CN115044505A - 一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用 - Google Patents

一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用，属于生物工程技术领域。本发明从酸菜表面微生物分离菌株，并采用牛津杯法对其进行痤疮丙酸杆菌拮抗微生物的筛选，得到一株能高效拮抗痤疮丙酸杆菌的微生物。经鉴定，菌株为Bacillusvelezensis，属于贝莱斯芽孢杆菌，并被保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCCNo：62393，保藏日期为2022年4月18日。对该菌株的抑菌物质进行提取，得到贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽，该抗菌脂肽对常见食品相关菌株和皮肤致病菌有广谱的抑菌效果，可以应用于食品、化妆品、护肤品等方面。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用
技术领域
本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
皮肤微生态指由各种微生物与皮肤表面的组织等共同组成的生态***。皮肤微生态与体内代谢失衡会发生如特征性皮炎、银屑病、痤疮等皮肤性疾病，引起皮肤疾病的一个重要原因是微生物感染，例如痤疮丙酸杆菌的大量异常繁殖可引起痤疮，金黄色葡萄球菌可导致特异性皮炎，白色念珠菌可引起皮肤念珠菌病，好发于皮肤皱褶处(腑窝、腹股沟，***下，***周围及甲沟，指间)，皮肤潮红、潮湿、发亮，有时盖上一层白色或呈破裂状物，病变周围有小水泡。因此一种能广谱抑制皮肤致病菌的抑菌物质能在皮肤疾病的治疗和皮肤微生态的保护方面存在潜在的应用价值。
食品腐败对食品工业造成了巨大损失。据统计，全世界每年食品腐败造成了约有10％-20％的食品损失。微生物的大量繁殖是导致食品腐败变质决定性因素之一。添加防腐剂作为抑制腐败的方法之一，目前主要应用的防腐剂为化学防腐剂。然而化学防腐剂对人体存在一定的毒性，随着人们对食品安全关注度的不断提升，寻找更多可能的天然的、绿色安全的、能有效抑制食品腐败菌滋生的防腐剂变得越来越受到重视。
贝莱斯芽孢杆菌的种分类地位的确定较晚，最早在1999年被分离到，直到2005年被首次报道和命名。但近年来，国内外有关贝莱斯芽孢杆菌的报道越来越多，研究主要集中在促进动植物生长、拮抗病原菌、诱导***抗性、抑菌物质及其基因簇鉴定、拮抗作用机制等方面，该菌在生物防治、药物研发、食品发酵和工业应用等方面具有重要作用。尤其在抑菌方面，贝莱斯芽孢杆菌通过合成次级代谢产物实现对病原菌的抑制作用，其中主要包括细菌素、抑菌蛋白、脂肽类物质和聚酮化合物等。其中抗菌脂肽发挥了重要作用。贝莱斯芽孢杆菌产生的脂肽类物质包括表面活性素、伊枯草菌素、丰原素、杆菌霉素等。刘雪娇等发现贝莱斯芽孢杆菌3A3-15能够产生表面活性素等抑菌物质，能够造成尖孢镰刀菌的菌丝膨大、弯曲、缠绕、螺旋、节间缩短甚至菌丝断裂等，具有明显的致畸作用，而且对孢子萌发的抑制率高达93.2％。Chowdhury等研究表明贝莱斯芽孢杆菌FZB42菌株在与莴苣(lettuce)根系相互作用过程中能够产生Surfactin、Fengycin和Bacillomycin D，并认为其代谢产物脂肽类和不仅直接抑制立枯丝核菌，还能够介导莴苣的防御性反应。贝莱斯芽孢杆菌Y6产生的脂肽类物质(75μg/mL)能够抑制大约60％的真菌孢子萌发，其中伊枯草菌素对真菌孢子萌发表现出较强的抑制作用，泛革素表现出较弱的抗真菌活性，表面活性素则没有明显的抑制真菌活性。
虽然目前针对贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽对病原菌的抑制作用的研究较多，但多数研究仍然主要集中于农业、生物防治和养殖业等方面。还未曾见贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽针对皮肤致病菌和食品腐败菌菌的拮抗从而保护皮肤微生态及食品防腐。脂肽具有低毒性、好的生物降解性、有用的物理化学性质和生物活性等独特优势，这使其在化妆品、医疗保健、生物医学、农牧业和食品工业等各个方面有广泛的应用。贝莱斯芽孢杆菌及其抗菌脂肽在化妆品、护肤品、食品等方面存在潜在的应用价值及巨大的市场需求。
发明内容
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6，已保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62393，保藏日期为2022年4月18日，分类学命名为Bacillus velezensis。
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6来源于酸菜，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6在固体LB培养基上呈现乳白色小点，边缘粗糙不规则。该菌筛选自酸菜表面微生物，经细菌通用引物27F和1492R对该菌进行菌落PCR，产物送往上海Songon公司测序之后，使用BLAST在NCBI数据库中将序列与先前发布的细菌16SrRNA序列比对，同源度为99％，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该菌种鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。
