CN115060819A - 基于hplc-ms/ms单峰法同时测定人血浆中sun及su12662的方法 - Google Patents

基于hplc-ms/ms单峰法同时测定人血浆中sun及su12662的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于HPLC‑MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，该方法基于HPLC‑MS/MS技术，以SUN‑D10为同位素内标，采用同位素内标法进行人血浆中SUN和SU12662的定量测定，其中，SUN的Z异构体和E异构体在色谱柱上的保留时间一致，同时通过离子通道，经质谱检测只以单峰形式出现，通过对单峰面积进行积分计算即可准确得到Z、E异构体总的浓度，具有快速、灵敏、重现性好、操作简单、准确度高等优点。

Description

基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的 方法
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，特别涉及一种基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法。
背景技术
舒尼替尼(Sunitinib,SUN)作为一种作用于血管内皮生长因子受体和血小板衍生生长因子受体的口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，是转移性肾细胞癌的一线治疗药物。有研究表明SUN在人体内的暴露量与其疗效成正相关，但是随着暴露量的升高，其不良反应的发生率也会增加。目前，SUN在临床上有三种不同的给药方案，医师可以根据患者的耐受情况选择不同的给药方案，以减轻患者严重不良反应的发生；但由于SUN在个体间及个体内的药代动力学暴露量差异性分别高达31-38％，29-38％，以至于仍有部分患者会出现疗效不佳或严重的不良反应。有研究表明，采用治疗药物监测(Therapeutic drug monitoring,TDM)指导个体化给药可以显著提高患者的无进展生存期及总体生存期，并且大大地降低不良反应的发生率。因此，对服用SUN的患者进行TDM指导个体化用药是十分有必要的。
目前，对SUN进行血浆药物浓度监测大多采用的是高效液相色谱质谱联用技术(High performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,HPLC-MS/MS)。但在临床中，SUN检测存在的最大挑战便是部分Z-异构体在光照条件下会转化为E-异构体。同分异构体的分子量一样，但其化学结构不一致，以至于两者经色谱分离后，进入同一离子通道检测，会呈现两个完全分离的峰。计算SUN的浓度需要对Z-和E-异构体的峰面积分别进行积分，然后使用两个峰面积的总和计算浓度。然而，具备医疗器械注册证的AB SCIEXTriple QuadTM 4500MD液相色谱串联质谱检测***的数据分析软件Analyst无法满足这一要求。因此，必须配备其他的定量软件进行分析，这将大大复杂化计算过程，且增加计算误差，使检测结果不稳定。为了解决这一问题，有的学者采用严格避光的方法来避免E-异构体的形成，但完全避光在临床上是很难实现的。另外也有研究提出进样前通过70℃水浴5min，使E-异构体全部转化为Z-异构体，然后对Z-异构体进行检测，但该方法增加了前处理步骤，并延长了检测时间，使检测复杂化，并不利于临床应用。
发明内容
针对上述问题，本发明提供了一种基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，该方法具有快速、灵敏、重现性好、操作简单、准确度高等优点。
本发明的技术方案如下：
一种基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，该方法基于HPLC-MS/MS技术，以SUN-D10为同位素内标，采用同位素内标法进行人血浆中SUN和SU12662的定量测定，其中，SUN的Z异构体和E异构体在色谱柱上的保留时间一致，同时通过离子通道，经质谱检测只以单峰形式出现，通过对单峰面积进行积分计算即可准确得到Z、E异构体总的浓度。
优选的，上述基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，包括如下步骤：
