CN111812220A - 一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法 - Google Patents

一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，前处理操作简单、快捷、样本用量少、分析时间短，5min之内可完成血浆中5种常见抗肿瘤药物的分离和检测；采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量；可同时满足临床上高通量样本检测需求，为临床上联合应用提供药动学参考。

Description

一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法
技术领域
本发明属于血浆检测技术领域，具体涉及一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，具体抗肿瘤药物为：甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(7-hydroxyMethotrexate，HMTX)、氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-FU)、紫杉醇(Paclitaxel，PCT)和多西他赛(Docetaxel，DCT)。
背景技术
治疗药物监测(TDM)是针对不同患者个体，量体裁衣式地制定给药方案的一种方法。通过定量测定血液中药物浓度来进行患者个体的剂量滴定，以便获得最佳的疗效、更好的耐受性，同时还可以降低毒副作用。因此，治疗药物的监测至关重要。
传统的微生物法费时且烦琐；而免疫分析法成本昂贵，专一性差，难以实现高通量检测，关键问题由于代谢产物的存在，抗体可能交叉反应使测定结果偏高。
甲氨蝶呤(MTX)是一种叶酸还原酶抑制剂，为叶酸类抗肿瘤药物，主要通过对二氢叶酸还原酶的抑制达到阻碍肿瘤细胞DNA的合成，从而抑制肿瘤细胞的生长和繁殖。临床上广泛用于治疗急性淋巴细胞性白血病、骨肉瘤、恶性淋巴瘤等。7-羟基甲氨蝶呤为MTX的主要代谢产物，研究表明，7-OHMTX体内浓度水平与大剂量MTX给药后的急性肝脏毒性相关，所以同时监测MTX和7-OHMTX具有重要的临床意义。
氟尿嘧啶(5-FU)是一种常用的抗代谢类抗肿瘤药物，该药需较长时间与肿瘤组织接触才能发挥抑制及杀灭肿瘤细胞的作用，确保有效的血药浓度是治疗的关键。而5-FU在杀灭肿瘤细胞的同时对机体正常细胞也具杀伤作用，若剂量使用不当，可致临床疗效不佳或发生骨髓抑制等严重毒性反应。因此，开展5-FU治疗药物浓度监测对临床合理用药有着重要的指导意义。
多西他赛(DCT)又名多烯紫杉醇，和紫杉醇(PCT)的作用相同，是一类从短叶紫杉树皮中提取的天然产物，通过与肿瘤细胞的微管蛋白结合，促进微管蛋白形成稳定的微管，从而抑制癌细胞的有丝***和增殖。临床上对乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌及卵巢癌等多种实体瘤具有较好的抑制活性。
根据调研，以上抗肿瘤药物的检测方法主要有高效液相色谱-紫外法(HPLC-UV)和LC-MS/MS。HPLC-UV法专属性较差、灵敏度较低、样本用量大，且分析时间长，而LC-MS/MS法多采用液液萃取法处理血浆，操作繁琐和耗时。比如，中国专利(CN 105424843 A)公开了“一种测定多西他赛或紫杉醇的高效液相色谱-三重四级杆质谱联用方法”，该发明建立了ESI(-)和APCI(-)两种电离模式的质谱方法，采用液液萃取法处理样本，经过了萃取、氮吹和复溶的步骤，极大地增加了前处理时间。再比如，中国专利(CN 110320302 A)公开了一种“快速测定甲氨蝶呤血药浓度的方法”，该发明使用LC-MS/MS法虽前处理简单，但只测定了MTX的浓度，未监测主要代谢物7-OHMTX，而同时监测MTX和7-OHMTX才具有重要的临床意义。中国专利(CN 110927297 A)公开了“一种同时检测血液样品中多种抗肿瘤药物的方法”，该方法同时检测了13种抗肿瘤药物，但前处理复杂，需要蛋白沉淀后干燥处理再复溶后过滤，中国专利(CN 110045048 A)公开了“一种测定人血浆中两种抗肿瘤药物浓度的HPLC-MSMS方法”，检测种类有限，且前处理采用蛋白沉淀后氮吹复溶，前处理复杂，这些方法在临床应用比较受限。
发明内容
本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法。
本发明的技术方案如下：
一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，
所述抗肿瘤药物分别为：甲氨喋呤(MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、氟尿嘧啶(5-FU)、紫杉醇(PCT)和多西他赛(DCT)；
上述抗肿瘤药物对应的同位素内标物分别为：甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、紫杉醇-d5(PCT-d5)和多西他赛-d5(DCT-d5)；
血浆样本中加入含内标的蛋白沉淀剂，涡旋振荡，离心后取上清进样，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗肿瘤药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗肿瘤药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.05％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1；每个样品采集时间为5min；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。
为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血浆中抗肿瘤药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗肿瘤药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸水溶液。
在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.05％～0.2％甲酸水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：ACQUITYUPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，5.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。