本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6或其发酵液，或其提取物，或其代谢物。
在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6在微生物菌剂中的添加量：其菌浓至少为108cfu/ml。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ST7-6、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6的发酵液、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6的代谢物中的一种或多种。
在本发明中的一种实施方式中，所述产品为食品、药品、饲料添加剂、护肤品或化妆品。
在本发明中的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6在所述产品中的菌浓至少为108cfu/ml。
本发明还提供了一种抗菌药品，所述药品中含有上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ST7-6或上述任一微生物菌剂。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6或其发酵液或其代谢物，或上述微生物菌剂在抑制细菌或真菌中的应用，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
在本发明中的一种实施方式中，所述细菌包括但不限于痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌；所述真菌包括但不限于米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、微小根毛霉、伞状毛霉菌、Aspergillus costaricensis、Cladosporiumsubcinereum、白色念珠菌。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6或其发酵液或其代谢物，或上述微生物菌剂在制备抑制细菌或真菌的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包括但不限于药品、饲料添加剂、化妆品、护肤品。
在本发明的一种实施方式中，所述细菌包括但不限于痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、、李斯特菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌；所述真菌包括但不限于白色念珠菌、米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、微小根毛霉、伞状毛霉菌、Aspergillus costaricensis、Cladosporiumsubcinereum。
本发明还提供了一种抗菌脂肽，所述抗菌脂肽制备方法为：将上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6接种至培养基中发酵制备得到发酵液，从发酵液中分离提取得到抗菌脂肽。
在本发明的一种实施方式中，所述抗菌脂肽由所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)ST7-6通过以下方法培养发酵得到。
(1)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6种子液制备：
将LB固体培养基上的单菌落用接种环条一环至LB液体培养基，37℃，220rpm液体培养16～18h，制备得到种子液。
(2)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6的发酵：
将种子液按照2％～5％(v/v)的菌种比例接种至液体LB培养基，发酵温度30～37℃，发酵时间48～96h、摇床转速160～220rpm。
(3)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6抗菌脂肽的制备：
将发酵液8000rpm离心15min得到发酵上清，发酵上清用6mol/L盐酸调节pH为2.0，4℃冰箱放置过夜，发酵上清在8000rpm离心15min，弃去上清，留下沉淀，加入甲醇后旋涡震荡10min，超声15min，抽提4～8h后。再次离心，取上清过0.22μm滤膜，得到贝莱斯芽孢杆菌所产抗菌脂肽。
在本发明的一种实施方式中，液体LB培养基配方：胰蛋白胨10g、酵母提取液5g、氯化钠10g、蒸馏水1L、pH 6.8。
在本发明的一种实施方式中，所述抗菌脂肽可以对皮肤致病菌产生较好的拮抗作用。
在本发明的一种实施方式中，上述皮肤致病菌主要指痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌。
在本发明的一种实施方式中，拮抗作用效果通过双层平板牛津杯实验测量抑菌圈的大小来实现
在本发明的一种实施方式中，所述抗菌脂肽对食品相关菌株存在较好的抑制效果。
所述的食品腐败菌包括米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、李斯特菌、微小根毛霉、伞状毛霉菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌等。