S1：血浆样本前处理：以甲醇为溶剂配制浓度为10ng/mL的SUN-D10甲醇溶液即为内标溶液，以含内标的甲醇溶液为沉淀剂，采用蛋白沉淀法进行血浆样本前处理；
S2：标准曲线样本配制：分别称取SUN、SU12662以甲醇溶解并定容，分别配置成浓度为0.5mg/mL的储备液；使用体积比为1：1的甲醇-水作为稀释液，将SUN、SU12662储备液稀释至10μg/mL；分别取浓度为10μg/mL的SUN、SU12662储备液各500μL配制成1mL的混合储备液，以体积比为1：1的甲醇-水稀释液逐级稀释混合储备液得到标准系列工作溶液，以按S1处理方法处理后的人空白血浆稀释该工作溶液，制成标准曲线样品；
S3：质控样本配制：按照S2标准曲线样本配制方法，配制低、中、高浓度质控样本；
S4：测试样本配制：将待测血浆按S1处理方法进行处理，制成测试样本；
S5：采用HPLC-MS/MS法测定SUN和SU12662的浓度，其中色谱条件和质谱条件分别如下：
色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，2.1×50mm；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B:0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为：0-0.5min，10％B；0.5-0.6min，10→100％B；0.6-2.5min，100％B；2.5-3.7min，100→10％B；流速为0.4mL/min；总时长4min；进样盘温度15℃；柱温箱温度40℃；进样量为2μL；
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子多反应监测模式；质谱条件的固定参数：Curtain Gas为40psi，Collision Gas为8psi，IonSparay Voltage为5500V，Temperature为550℃，Ion source Gas1为55psi，Ion source Gas2为55psi；SUN、SU12662、SUN-D10的离子反应分别为m/z 399.3→283.0、m/z 371.2→283.1、m/z 409.2→325.9，DP电压分别为85V、100V、114V，CE能量分别为40V、29V、35V。
优选的，S1中血浆样本前处理步骤为：精密移取100μL血浆于1.5mL离心管中，加入300μL内标溶液，涡旋5min，将1.5mL离心管于4℃，14000rpm条件下离心10min，取上清液即为处理后的血浆样本。
优选的，S2中标准曲线样本的浓度分别为1、5、25、50、100、200ng/mL。
优选的，S3中质控样本的浓度分别为：3、75、150ng/mL。
本发明的有益效果在于：本发明基于HPLC-MS/MS技术，以SUN-D10为同位素内标，采用同位素内标法进行人血浆中SUN和SU12662的定量测定，本发明通过使SUN的Z异构体和E异构体在色谱柱上的保留时间一致，同时通过离子通道，经质谱检测只以单峰形式出现，通过对单峰面积进行积分计算即可准确得到Z、E异构体总的浓度，具有快速、灵敏、重现性好、操作简单、准确度高等优点。
附图说明
图1为分析物选择性色谱图；其中，a为单峰法中空白血浆样本，b为单峰法中LLOQ血浆样本，c为双峰法中空白血浆样本，d为双峰法中LLOQ血浆样本。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
需要说明的是，本发明中，SUN指舒尼替尼；SUN-D10指舒尼替尼-D10；SU12262指N-去乙基舒尼替尼；Curtain Gas指气帘气；Collision Gas指碰撞气；IonSparay Voltage指喷雾电压；Temperature指雾化温度；Ion source Gas1指雾化气；Ion source Gas2指辅助气；DP指去簇电压；CE指碰撞能量。
2.1.标准品与试剂
标准品SUN(≥99％U)购于上海源叶生物有限公司，批号：A01A7G12355；标准品N-去乙基舒尼替尼(≥99％)购于上海源叶生物有限公司(MedMol)，批号：J08GS153796；标准品SUN-D10(≥98％)购于上海甄准生物科技有限公司(ISOREAG)，批号21B065-A5。甲醇，乙腈均为HPLC级，购于美国天地有限公司(TEDIA)。乙酸铵、甲酸均属于分析纯，购自于成都科龙化学试剂厂。实验使用的纯水购自于广州屈臣氏纯净水有限公司。
2.2.仪器