在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、紫杉醇-d5(PCT-d5)和多西他赛-d5(DCT-d5)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血浆中抗肿瘤药物时的重现性、准确度均较好。
在一种方案中，流速为0.2～0.5mL/min，优选为0.3mL/min。
进一步地，柱温为35～50℃，优选为40℃。
更进一步地，进样体积为0.2～10μL，优选为1μL。
在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血浆中抗肿瘤药物时，具体色谱条件为：
(1)高效液相色谱条件：
流动相A：0.1％甲酸-水溶液；
流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1；每个样品采集时间为5min；具体梯度洗脱过程见表1；流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL；
表1流动相梯度洗脱参数
Figure BDA0002515570380000041
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。各目标待测物的质谱采集参数见表2。
表2抗肿瘤药物检测质谱参数
Figure BDA0002515570380000042
Figure BDA0002515570380000051
本发明提及的血浆为人或动物血浆。
在一种方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；其中，蛋白质沉淀剂为异丙醇与乙腈混合溶液。
优选地，蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:1～3，在不影响本发明效果的情况下，例如，蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:2。
在一种优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:1～3)，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为0.1～0.3:19.9～19.7。
在一种更优选方案中，经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。其中，含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂比例为0.2:19.8。
在一种方案中，混合内标液按照如下方法制备：
将10μg/mL甲氨喋呤-d3(MTX-d3)同位素内标母液、10μg/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)同位素内标母液、500μg/mL氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)同位素内标母液、50μg/mL紫杉醇-d5(PCT-d5)同位素内标母液和10μg/mL多西他赛-d5(DCT-d5)同位素内标母液以甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、100ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、5000ng/mL氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、500ng/mL紫杉醇-d5(PCT-d5)和500ng/mL多西他赛-d5(DCT-d5)的混合内标液；
进一步地，制备混合内标液时，采用的甲醇水溶液为50％～90％甲醇水溶液；优选为70％～90％甲醇水溶液；更优选为80％甲醇水溶液。
在一种优选方案中，混合内标液按照如下方法制备：
将10μg/mL甲氨喋呤-d3(MTX-d3)同位素内标母液、10μg/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)同位素内标母液、500μg/mL氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)同位素内标母液、50μg/mL紫杉醇-d5(PCT-d5)同位素内标母液和10μg/mL多西他赛-d5(DCT-d5)同位素内标母液以80％甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、100ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、5000ng/mL氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、500ng/mL紫杉醇-d5(PCT-d5)和500ng/mL多西他赛-d5(DCT-d5)的混合内标液。
在一种优选方案中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：取200μL上述混合内标液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将1mg/mL甲氨喋呤(MTX)标准品母液、1mg/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)标准品母液、4mg/mL氟尿嘧啶(5-FU)标准品母液、2mg/mL紫杉醇(PCT)标准品母液和2mg/mL多西他赛(DCT)标准品母液以甲醇水溶液配制成包含有50μg/mL甲氨喋呤(MTX)、50μg/mL7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、50μg/mL氟尿嘧啶(5-FU)、10μg/mL紫杉醇(PCT)和10μg/mL多西他赛(DCT)的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
甲氨喋呤(MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)和氟尿嘧啶(5-FU)的浓度相同，七个浓度依次为：5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
紫杉醇(PCT)和多西他赛(DCT)的的浓度相同，七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。
进一步地，制备混合标准溶液时，采用的甲醇水溶液为50％～90％甲醇水溶液；优选为70％～90％甲醇水溶液；更优选为80％甲醇水溶液。
