权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID No：3、6和/或7的核酸序列。
15.权利要求11所述的载体，其中所述载体包含SEQ ID No：3、6、9和/或14的核酸序列。
16.一种检测生物流体样品中SARS-CoV-2抗原特异性抗体的方法，其包括：
(i)提供包含与发光蛋白融合的SARS-CoV-2抗原的融合蛋白；其中所述SARS-CoV-2抗原选自SARS-CoV-2蛋白或其活性片段；
(ii)使所述生物流体样品与所述融合蛋白接触，从而如果所述抗原特异性抗体存在于所述生物流体样品中，则形成免疫复合物；
(iii)使所述免疫复合物与包被有免疫球蛋白结合蛋白的珠接触以形成珠结合的免疫复合物；以及
(iv)检测来自分离的珠结合的免疫复合物的光的发射，从而检测所述生物流体样品中所述抗原特异性抗体的存在。
17.权利要求16所述的方法，其中所述生物流体样品选自血清、血浆、血液、尿液、唾液和支气管肺泡灌洗液。
18.权利要求16-17中任一项所述的方法，其中所述发光蛋白是荧光素酶或荧光蛋白。
19.权利要求18所述的方法，其中所述荧光素酶选自海肾荧光素酶、Gaussia荧光素酶、修饰的Oplophorus gracilirostris荧光素酶、萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶。
20.权利要求19所述的方法，其中所述荧光素酶是海肾荧光素酶。
21.权利要求16-20中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白结合蛋白选自蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L和第二免疫球蛋白分子。
22.权利要求16-21中任一项所述的方法，其中所述免疫球蛋白结合蛋白包含第二抗体。
23.权利要求16-22中任一项所述的方法，其中使用光度计检测所述光的发射。
24.权利要求16-23中任一项所述的方法，其中对所述生物样品中针对ORF8和ORF3b的SARS-CoV-2抗原的抗体的检测指示COVID 19感染，并产生区分天然感染与疫苗接种的诊断数据。
25.权利要求16-24中任一项所述的方法，其中检测SARS-CoV-2抗原特异性抗体在自暴露/感染起第7天至第14天之前的早期时间点进行。
26.权利要求16-25中任一项所述的方法，其中所述生物流体样品来自儿童。
27.一种用于检测和/或诊断和/或治疗当前暴露于SARS-CoV-2或被SARS-CoV-2感染的受试对象的方法，其包括将所述受试对象的生物流体样品与权利要求1-10中任一项所述的组合物接触的步骤。
28.权利要求27所述的方法，其中所述方法选自荧光素酶免疫沉淀***测定、放射免疫测定、ELISA、免疫沉淀测定、Western blot和荧光免疫测定。
29.一种用于检测和/或定性或定量测量受试对象中SARS-CoV-2抗体的试剂盒，其包含权利要求1-10中任一项所述的组合物。
30.权利要求1-10中任一项所述的组合物在制备用于所述检测和/或定性或定量测量受试对象中SARS-CoV-2抗体的试剂盒中的用途。
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