在本发明的一种实施方式中，拮抗效果通过涂布平板牛津杯法实验测量抑菌圈的大小来实现。
在本发明提供了上述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis ST7-6及其抗菌脂肽在化妆品、护肤品方面的应用。
本发明还提供了述贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis ST7-6及其抗菌脂肽在食品防腐、抗菌药物等方面的应用。
有益效果
(1)本发明通过牛津杯法从酸菜表面分离筛选得到一株具有广谱抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis ST7-6，该菌株发酵液针对痤疮丙酸杆菌存在明显抑菌效果，抑菌圈直径达到22.25mm，从该菌株发酵液上清中可以制备得到抗菌脂肽。
(2)该抗菌脂肽具有广谱抑菌作用。对食品相关菌株米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、李斯特菌、微小根毛霉、伞状毛霉菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌；皮肤致病菌：痤疮丙酸杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌均存在明显的抑菌效果。
(3)贝莱斯芽孢杆菌来源安全，应用广泛，脂肽具有低毒性、好的生物降解性、有用的物理化学性质和生物活性等独特优势，能够作为食品防腐剂或者化妆品、护肤品添加剂发挥抑菌作用，在化妆品、护肤品、食品工业等各个方面存在广泛的应用价值。
生物材料保藏
一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6，分类学命名为Bacillusvelezensis，已于2022年4月18日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：62393，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同菌株对痤疮丙酸杆菌的抑菌圈直径。
图2：菌株形态图。
图3：薄层色谱层析法分析贝莱斯芽孢杆菌ST7-6抗菌脂肽，其中A板为原位酸水解前的层析板，B板为原位酸水解后的层析板。
图4：贝莱斯芽孢杆菌ST7-6的脂肽合成基因的PCR检测。
图5：贝莱斯芽孢杆菌ST7-6抗菌脂肽对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
以下实施例中所述的培养基如下：
LB液体培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、酵母粉(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L。
LB平板：蛋白胨(英国Oxoid公司)10g/L、酵母粉(Oxoid)5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉20g/L。
YM培养基：蛋白胨(英国Oxoid公司)5g/L、酵母粉(Oxoid)3g/L、麦芽提取物3g/L、葡萄糖10g/L、琼脂20g/L，pH 6.2。
PDA平板：马铃薯粉6g/L、葡萄糖20g/L、氯霉素0.1g/L、琼脂20g/L、pH 5.8。
实施例1：贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis ST7-6分离、筛选、鉴定
本发明从酸菜表面分离筛选得到一株具有广谱抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis ST7-6。主要生物学特征，在LB固体培养基上呈现乳白色小点，边缘粗糙不规则。
其发酵液及所产抗菌脂肽具有广谱抗菌活性。具体步骤如下：
1、菌株的分离
具体步骤如下：
(1)选取食品酸菜，超净台取样剪碎，放入50ml无菌离心管中，用称量天平称取10g。
(2)加入玻璃珠以及25ml无菌生理盐水中，220rpm，37℃摇床振荡30min混匀后得到样品悬浊液。
(3)取样品悬浊液1ml，进行10倍梯度稀释，稀释至10-1、10-2、10-3、10-4。
(4)用移液枪取100μL各梯度稀释液分别涂布于LB琼脂平板培养基，每个梯度两个平行，37℃恒温培养箱中培养48h。
(5)挑取单菌落划线分离，用于后期的筛选。
2、菌株的筛选
具体步骤如下：
(1)采用牛津杯双层平板法，以痤疮丙酸杆菌作为指示菌筛选供试菌株。将LB平板上的单菌落按照1％(v/v)的比例接入液体LB培养基中，37℃、220rpm震荡培养24h，得到发酵液；
(2)向培养皿中倒入10ml已融化的固体RCM培养基，待凝固后用无菌镊子夹取牛津杯放于平板上，另取固体培养基于微波炉中溶化，待温度降到50℃左右时，按照5％(v/v)的比例加入痤疮丙酸杆菌的菌悬液，将含有痤疮丙酸杆菌的固体培养基约10ml，其中痤疮丙酸杆菌的菌悬液的菌浓为：108cfu/ml，倒入凝固的固体培养基上层，待培养基凝固后，夹出牛津杯，形成样孔。
(3)在孔内分别注入供试菌株100μL发酵液，发酵液中菌浓为108cfu/ml，每个处理设置3个平行。37℃厌氧培养48h。
(4)从培养箱中拿出牛津杯平板，用直尺测量微生物的抑菌圈直径，取其平均值作为该微生物发酵液的抑菌圈直径。
