CN113564074B - 一株粘细菌及其在制备抑菌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株粘细菌及其在制备抑菌药物中的应用。本发明采用大肠杆菌诱导法从菜地池塘沉积物中分离纯化出一株粘细菌Archangium violaceum 3‑1，经形态学和分子生物学鉴定(16S rRNA基因和gyrB基因)为紫色原囊菌。本发明所述紫色原囊菌的发酵上清液粗浸膏溶液能够抑制白色念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和植物病原真菌的生长，且抑菌活性大小表现出明显的剂量效应，显示出菌株3‑1广谱的抑菌活性。本发明的粘细菌3‑1在临床感染菌抑制药物开发和植物病原真菌生物防治菌剂、生物农药等方面具有较好的应用价值。

Description

一株粘细菌及其在制备抑菌药物中的应用

技术领域：

本发明属于微生物领域，具体涉及一株粘细菌及其在制备抑菌药物中的应用。

背景技术：

白色念珠菌(Candida albicans)为条件致病真菌，在人体免疫力低下或者导管等介入手术过程中，能够引发一系列黏膜感染和***性感染。在全球范围内，念珠菌引发的感染病症每年约4000万例，其中白色念珠菌是最常见也是最致命的，约占念珠菌感染病例的50-70％，总死亡率为43％，已成为公共卫生***和医疗保健领域亟待解决的重要问题。在感染者体内，白色念珠菌大多以生物被膜形式存在，不仅增强其耐药性，甚至可以使其免受宿主免疫***的攻击，这进一步增加了其防治难度。

各类抗菌药物的普遍使用促使病原菌的耐药性不断增强，尤其是多重耐药菌株，严重影响临床治疗的进展。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,MRSA)作为多重耐药菌株的一种，是目前医院感染的重要病原菌，能够导致血液、下呼吸道、皮肤等人体各类感染性疾病的发生，临床观察发现其感染率和致死率正逐年上升。这一方面加大了临床上对耐药菌感染治疗的难度，另一方面也加大了新抗生素的开发难度。研究开发具有新类型化学结构、新作用机制或者新作用靶点的抗生素与抗菌药物是治疗耐药菌感染的有效途径。

另一方面，丝状真菌由坚硬的含有几丁质的细胞壁包被，显著不同于细菌和酵母菌，因而药物靶点有差异。霉菌不仅是临床感染的重要病原真菌，也是引起粮食作物病害最重要的病原，引起农业的巨大经济损失。植物病原真菌在土壤中的聚集是土传病害及连作障碍发生的重要因素，引起的病害控制难度大。此外，几乎每种作物都有几种至几十种真菌病害，常导致单一防治手段的失败。因此，广谱抗菌药物对植物病害控制具有重要意义。

粘细菌作为一种新型药源微生物，能够产生丰富多样、结构新颖、作用机制独特的次级代谢产物，目前已经成为继放线菌之后的第二大抗生素产生菌。粘细菌是一种捕食性细菌，能够杀死、裂解包括细菌、真菌在内的被捕食菌。在粘细菌的捕食过程中，次级代谢产物起到重要作用。粘细菌宽泛的捕食谱意味着可将其用于多种病原菌的抑制。然而，粘细菌次级代谢产物的开发利用远远落后于放线菌。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种能产生抑菌物质的粘细菌Archangiumviolaceum 3-1，于2021年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61803。

本发明的第二个目的是提供粘细菌Archangium violaceum 3-1、或其培养物、菌液、发酵液或发酵液的萃取物在制备抑菌药物中的应用。

所述的抑菌药物是抑制白色念珠菌Candida albicans、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4的药物。

所述的粘细菌Archangium violaceum 3-1在制备抑菌药物中的应用是培养粘细菌Archangium violaceum 3-1获得发酵液，然后对发酵液用甲醇浸提，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏，用于制备抑菌药物。

优选，是在培养粘细菌Archangium violaceum 3-1的发酵液中加入大孔树脂，然后用甲醇浸泡大孔树脂，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏，用于制备抑菌药物。