进一步地，空白血浆基质为不含抗肿瘤目标药物的空白血浆。
在一种优选方案中，标准品溶液按照如下方法制备：
将1mg/mL甲氨喋呤(MTX)标准品母液、1mg/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)标准品母液、4mg/mL氟尿嘧啶(5-FU)标准品母液、2mg/mL紫杉醇(PCT)标准品母液和2mg/mL多西他赛(DCT)标准品母液以80％甲醇水溶液配制成包含有50μg/mL甲氨喋呤(MTX)、50μg/mL7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、50μg/mL氟尿嘧啶(5-FU)、10μg/mL紫杉醇(PCT)和10μg/mL多西他赛(DCT)的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液以空白血浆基质(不含抗肿瘤目标药物的空白血浆)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。
每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
本发明提及的甲醇水溶液的浓度一般指体积浓度。
本发明还包括制备质控品，所述质控品为含有抗肿瘤药物的空白血浆基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)。其中，
QC(L)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至5000倍；
QC(M)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至500倍；
QC(H)为上述混合标准溶液以空白血浆基质稀释至50倍。
优选地，空白血浆基质为不含抗肿瘤目标药物的空白血浆。
在一种优选方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准溶液以不含抗肿瘤目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表3所示。
表3抗肿瘤药物质控品对应浓度(单位ng/mL)
Figure BDA0002515570380000071
QC(L)中包含：10ng/mL甲氨喋呤(MTX)、10ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、10ng/mL氟尿嘧啶(5-FU)、2ng/mL紫杉醇(PCT)和2ng/mL多西他赛(DCT)。
QC(M)中包含：100ng/mL甲氨喋呤(MTX)、100ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、100ng/mL氟尿嘧啶(5-FU)、20ng/mL紫杉醇(PCT)和20ng/mL多西他赛(DCT)。
QC(H)中包含：1000ng/mL甲氨喋呤(MTX)、1000ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、1000ng/mL氟尿嘧啶(5-FU)、200ng/mL紫杉醇(PCT)和200ng/mL多西他赛(DCT)。
采用本发明的技术方案，优势如下:
本发明提供一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，前处理操作简单、快捷、样本用量少、分析时间短，5min之内可完成血浆中5种常见抗肿瘤药物的分离和检测；采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量；可同时满足临床上高通量样本检测需求，为临床上联合应用提供药动学参考。
附图说明
图1为抗肿瘤药物标准品的提取离子流色谱图；
图2为血浆样本中抗肿瘤药物的提取离子流色谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：
一、实验材料与仪器
1.材料
样本来自于武汉亚洲心脏病医院2019年11月份门诊收集的血浆样本。
(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱***(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。
(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)(Waters Corporation)。
(3)标准品：抗肿瘤药物及其同位素内标均购自于TRC。
(4)质控品：含有抗肿瘤药物的空白血浆基质，分低中高三个浓度分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，见表3所示。
二、液质条件
(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸-水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ACQUITYUPLC HSS T3(2.1×100mm,1.8μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表1。流速为0.3mL/min，柱温为40℃，进样体积为1μL。
(2)质谱条件：在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。各目标待测物的质谱采集参数见表2。
三、实验过程
(1)标准品配制：
将1mg/mL甲氨喋呤(MTX)标准品母液、1mg/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)标准品母液、4mg/mL氟尿嘧啶(5-FU)标准品母液、2mg/mL紫杉醇(PCT)标准品母液和2mg/mL多西他赛(DCT)标准品母液以80％甲醇水溶液配制成包含有50μg/mL甲氨喋呤(MTX)、50μg/mL7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、50μg/mL氟尿嘧啶(5-FU)、10μg/mL紫杉醇(PCT)和10μg/mL多西他赛(DCT)的混合标准溶液。
将上述混合标准溶液以空白血浆基质(不含抗肿瘤目标药物的空白血浆)配制成七个不同浓度点的校准品溶液，配制过程如下：取10μL混合标准溶液加入至190μL空白血浆基质中作为第一个高值浓度点；取第一高值浓度点用等体积空白血浆基质稀释得第二高值浓度点；取第一高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第三高值浓度点；取第二高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第四高值浓度点；取第三高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第五高值浓度点；取第四高值浓度点用9倍体积空白血浆基质稀释得第六高值浓度点；取第五高值浓度点用4倍体积空白血浆基质稀释得第七高值浓度点。