AB SCIEX Triple QuadTM 4500MD液相色谱串联质谱检测***，由三重四级杆质谱仪(4500MD)、高效液相色谱仪(JasperTM)和软件
Figure BDA0003684379820000031
(版本号：1.6)组成(ABSCIEX公司)；电子天平(SQP型，Sartorius公司)；涡旋混合仪(KB3型，南京迪乐嘉生物科技有限公司)；超声波清洗机(SB-5200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司)；医用离心机(L3-5K型，湖南可成仪器设备有限公司)；医用离心机(H1-16KR型，湖南可成仪器设备有限公司)；1000μL、200μL、100μL、10μL移液器(Eppendorf公司)。
2.3.色谱条件
色谱柱选用ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，2.1×50mm(Waters，美国)；流动相A为0.1％甲酸水溶液，B为0.1％甲酸乙腈溶液，采用梯度洗脱模式，单峰法洗脱条件为：0-0.5min，10％B；0.5-0.6min，10→100％B；0.6-2.5min，100％B；2.5-3.7min，100→10％B。双峰法洗脱条件为：0-0.5min，10％B；0.5-1.5min，10→80％B；1.5-2.7min，80％B；2.7-3.0min，80→30％；3.0-3.5min，30→10％。流速为0.4mL/min，总时长4min；进样盘温度为15℃；柱温箱温度为40℃；进样量为2μL。
2.4.质谱条件
离子源为电喷雾离子源，在正离子模式下进行质量监测，采集模式为多反应监测。质谱条件的固定参数：Curtain Gas为40psi，Collision Gas为8psi，IonSparay Voltage为5500V，Temperature为550℃，Ion source Gas1为55psi，Ion source Gas2为55psi。通过质谱条件优化后，SUN、SU12662及SU-D10的各项质谱检测参数见表1。
表1分析物及内标优化后的质谱检测参数
分析物 Q1(m/Z) Q3(m/Z) DP(V) CE(V)
SUN 399.3 283.0 85 40
SU12662 371.2 283.1 100 29
SU-D10 409.2 325.9 114 35
2.5.溶液配制
2.5.1.储备液配制
精密称取5.2mg SUN，加入甲醇并定容至10mL，SUN储备液浓度为0.52mg/mL；5.0mgSU12662，加入甲醇并定容至10mL，SU12662储备液浓度为0.5mg/mL；1.14mg SUN-D10，加入甲醇并定容至10mL，SUN-D10储备液浓度为0.114mg/mL。所有储备液均在避光条件下配制，并分装于棕色瓶中，保存在-20℃医用冰箱中。
2.5.2.工作液配制
使用甲醇-水(1:1，v/v)作为稀释液，将SUN、SU12662及SUN-D10储备液稀释至10μg/mL，备用。取SUN，SU12662各500μL，配制为1mL的混合储备液A。使用甲醇-水(1:1，v/v)稀释液将混合储备液A稀释成一系列标准溶液：10，50，250，500，1000，2000ng/mL。
2.5.3.质控液配制
质控液与标准液独立平行配制，操作步骤同标准液。低、中、高质控液浓度分别为：30、750、1500ng/mL。
2.6.样品制备
10μL标准液及质控液分别加入90μL人空白血浆中，获得标准曲线样本及质控样本。所有的血浆样本(包括标准曲线样本、质控样本及临床样本)前处理采用蛋白沉淀法，沉淀剂为甲醇。具体操作流程如下：精密移取100μL血浆于1.5mL离心管中。加入300μL甲醇(含内标)，涡旋5min。将1.5mL离心管于4℃，14000rpm条件下离心10min，取上清液200uL于棕色进样瓶中。
3.方法验证
本实验采用同位素内标法对SUN及SU12662进行定量分析。依据2018年FDA发布的生物样品分析方法验证指导原则对方法进行验证。
3.1.选择性
取用6份不同来源的人空白血浆基质来考察该方法的选择性。干扰峰的响应程度应不高于目标峰的定量下限(LLOQ)响应的20％，及内标响应的5％。
3.2.残留效应
通过在进样高浓度样品后，进样空白样品来评估残留。如果残留不可避免，那么在高浓度样品之后空白样品中的残留不应超过定量下限的20％，并且不超过内标的5％。
3.3.标准曲线与定量下限