本发明的第三个目的是提供一种抑菌药物，其含有粘细菌Archangium violaceum3-1、或其培养物、菌液、发酵液或发酵液的萃取物作为活性成分。

所述的发酵液的提取物是培养粘细菌Archangium violaceum 3-1获得发酵液，然后对发酵液用甲醇浸提，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏。

优选，是在培养粘细菌Archangium violaceum 3-1的发酵液中加入大孔树脂，然后用甲醇浸泡大孔树脂，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏。

本发明采用大肠杆菌诱导法从菜地池塘沉积物中分离纯化出一株粘细菌Archangium violaceum 3-1，经形态学和分子生物学鉴定(16S rRNA基因和gyrB基因)为紫色原囊菌。本发明所述紫色原囊菌的发酵上清液粗浸膏溶液能够抑制白色念珠菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和植物病原真菌的生长，且抑菌活性大小表现出明显的剂量效应，显示出菌株3-1广谱的抑菌活性。本发明的粘细菌3-1在临床感染菌抑制药物开发和植物病原真菌生物防治菌剂、生物农药等方面具有较好的应用价值。

粘细菌Archangium violaceum 3-1于2021年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61803。

附图说明：

图1是粘细菌Archangium violaceum 3-1形态特征；A：A.violaceum 3-1在VY/2固体培养基生长3天的菌落形态；B：A.violaceum 3-1在VY/2固体培养基生长10天形成大量成熟子实体的形态；C：体视显微镜下观察A.violaceum 3-1子实体形态；D：A.violaceum 3-1杆状营养细胞结晶紫染色；E：A.violaceum 3-1杆状营养细胞和球形粘孢子结晶紫染色。

图2是粘细菌菌株Archangium violaceum 3-1发酵上清液粗浸膏溶液对白色念珠菌Candida albicans SC5314的抑制。

图3是粘细菌菌株Archangium violaceum 3-1发酵上清液粗浸膏溶液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus GDMCC 1.1263的抑制。

图4是粘细菌菌株Archangium violaceum 3-1发酵上清液粗浸膏溶液对丝状植物病原真菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4的抑制。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：菌株的分离与纯化

1.1样品采集和预处理

从汕头市澄海区东里镇塘西村油菜地池塘采集底泥沉积物，滤去水分后，取一部分置于室温下自然风干；另取一部分新鲜沉积物样品按1:10(v/v)加入无菌去离子水震荡处理1h，离心取上清，并用0.22μm滤膜过滤，制备浸提液。利用粘细菌能够产生抗逆性子实体的特征，通过风干处理以抑制其他细菌、真菌和原生生物的干扰。

1.2粘细菌菌株3-1的分离、纯化与保藏

取风干的底泥样品10g，加入15mL 100μg ml^-1过滤除菌的放线菌酮，浸泡过夜后离心弃去上清。用大肠杆菌为底物的水琼脂培养基(即WCX培养基，含有CaCl₂·2H₂O 1g/L和琼脂15g/L，余量为水；pH 7.2)分离粘细菌，将大肠杆菌菌体在WCX培养基表面画“田”字，在“田”字的四个空格中分别接种黄豆粒大小的沉积物样品。将上述分离平板置于30℃培养，培养7天后开始每天用体视显微镜观察并分离挑取子实体进行纯化(VY/2培养基，含有酵母5g/L，CaCl₂·2H₂O 1g/L，VB₁₂ 0.5mg/L和琼脂15g/L，余量为水；pH 7.2)。挑取将子实体或者菌落边缘用VY/2反复转接，直至肉眼观察到纯菌株。得到的纯菌株接种于营养肉汤培养基(含有蛋白胨10g/L，牛肉浸粉3g/L和NaCl 5g/L，余量为水；pH 7.2)，30℃过夜培养验纯，若培养液澄清表明该粘细菌为纯菌株。已纯化的粘细菌菌株转接至VY/2固体培养基上，待子实体成熟后刮下用于甘油种和冻干种的制作，甘油种置于-80℃保藏，冻干种置于4℃保藏。由此获得菌株3-1。