所述校准品溶液的七个浓度点为：
甲氨喋呤(MTX)、7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)和氟尿嘧啶(5-FU)的浓度相同，七个浓度依次为：5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
紫杉醇(PCT)和多西他赛(DCT)的的浓度相同，七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。
(2)混合内标液配制
将10μg/mL甲氨喋呤-d3(MTX-d3)同位素内标母液、10μg/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)同位素内标母液、500μg/mL氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)同位素内标母液、50μg/mL紫杉醇-d5(PCT-d5)同位素内标母液和10μg/mL多西他赛-d5(DCT-d5)同位素内标母液以80％甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL甲氨喋呤-d3(MTX-d3)、100ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3(HMTX-d3)、5000ng/mL氟尿嘧啶-13C,15N2(5-FU-13C,15N2)、500ng/mL紫杉醇-d5(PCT-d5)和500ng/mL多西他赛-d5(DCT-d5)的混合内标液。
其中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：取200μL上述混合内标液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:2)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。
(3)质控品配制：
取上述混合标准溶液以不含抗肿瘤目标药物的空白血浆配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，具体如表3所示。
QC(L)中包含：10ng/mL甲氨喋呤(MTX)、10ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、10ng/mL氟尿嘧啶(5-FU)、2ng/mL紫杉醇(PCT)和2ng/mL多西他赛(DCT)。
QC(M)中包含：100ng/mL甲氨喋呤(MTX)、100ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、100ng/mL氟尿嘧啶(5-FU)、20ng/mL紫杉醇(PCT)和20ng/mL多西他赛(DCT)。
QC(H)中包含：1000ng/mL甲氨喋呤(MTX)、1000ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤(HMTX)、1000ng/mL氟尿嘧啶(5-FU)、200ng/mL紫杉醇(PCT)和200ng/mL多西他赛(DCT)。
(4)样品处理
1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
2)血浆样品前处理：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(异丙醇与乙腈的体积比1:2)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。
3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血浆样品前处理一致，此处不再赘述。
四、方法验证
1.提取离子流色谱图：抗肿瘤药物的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗肿瘤药物标准品的提取离子流色谱图；图2为血浆样本中抗肿瘤药物的提取离子流色谱图。
2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。抗肿瘤药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表4。
表4抗肿瘤药物线性回归方程及线性相关系数
Figure BDA0002515570380000111
3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。随机选取一例人血浆样品，其中1个不加标准品，其它3个分别加入低、中、高3个浓度的标准品，以相同步骤重复处理并测定5次，结果经计算如表5所示。结果显示，抗肿瘤药物的加标回收率在95.46％-104.79％之间，5次重复试验的RSD在4.82％-10.44％范围。
表5抗肿瘤药物加标回收率结果
Figure BDA0002515570380000112
4.精密度试验：取正常人血浆样品一天内重复处理6批，以同位素内标法定量测定抗肿瘤药物的浓度，批内精密度为4.96-10.79％，三日内分3批处理，计算批间精密度为5.04-10.03％，结果见表6。
表6批内批间精密度测试结果
Figure BDA0002515570380000121
Figure BDA0002515570380000131
Figure BDA0002515570380000141
五、讨论
本发明采用高效液相色谱串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时测定人体血浆中的甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛5种常见的抗肿瘤药物的方法。本发明前处理简单快捷，血浆用量少、分析时间短，只需5min即可完成5种抗肿瘤药物的检测。
采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗肿瘤药物的加标回收率为95.46％-104.79％之间，5次重复试验的RSD为4.82％-10.44，准确度良好。重现性结果表明，抗肿瘤药物批内精密度为4.96-10.79％，批间精密度为5.04-10.03％，方法的重现性良好。
