CN116082470A - 一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用。本发明所述的抗菌脂肽由保藏编号为CCTCC NO：M 20211570的贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis BVQ121经发酵、乳化构建O/W乳化体系和喷干制备得到。BVQ121菌株对于常见的食源性致病菌表现出了有良好的抑制效果。本发明在制备抗菌脂肽时，改进了制备方法，采用乳化体系与喷干技术相结合的手段，提高了AMPs水溶性的同时解决了有机溶剂的毒性问题，并且增加了AMPs复溶物的抑菌活性。
Description
技术领域
本发明属于食品生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用。
背景技术
抗菌脂肽(Antimicrobial peptides，AMPs)具有抗菌谱广、作用迅速、不易产生耐药性等优点，在医药、化妆品、食品工业中具有广阔的应用前景。AMPs是由不同氨基酸组成的小分子蛋白质，具有分子量小、免疫原性低、机理特殊、易体内降解、不易产生耐药性等优点，这些优点赋予了抗菌脂肽在食品工业中的巨大应用潜力。芽孢杆菌产AMPs种类多、功能多、原料易获取、生产周期短、易于规模化发酵生产等突出优势；同时，AMPs结构稳定，在高温和酸性的环境也仍然保持活性；此外，AMPs还具有良好的广谱抑菌活性，可以抑制多种食源性致病菌，且对病毒、支原体等也具有显著的抑制效果。更为重要的是，与化学表面活性剂相比，AMPs具有低毒、易生物降解、良好的环境相容性等优点，在食品原料安全控制、食品加工环节、食品防腐保鲜、食品活性包装等方面可替代化学表面活性剂，具有很大的应用潜力。
AMPs具有的成本低、无毒害、周期短等明显优点，加快微生物抗菌脂肽的研究必将成为主流。当前对贝莱斯芽孢杆菌AMPs的研究主要集中在植物类抗真菌活性，比如贝莱斯芽孢杆菌D61-A对水稻根际土壤细菌群落结构的影响；贝莱斯芽孢杆菌对柑橘病原菌皮落青霉的生防探索等。另一方面，AMPs多采用酸沉淀等提取方法，但由于其疏水脂肪烃链的化学结构，经过沉淀烘干之后的AMPs很难复溶于水，大多采用甲醇或者乙腈等有毒性的有机溶剂复溶，这一缺点大大限制了AMPs提取物在食品方面的应用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽。
本发明还要解决的技术问题是，提供上述抗菌脂肽的制备方法。
本发明最后要解决的技术问题是，提供上述抗菌脂肽在抑制食品受食源性致病菌侵染中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽，其特征在于，所述的抗菌脂肽由贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis BVQ121 CCTCC NO：M 20211570经发酵、乳化构建O/W乳化体系和喷干制备得到。
其中，所述的贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽的分子量在1-3Kda，产量为1.527±0.03g/L。
上述贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽的制备方法，包括如下步骤：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis BVQ121CCTCC NO：M 20211570菌种活化；
(2)将步骤(1)活化后的菌种接种到Landy改进培养基中发酵培养获得发酵液后离心保留上清液；
(3)调节步骤(2)的上清液pH，低温过夜后，低温离心，弃上清液收集沉淀；
(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入乳化液，震荡混匀后获得O/W乳化体系；
(5)将步骤(4)获得的乳化体系进行喷干，制备得到抗菌脂肽粉末。
其中，步骤(2)中，所述的接种，其接种量为1-3％v/v。优选的，接种量为1.5％v/v。
其中，步骤(2)中，所述的发酵培养，其条件为：37℃摇床100-300r/min发酵24-48h。优选的条件为：37℃，摇床200r/min，发酵48h。
其中，步骤(2)中，所述的Landy改进培养基，其配方为：葡萄糖20.0g/L，谷氨酸钠5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，FeSO40.15mg/L，MnSO4 0.5mg/L，CuSO4 0.16mg/L。
其中，步骤(3)中，所述的pH，调节pH至2.0-4.0；所述的低温为4℃；所述的离心，其条件为6000-9000r/min，离心5-10min。优选的pH为4.0，离心条件为9000r/min、4℃离心10min。
其中，步骤(4)中，所述的乳化液，其加入量按照使得脂肽含量达到10-20mg/mL的浓度比添加。优选的加入量为：按照使得脂肽含量分别达到10mg/mL、20mg/mL的浓度比添加。
其中，步骤(4)中，所述的乳化液为甘油和水的混合溶液，其中水的体积为甘油的4-6倍。优选的，水的体积为甘油的4倍。
其中，步骤(5)中，所述的喷干，其工艺条件为：使用低温喷雾干燥机，连续80℃低温喷雾干燥，进料流量为40-60mL/min，进料温度20℃，出口温度60℃。
上述贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽在抑制食品受食源性致病菌侵染中的应用也在本发明所保护的范围之内。
其中，所述的食源性致病菌为鮰鱼爱德华氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的任意一种。优选的为沙门氏菌。
具体的，利用贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽制备得到的O/W乳化体系，乳液均一呈白色浑浊液体，证明贝莱斯芽孢杆菌脂肽充当乳化剂取得了良好成效，可作为食品乳化剂。