结果如图1所示，根据抑菌圈直径大小，筛选得到5株能明显拮抗痤疮丙酸杆菌的菌株分别命名为菌株A、菌株B、菌株C、菌株D、菌株E，其对痤疮丙酸杆菌抑菌圈直径均在20mm以上，其中菌株B的发酵液抑菌圈直径达到22.25mm，对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果最好。因此采用菌株B做下一步的菌株的鉴定。
3、菌株的鉴定
具体步骤如下：
(1)对步骤2中得到的菌株B使用通用细菌引物27F和1492R扩增菌株16SrRNA基因。其中通用细菌引物27F序列为5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，通用细菌引物1492R序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
(2)使用30μL反应混合物进行PCR，选择Taq DNA Polymerase(Takara公司)酶进行，PCR条件为预变性95℃，3min；扩增阶段34个循环，按照95℃，30s；55℃，30s；72℃，1min，40s进行，得到PCR产物。
(3)将步骤(2)得到的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析并送上海Songon公司进行测序。
(4)使用BLAST在NCBI数据库中将序列与先前发布的细菌16S rRNA序列比对，同源度为99％，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述菌株B在LB固体培养基中，结果如图2所示。其菌落特征为：乳白色、圆点、边缘粗糙。
经鉴定，菌株B为Bacillus velezensis，属于贝莱斯芽孢杆菌，命名为Bacillusvelezensis ST7-6。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis ST7-6抗菌脂肽的制备及抑菌效果具体步骤如下：
1、贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis ST7-6发酵液的制备。
(1)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6种子液制备：
将LB固体培养基上的单菌落用接种环条一环至LB液体培养基，37℃，220rpm液体培养16～18h，制备得到种子液。
(2)贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6的发酵：
将种子液按照3％(v/v)的菌种比例接种至液体LB培养基，发酵温度为30℃，发酵时间为72h、摇床转速为220rpm，制备得到发酵液。
2、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)ST7-6抗菌脂肽的制备。
将步骤1制备得到的发酵液在8000rpm条件下离心15min得到发酵上清，发酵上清用6mol/L盐酸调节pH为2.0，4℃冰箱放置12h后，将发酵上清在8000rpm条件下离心15min，弃去上清，留下沉淀，加入甲醇(甲醇体积是按照10％体积加入)后旋涡震荡10min，超声15min，抽提4～8h后。再次离心，取上清过0.22μm滤膜，取滤液，即得到贝莱斯芽孢杆菌所产的抗菌脂肽溶液。
3、抗菌脂肽的鉴定及分析
(1)薄层色谱层析法分析抗菌脂肽
采用原位酸水解茚三酮显色法进行薄层层析分析。取两块活化的硅胶板，用铅笔标记为记为A板和B板，在距离底部1cm处划一根横线，在该横线上每隔0.5cm处，将毛细管伸入至贝莱斯芽孢杆菌ST7-6抗菌脂肽样品中，沾取一些样品，在硅胶板上进行点样。在层析缸中，倒入不超过硅胶板底部横线的的展开剂，展开剂配比为三氯甲烷：甲醇：水＝65：25：4(v/v/v)，在层析缸中中展开40min，至展开剂快要抵达至硅胶板距离顶部1cm处，拿出硅胶板置于通风橱中。挥发掉溶剂后，A板直接以茚三酮试剂(0.5％的茚三酮丙酮溶液)显色。B板放入耐高温的密封瓶内，瓶中预先以小杯盛约2mL浓盐酸，在110℃烘箱中熏蒸2h，进行原位酸水解，水解后放入通风橱中冷却，吹去盐酸，挥发干试剂后，最后同样以茚三酮试剂显色。
结果如图3所示，B板经原位酸水解后，出现了编号为⑤的A板不曾出现过的***的斑点，说明这个点所代表的成分在未酸解前不含有游离氨基，在酸解后带有游离氨基暴露出来经茚三酮显色。通常脂肽类物质为环型结构，不带有游离氨基，酸解后环肽结构被打开，游离氨基会暴露出来。因此贝莱斯芽孢杆菌ST7-6所产抑菌物质为脂肽，且为环状脂肽。
(2)脂肽合成基因的PCR检测
利用分子生物学手段对贝莱斯芽孢杆菌ST7-6中脂肽合成相关基因进行检测，从而进一步明确其是否为脂肽。采用上海生工生物工程有限公司的细菌基因组抽提试剂盒，提取贝莱斯芽孢杆菌ST7-6的基因组，扩增脂肽的合成基因，引物设计如表1所示。
表1：脂肽合成基因的引物设计
Figure BDA0003686482460000081
结果如图4所示。经PCR检测，基因sfp、fenB、ituA、bacD对应泳道，琼脂糖凝胶电泳检测出单一条带，且长度大小对应。说明芽孢杆菌含有相关脂肽合成的基因，即含有这些基因sfp、fenB、ituA、bacD编码的脂肽。
4、抗菌脂肽对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果