实施例2：菌株Archangium violaceum 3-1的鉴定

2.1菌株的形态和培养特征观察

菌株3-1在VY/2固体培养基上表现为滑动扩展的透明状菌落，整体菌落呈放射状；在VY/2固体培养基上生长5天左右开始观察到聚集体的形成，成熟的子实体呈球形、深紫褐色。革兰氏染色呈阴性(图1)。以上形态学特征说明该菌株符合粘细菌的基本特征。

2.2基于16S rRNA基因和gyrB基因序列的菌株鉴定

刮取在VY/2固体培养基上生长3天的新鲜菌体3-1，加入少量无菌水，置于90℃处理10min，离心取上清作为PCR反应的模板。PCR反应体系(25μL):buffer 12.5μL，上下游引物各1μL，模板1μL，无菌去离子水9.5μL。反应程序：95℃5min,95℃30s,56℃30s,72℃90s,30个循环，72℃10min。PCR产物进行琼脂糖电泳确定无误后交由金唯智生物科技有限公司测序。

将16S rRNA基因和gyrB基因序列分别在EzBioCloud(https://www.ezbiocloud.net/)上进行BLAST同源性比对。结果显示菌株3-1与模式菌株Archangiumviolaceum DSM 14727具有最高相似性，16S rRNA基因和gyrB基因序列相似性分别为99.28％和98.16％。16S rRNA基因和gyrB基因序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

通过以上形态学和分子生物学鉴定，将该菌株鉴定为Archangium violaceum，编号为3-1，于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编：510070，保藏编号：GDMCC No：61803。

实施例3：菌株Archangium violaceum 3-1液体发酵和发酵上清液粗浸膏制备

发酵培养基为MD1液体(按质量分数计，酪蛋白胨0.6％，可溶性淀粉0.2％，MgSO₄·7H₂O0.2％，CaCl₂·2H₂O 0.04％，pH 7.2)，接种前加入2％的大孔树脂XAD-16，按照体积比2％的接种量接种Archangium violaceum 3-1种子液。140rpm，30℃震荡培养7d，用纱布过滤收集树脂，加入2倍体积的甲醇置于30℃震荡浸提1h，过滤收集甲醇；重复浸提过程3-4次直至甲醇无色。合并收集的甲醇于旋转蒸发仪上35℃，40r min^-1减压蒸干。发酵4.5L该菌株共获得粗浸膏2.5873g。用少量二甲基亚砜(DSMO)溶解上述粗浸膏，并用无菌去离子水稀释成浓度为100、50、25、12.5、6.25和3.125mg ml^-1的粗浸膏溶液。

实施例4：菌株Archangium violaceum 3-1发酵上清液粗浸膏溶液对白色念珠菌Candida albicans SC5314的抑制

刮取在YPD固体培养基(葡萄糖20g/L，酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，琼脂2％)上过夜培养的C.albicans SC5314菌体，加入无菌去离子水制成菌悬液，用棉签蘸取菌悬液涂布于新鲜的YPD固体培养基上。待平板晾干后铺上3张直径为0.5cm的无菌滤纸片，在每张滤纸片上加入20μl各浓度的粗浸膏溶液。同时分别设置遗传霉素G418(100μg/ml)和DSMO水溶液作为阳性和阴性对照。待滤纸晾干后置于30℃培养，12h后观察并测量抑菌圈大小。结果表明菌株3-1发酵液提取物明显抑制C.albicans SC5314的生长，且抑制作用具有剂量效应。当发酵液浸膏浓度为100、50、25、12.5、6.25和3.125mg ml^-1时，抑菌圈直径分别为29.3mm、24.6mm、22.5mm、21mm、15.8mm和12.6mm(图2)。

实施例5：菌株Archangium violaceum 3-1发酵上清粗浸膏溶液对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus GDMCC 1.1263的抑制

刮取在TSA固体培养基(胰蛋白胨15g/L，大豆胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂1.5％，pH7.3)上过夜培养的S.aureus GDMCC 1.1263菌体，加入无菌去离子水制成菌悬液，用棉签蘸取菌悬液涂布于新鲜的TSA固体培养基上。待平板晾干后铺上3张直径为0.5cm的无菌滤纸片，在每张滤纸片上加入20μl各浓度的粗浸膏溶液。同时分别设置万古霉素(100μg/ml)和DSMO水溶液作为阳性和阴性对照。待滤纸晾干后置于30℃培养，12h后观察并测量抑菌圈大小。结果表明较高浓度的菌株3-1发酵液提取物明显抑制测试MRSA菌的生长，且抑制作用具有剂量效应。当发酵液浸膏浓度为100、50、25和12.5mg ml^-1时，抑菌圈直径分别为8.2mm、10.5mm、12.6mm和13.5mm(图3)。