总之，本发明的检测方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，5min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血浆抗肿瘤药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种检测血浆中抗肿瘤药物浓度的方法，
所述抗肿瘤药物分别为：甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、紫杉醇和多西他赛；
上述抗肿瘤药物对应的同位素内标物分别为：甲氨喋呤-d3、7-羟基甲氨蝶呤-d3、氟尿嘧啶-13C,15N2、紫杉醇-d5和多西他赛-d5；
采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血浆中的上述抗肿瘤药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血浆基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血浆中抗肿瘤药物的含量，具体色谱条件为：
(1)超高效液相色谱条件：
流动相A：0.05％～0.2％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；
色谱柱型号：ACQUITY UPLC HSS T3；
采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0.0-1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由99:1匀速渐变至70:30；在1.0-2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由70:30匀速渐变至2:98；在2.5-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比保持2:98不变；在3.0-5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至99:1；每个样品采集时间为5min；
(2)质谱条件：
在电喷雾电离检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为3.0kV(ESI+)及2.5kV(ESI-)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为500℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.05％～0.15％甲酸水溶液；流速为0.2～0.5mL/min；柱温为35～50℃；进样体积为0.2～10μL。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，
所述流动相A为0.1％甲酸水溶液；所述流速为0.3mL/min；所述柱温为40℃；所述进样体积为1μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物血浆。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：向血浆中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述蛋白质沉淀剂为异丙醇与乙腈混合溶液；优选地，所述蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:1～3，更优选地，所述蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:2。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，
所述经过预处理的血浆按照如下方法制备：取50μL血浆于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，转移离心管中的上清液60μL至塑料内衬管中，待进样；所述蛋白质沉淀剂中异丙醇与乙腈的体积比1:2。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，
所述含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：
将10μg/mL甲氨喋呤-d3同位素内标母液、10μg/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3同位素内标母液、500μg/mL氟尿嘧啶-13C,15N2同位素内标母液、50μg/mL紫杉醇-d5同位素内标母液和10μg/mL多西他赛-d5同位素内标母液以甲醇水溶液配制成包含有100ng/mL甲氨喋呤-d3、100ng/mL 7-羟基甲氨蝶呤-d3、5000ng/mL氟尿嘧啶-13C,15N2、500ng/mL紫杉醇-d5和500ng/mL多西他赛-d5的混合内标液；取200μL上述混合内标液，加入19.8mL蛋白沉淀剂，混合均匀得含内标的蛋白沉淀剂。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
所述标准品按照如下方法制备：
将1mg/mL甲氨喋呤标准品母液、1mg/mL 7-羟基甲氨蝶呤标准品母液、4mg/mL氟尿嘧啶标准品母液、2mg/mL紫杉醇标准品母液和2mg/mL多西他赛标准品母液以甲醇水溶液配制成包含有50μg/mL甲氨喋呤、50μg/mL7-羟基甲氨蝶呤、50μg/mL氟尿嘧啶、10μg/mL紫杉醇和10μg/mL多西他赛的混合标准溶液；
将上述混合标准溶液以空白血浆基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：
甲氨喋呤、7-羟基甲氨蝶呤和氟尿嘧啶的浓度相同，七个浓度依次为：5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL和2500ng/mL；
紫杉醇和多西他赛的的浓度相同，七个浓度依次为：1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、250ng/mL和500ng/mL。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，
所述甲醇水溶液为50％～90％甲醇水溶液；优选为70％～90％甲醇水溶液；更优选为80％甲醇水溶液。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，
所述空白血浆基质为不含抗肿瘤目标药物的空白血浆。
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