用牛津杯双层平板法检测贝莱斯芽孢杆菌ST7-6抗菌脂肽对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果。向培养皿中倒入10ml已融化的固体RCM培养基，待凝固后用无菌镊子夹取牛津杯放于平板上，另取RCM固体培养基于微波炉中溶化，待温度降到50℃左右时，按照5％(v/v)的比例加入痤疮丙酸杆菌的菌悬液，将含有痤疮丙酸杆菌的RCM已融化固体培养基约10mL，其中痤疮丙酸杆菌的菌悬液的菌浓为：108cfu/mL，倒入之前已含有10mL RCM培养基的培养皿中，形成固体培养基上层，得到牛津杯双层平板。待培养基凝固后，夹出牛津杯，形成样孔。在孔内加入实施例2的步骤2制备得到的贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽溶液100μL后，将牛津杯双层平板放入培养箱中，37℃厌氧培养48h，从培养箱中拿出牛津杯平板，用直尺测量微生物的抑菌圈直径。将上述抗菌脂肽采用牛津杯双层平板法测试其对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果。
结果如图5所示，贝莱斯芽孢杆菌ST7-6抗菌脂肽对痤疮丙酸杆菌的抑菌圈直径可以达到21.0mm。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis ST7-6抗菌脂肽的抑菌谱
本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株Bacillus velezensis ST7-6抗菌脂肽能够对真菌和***产生广谱的抑菌效果。为测试该菌株抗菌脂肽在食品工业和化妆品、护肤品方面的应用。测定该菌株抗菌脂肽对多种菌株包括米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、李斯特菌、微小根毛霉、伞状毛霉菌、Aspergillus costaricensis、Cladosporium subcinereum、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌的抑菌效果。
具体步骤如下：
1、抗菌脂肽对霉菌的抑制效果检测
(1)分别取出保存于-80℃冰箱的米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、微小根毛霉、伞状毛霉菌、Aspergillus costaricensis、Cladosporium subcinereum、菌株的甘油管，于室温下解冻20min。
(2)分别吸取100μL上述保存于甘油管的菌液，均匀涂布于PDA平板上。30℃培养72h，至真菌长满整个平板且生长状态良好。
(3)往平板中倒入10mL无菌生理盐水，用涂布棒刮取上述PDA平板，得到混合液，将混合液用无菌纱布过滤，得到上述真菌的孢子液。
(5)用血球计数板对上述真菌孢子液计数。调整孢子液的浓度为1×106cfu/mL。
取孢子液100μL均匀涂布至PDA平板。放置牛津杯于平板上，用移液枪吸取100μL实施例2的步骤2制备得到的贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽溶液加入牛津杯样孔中，30℃培养72h。
用直尺测量抑菌圈直径，取其平均值作为抗菌脂肽的抑菌圈直径。结果如表2所示：
表2：抗菌脂肽对霉菌的抑菌效果
Figure BDA0003686482460000091
2、抗菌脂肽对其他菌的抑菌效果
(1)取出保存于-80℃冰箱的白色念珠菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌的甘油管，于室温下解冻20min。
(2)用接种环分别蘸取菌液一环，将白色念珠菌划线至YM培养基；分别将金黄色葡萄球菌、李斯特菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌划线至LB培养基。白色念珠菌30℃培养48h、其他菌株37℃培养24h。
(3)向培养皿中倒入10mL已融化的对应菌株的固体培养基，待凝固后用无菌镊子夹取牛津杯放于平板上，另取固体培养基于微波炉中融化，病原菌按照1％(v/v)的比例加入温度冷却至50℃左右的固体培养基中。将含有病原菌的固体培养基(菌浓均为：108cfu/mL)10mL倒入凝固的固体培养基上层，待培养基凝固后，夹出牛津杯，形成样孔。
(4)在样孔内加入实施例2的步骤2制备得到的贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis ST7-6抗菌脂肽溶液100ul，按照对应菌株的培养温度分别培养(白色念珠菌30℃培养48h、其他菌株37℃培养24h)。
实验结束后，从培养箱中拿出牛津杯平板，用直尺测量抑菌圈直径，取其平均值作为抗菌脂肽的抑菌圈直径。结果如表3所示：
表3：抗菌脂肽对其他菌的抑菌效果
Figure BDA0003686482460000101
由表2和表3可以看出，贝莱斯芽孢杆菌ST7-6抗菌脂肽对不同菌株的抑菌效果都较好，证明其可以广泛的应用于食品和化妆品方面。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用
<130> BAA220595A
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1430
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cttcggcggc tggctccata aaggttacct caccgacttc gggtgttaca aactctcgtg 60
gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg 120