实施例6：菌株Archangium violaceum 3-1发酵上清粗浸膏溶液对丝状植物病原真菌尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4的抑制

挑取F.oxysporum菌块接种于PDA固体培养基(去皮马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂2％)中央，待真菌菌斑直径达到2cm时，在十字交叉方向距菌落边缘1cm处用打孔器打直径为0.5mm的4个孔，每个孔中加入20μL不同浓度粗浸膏溶液，同时分别设置遗传霉素G418(100μg/ml)和DSMO水溶液作为阳性和阴性对照。置于30℃培养，12h后观察并测量抑菌圈大小，计算抑制率。结果表明，3-1发酵液提取物能够抑制丝状真菌尖孢镰刀菌的生长，抑制作用具有剂量效应。当发酵液浸膏浓度为100、50、25、12.5、6.25和3.125mg ml^-1时，抑制率分别为14.1％、23.3％、29.4％、35.6％、41.7％和44.8％(图4)。

序列表

<110> 广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）

<120> 一株粘细菌及其在制备抑菌药物中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1395

<212> DNA

<213> 粘细菌3-1(Archangium violaceum )

<400> 1

agtcgagcgc gaatggagca atcctagtag agcggcgcac gggtgcgtaa cacgtggata 60

atctgcctgg gtgtctggga taaccagtcg aaagattggc taataccgga taagcccccg 120

ggagcttcgg ctcctgaggg aaaaggtggc ctctgtatac aagctatcac atccagatga 180

gtccgcggcc catcagctag ttggcggggt aatggcccac caaggcgacg acgggtagct 240

ggtctgagag gacgatcagc cacactggaa ctgagacacg gtccagactc ctacgggagg 300

cagcagtggg gaattttgcg caatgggcga aagcctgacg cagcaacgcc gcgtgtgtga 360

tgaaggtctt cggattgtaa agcactttcg accgggacga aaacccctag cctaacacgc 420

tggggcttga cggtaccggg agaagaagca ccggctaact ctgtgccagc agccgcggta 480

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<210> 2

<211> 979

<212> DNA

<213> 粘细菌3-1(Archangium violaceum )

<400> 2

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aaggtgtacg agcagtcgta cgcccgcggc gtgtccaatg gctcgccggc cctcgtgggc 120

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aaccaggcca cctcccgct 979

Claims (7)

1.紫色原囊菌（Archangium violaceum）3-1，保藏编号：GDMCC No：61803。

2.权利要求1所述的紫色原囊菌、或其培养物、菌液、发酵液或发酵液的甲醇浸提液在制备抑菌药物中的应用，所述的抑菌药物是抑制白色念珠菌Candida albicans、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus或尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum f. sp.cubense race 4的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的紫色原囊菌3-1在制备抑菌药物中的应用是培养紫色原囊菌3-1获得发酵液，然后对发酵液用甲醇浸提，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏，用于制备抑菌药物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，是在培养紫色原囊菌3-1的发酵液中加入大孔树脂，然后用甲醇浸泡大孔树脂，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏，用于制备抑菌药物。

5.一种抑菌药物，其特征在于，含有权利要求1所述的紫色原囊菌3-1、或其培养物、菌液、发酵液或发酵液的甲醇浸提液作为活性成分。

6.根据权利要求5所述的抑菌药物，其特征在于，所述的发酵液的提取物是培养紫色原囊菌3-1获得发酵液，然后对发酵液用甲醇浸提，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏。

7.根据权利要求6所述的抑菌药物，其特征在于，是在培养紫色原囊菌3-1的发酵液中加入大孔树脂，然后用甲醇浸泡大孔树脂，甲醇浸提液经浓缩干燥后获得浸膏。

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