目前，临床上推荐的SUN血浆治疗浓度范围为50-100ng/mL。标准曲线样本浓度的范围为1-200ng/mL，可满足临床样本的需求。标准曲线包括至少6个校正浓度水平，其制作是以血浆中分析物浓度为横坐标，分析物与内标物的峰面积比值为纵坐标，采用加权(ω＝1/x2)最小二乘法进行回归计算得出标准曲线。校正标样回算的浓度一般应该在标示值的±15％以内，定量下限处应该在±20％以内。
3.4.准确度与精密度
分析方法的准确度是指该方法测得值与分析物标示浓度的接近程度，表示为：(测得值/真实值)×100％。分析方法的精密度是指分析物重复测定的接近程度，定义为测量值的相对标准偏差(Relative Standard Deviation,RSD)。通过单一分析批(批内)和不同分析批(批间)的低、中、高浓度质控样品来评价分析方法的准确度和精密度，每个浓度至少5份待测样品。其中，批间准确度和精密度至少需要三个分析批，且至少两天进行。准确度均值一般应在质控样本标示值的±15％以内，精密度一般不得超过±15％。
3.5.基质效应与提取回收率
基质效应是为了考察生物样本中的基质对分析物响应的增强或抑制。应使用至少6批不同来源的空白基质，在低、中、高浓度质控样品中进行。对于每批基质，通过计算基质存在下的峰面积，与不含基质的峰面积比值，计算每一分析物和内标的基质因子。进一步通过分析物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子。提取回收率是指提取基质前加入分析物，与提取基质后加入分析物响应值的比值，至少配制6批，在低、中、高浓度质控样品中进行。对于基质效应与提取回收率，均是计算得到的结果的RSD不得大于15％。
3.6.稳定性
采用低、中、高浓度质控样品，在储存及预处理后立即分析。由新鲜配制的校正标样获得标准曲线，分析质控样品，每一浓度的均值与标示浓度的偏差应在±15％以内。鉴于临床样本监测的及时性，对工作溶液及血浆样本的短期稳定性进行考察。
4.结果
4.1.选择性
单峰法中SUN、SU12662及SU-D10的保留时间均为1.42min。双峰法中SUN及SU-D10的保留时间均为1.80、1.92min，SU12662的保留时间为1.76、1.89min。在两种方法中，6份不同来源血浆中的内源性物质均不干扰待测物的测定(图1)。
4.2.残留效应
通过在进样最高浓度点后连续进样三针空白评估残留效应，结果表明单峰法与双峰法的残留效应相似。SU12662不存在残留效应，SUN在高浓度点后的空白样品中的响应值均小于其定量下限的20％，SU-D10在进样后的空白样品中的响应值均小于样本响应值的5％，具体结果见表2。
表2两种方法中分析物携带效应数据结果
Figure BDA0003684379820000061
Figure BDA0003684379820000071
4.3.标准曲线与定量下限
SUN及SU12662的一系列标准溶液浓度均为1、5、25、50、100、200ng/mL。标准曲线的绘制是以分析物浓度为横坐标，分析物与内标物的峰面积比值为纵坐标，采用Analyst软件进行加权(ω＝1/x2)最小二乘法回归计算得到，两种方法得出的R2均大于0.99，表明在1-200ng/mL范围内线性关系良好。单峰法SUN定量下限的批内准确度、精密度分别为103.8、3.3％，批间准确度、精密度分别为97.1、5.8％；SU1266定量下限的批内准确度、精密度分别为106.8、5.6％，批间准确度、精密度分别为95.7、9.2％。双峰法SUN定量下限的批内准确度、精密度分别为103.2、3.5％，批间准确度、精密度分别为99.8、3.9％；SU12662定量下限的批内准确度、精密度分别为106.1、3.8％，批间准确度、精密度分别为108.3、4.9％。
4.4.准确度与精密度
选取标准曲线范围内低、中、高三个浓度点，浓度分别为3、75、150ng/mL，每个浓度点各5个批次，每个批次各5个样本进行准确度和精密度的考察。结果显示，两种方法中SUN和SU12662的批内、批间准确度均在85％-115％；批内、批间精密度均不超过15％，见表3。
表3两种方法中分析物批内与批间的精密度、准确度数据结果
Figure BDA0003684379820000072
4.5.基质效应与提取回收率
选取6批不同来源的人血浆进行基质效应考察，结果显示单峰法中SUN及SU12662基质效应的RSD均在15％以内，满足分析要求。但双峰法中基质对分析物响应的影响较大，是由于双峰法中存在两个峰，因此基质对分析物响应的影响也是累加的。本研究的样本前处理采用的是有机试剂(甲醇)蛋白沉淀法。结果显示单峰法中SUN及SU12662的回收率在98.8-111.4％，RSD不超过15％。双峰法与单峰法的回收率结果较为一致，见表4。