attactagcg attccagctt cacgcagtcg agttgcagac tgcgatccga actgagaaca 180
gatttgtggg attggcttaa cctcgcggtt tcgctgccct ttgttctgtc cattgtagca 240
cgtgtgtagc ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg 300
tttgtcaccg gcagtcacct tagagtgccc aactgaatgc tggcaactaa gatcaagggt 360
tgcgctcgtt gcgggactta acccaacatc tcacgacacg agctgacgac aaccatgcac 420
cacctgtcac tctgcccccg aaggggacgt cctatctcta ggattgtcag aggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgct cctcagcgtc 720
agttacagac cagagagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattcca ctctcctctt ctgcactcaa gttccccagt ttccaatgac 840
cctccccggt tgagccgggg gctttcacat cagacttaag aaaccgcctg cgagcccttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctggt taggtaccgt caaggtgccg ccctatttga acggcacttg 1020
ttcttcccta acaacagagc tttacgatcc gaaaaccttc atcactcacg cggcgttgct 1080
ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140
ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg tccatctgta agtggtagcc 1260
gaagccacct tttatgtctg aaccatgcgg ttcagacaac catccggtat tagccccggt 1320
ttcccggagt tatcccagtc ttacaggcag gttacccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380
ctaacatcag ggagcaagct cccatctgtc cgctcgactt gcatgtatag 1430

Claims (10)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62393，保藏日期为2022年4月18日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或其发酵液，或其提取物，或其代谢物。
3.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂；所述产品为食品、饲料添加剂、护肤品或化妆品。
4.一种抗菌药品，其特征在于，所述药品中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂。
5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂在抑制细菌或真菌中的应用，其特征在于，所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述细菌包括但不限于痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌；所述真菌包括但不限于白色念珠菌、米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、微小根毛霉、伞状毛霉菌、Aspergillus costaricensis、Cladosporiumsubcinereum。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的微生物菌剂在制备抑制细菌或真菌的产品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于药品、饲料添加剂、化妆品、护肤品。
9.一种抗菌脂肽，其特征在于，所述抗菌脂肽制备方法为：将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌接种至培养基中发酵制备得到发酵液，从发酵液中分离提取得到抗菌脂肽。
10.权利要求9所述的抗菌脂肽在抑制细菌或真菌中的应用，其特征在于，所述细菌包括但不限于痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、屎肠球菌、恶臭假单胞菌；所述真菌包括但不限于白色念珠菌、米曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、微小根毛霉、伞状毛霉菌、Aspergilluscostaricensis、Cladosporium subcinereum；所述应用不以疾病的诊断或治疗为目的。
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