表4两种方法中分析物的基质效应及回收率数据结果
Figure BDA0003684379820000081
4.6.稳定性
稳定性根据实际临床需求进行了考察，包括样本处理前不避光室温放置72h、样本处理前避光室温放置72h、4℃放置72h、样本处理前反复冻融3次的稳定性。结果显示，样本在不避光室温放置72h、4℃放置72h、反复冻融3次后的稳定性均较好，准确度在92.9-113％之间，RSD在6.3％内。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，该方法基于HPLC-MS/MS技术，以SUN-D10为同位素内标，采用同位素内标法进行人血浆中SUN和SU12662的定量测定，其特征在于，在该方法中SUN的Z异构体和E异构体在色谱柱上的保留时间一致，同时通过离子通道，经质谱检测只以单峰形式出现，通过对单峰面积进行积分计算即可准确得到Z、E异构体总的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：血浆样本前处理：以甲醇为溶剂配制浓度为10ng/mL的SUN-D10甲醇溶液即为内标溶液，以内标溶液为沉淀剂，采用蛋白沉淀法进行血浆样本前处理；
S2：标准曲线样本配制：分别称取SUN、SU12662，以甲醇溶解并定容，分别配置成浓度为0.5mg/mL的储备液；使用体积比为1：1的甲醇-水作为稀释液，将SUN、SU12662储备液稀释至10μg/mL；分别取浓度为10μg/mL的SUN、SU12662各500μL配制成1mL的混合液，以体积比为1：1的甲醇-水稀释液逐级稀释混合液得到标准系列工作溶液，以按S1处理方法处理后的人空白血浆稀释该工作溶液，制成标准曲线样品；
S3：质控样本配制：按照S2标准曲线样本配制方法，配制低、中、高浓度质控样本；
S4：测试样本配制：将待测血浆按S1处理方法进行处理，制成测试样本；
S5：采用HPLC-MS/MS法测定SUN和SU12662的浓度，其中色谱条件和质谱条件分别如下：
色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18，1.7μm，2.1×50mm；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B:0.1％甲酸乙腈溶液；洗脱条件为：0-0.5min，10％B；0.5-0.6min，10→100％B；0.6-2.5min，100％B；2.5-3.7min，100→10％B；流速为0.4mL/min；总时长4min；进样盘温度15℃；柱温箱温度40℃；进样量为2μL；
质谱条件：离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子多反应监测+MRM；质谱条件的固定参数：Curtain Gas为40psi，Collision Gas为8psi，IonSparay Voltage为5500V，Temperature为550℃，Ion source Gas1为55psi，Ion source Gas2为55psi；SUN、SU12662、SUN-D10的离子反应分别为m/z 399.3→283.0、m/z 371.2→283.1、m/z 409.2→325.9，DP电压分别为85V、100V、114V，CE能量分别为40V、29V、35V。
3.根据权利要求2所述的基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，其特征在于，S1中血浆样本前处理步骤为：精密移取100μL血浆于1.5mL离心管中，加入300μL内标溶液，涡旋5min，将1.5mL离心管于4℃，14000rpm条件下离心10min，取上清液即为处理后的血浆样本。
4.根据权利要求2所述的基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，其特征在于，S2中标准曲线样本的浓度分别为1、5、25、50、100、200ng/mL。
5.根据权利要求2所述的基于HPLC-MS/MS单峰法同时测定人血浆中SUN及SU12662的方法，其特征在于，S3中质控样本的浓度分别为3、75、150ng/mL。
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