具体的，贝莱斯芽孢杆菌BVQ121发酵液对致病菌(鮰鱼爱德华氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌)增殖具有明显的抑菌效果，对比抑菌圈直径的大小发现，发酵液抑菌效果与剂量呈正相关，相同剂量下的发酵液对沙门氏菌的抑制效果最为显著，抑菌圈直径最高在添加100μL发酵液时达到了26.50mm，对大肠杆菌和鮰鱼爱德华氏菌的抑菌圈分别为24.5mm和18.0mm
具体的，继续采用沙门氏菌作为指示菌进行评价实验，对比抑菌圈平均值直径的大小可以发现，添加了脂肽的甘油乳液抑菌效果明显，20mg/mL的贝莱斯芽孢杆菌脂肽乳液抑菌效果较10mg/mL的贝莱斯芽孢杆菌脂肽乳液抑菌效果较优。其中添加100μLO/W乳化体系(脂肽/油相＝20mg/mL)的抑菌圈直径最高，达到了(17.85±2.33)mm，以往用甲醇复溶的脂肽，抑菌圈通常为14.20±1.65mm，相较于甲醇复溶，甘油乳化后的脂肽复溶物抑菌效果提升了25％左右。这些数据证明贝莱斯芽孢杆菌表面活性素作为乳化剂应用于乳化体系中提升其抑菌效果。
具体的，利用高效液相色谱，根据从BVQ121提取的粗脂肽样品在HPLC上的出峰保留时间和标准品的对比来看，该菌株抗菌肽的保留时间在7-20分钟之间。抗菌脂肽样品在7-10分钟，12-16分钟和16-20分钟的保留时间与标准品一致，可以证实该抗菌脂肽主要由Surfactin的同系物构成，证实了BVQ121发酵产物成分，该Surfactin的同系物已被验证了对几类食源性致病菌有抑菌效果。
具体的，通过MALDI-TOF-MS质谱分析，结合查阅文献并对照图表，发现本发明得到的抗菌肽的主要成分为C13-C16 Iturin、C12-C15 Surfactin和C15-C23 Fengycin以及三种抗菌肽的部分同系物，每种成分在食品加工环节种都有相应的应用。
一株产抗菌脂肽的贝莱斯芽孢杆菌，其中，所述的贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，菌株号为BVQ121，已于2021年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211570。
有益效果：
(1)BVQ121菌株表现出对于常见的食源性致病菌有良好的抑制效果，在抑菌谱上有所拓展，具有一定的研究价值。
(2)本发明在提取抗菌脂肽时，改进了制备方法，采用乳化体系与喷干技术相结合的手段，提高了AMPs水溶性的同时解决了有机溶剂的毒性问题，并且增加了AMPs复溶物的抑菌活性。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌形态鉴定图。
图2为本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌高密度发酵液抑制沙门氏菌效果图。注：A.鮰鱼爱德华氏菌，B.大肠杆菌，C.沙门氏菌；左为50μL贝莱斯芽孢杆菌发酵液，右为100μL贝莱斯芽孢杆菌发酵液。
图3为本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌高密度发酵液中提取抗菌肽的乳化体系以及乳化剂的抑菌结果图。注：1为甘油/水乳化液，2为O/W乳化体系(脂肽/油相＝10mg/mL)，3为O/W乳化体系(脂肽/油相＝20mg/mL)。A为空白组，B为甘油/水乳化液，C为O/W乳化体系(脂肽/油相＝10mg/mL)，D为O/W乳化体系(脂肽/油相＝20mg/mL)。
图4为本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌高密度发酵液中提取抗菌肽的高效液相色谱图；
图5为本发明提供的一种贝莱斯芽孢杆菌高密度发酵液中提取抗菌肽的质谱图；
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1菌种鉴定
本专利的贝莱斯芽孢杆菌于2021年10月30日从江苏省南京市南京工业大学实验室制备的豆豉渣中分离获得，采用分子生物学的方法对贝莱斯芽孢杆菌菌株进行鉴定，测得其16S rRNA序列如SEQ ID NO.1所示，在GenBank核酸数据库中进行比对，通过序列比对确认为贝莱斯芽孢杆菌，命名为贝莱斯芽孢杆菌BVQ121，并于2021年12月8日在中国典型培养物保藏中心登记保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 20211570。
贝莱斯芽孢杆菌BVQ121菌落呈现乳白色，表面光滑，单菌落多为圆形(图1)；耐高温、耐酸、耐消化，在110℃高温处理1h后仍保持活性，在pH＝2.0的条件下仍保持活性，经历过模拟胃消化后仍保持活性。
实施例2发酵及发酵液抑菌效果
1、平板制备
取蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，琼脂10.0g，酵母粉5.0g，蒸馏水定容至1.0L，搅拌均匀后放入灭菌锅121℃，灭菌20min。待其冷却至70℃左右后取出，倾倒平板，放至在超净台内冷却凝固。
2、BVQ121菌体活化
LB液体培养基：蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，酵母粉5.0g，蒸馏水定容至1.0L，搅拌均匀后放入灭菌锅121℃，灭菌20min。待其冷却后用接种环接种到LB液体培养基中进行菌株活化，活化条件为温度37℃，摇床200r/min，活化时间24h。
3、BVQ121发酵液处理
Landy改进培养基：葡萄糖20.0g，谷氨酸钠5.0g，酵母提取物1.0g，MgSO4 0.5g，KCl 0.5g，KH2PO4 1.0g，FeSO4 0.15mg，MnSO4 0.5mg，CuSO4 0.16mg，蒸馏水定容至1.0L，搅拌均匀后放入灭菌锅115℃，灭菌25min。待其冷却后接种1.5％v/v的活化菌液进行发酵，发酵条件：温度37℃，摇床200r/min，发酵时间48h。发酵完毕后9000r/min、4℃离心10min去除菌体沉淀，保留上清备用。
4、牛津杯抑菌圈实验
取出制备好的平板，分别向其中加入50μL不同的指示菌菌液(大肠杆菌，沙门氏菌、鮰鱼爱德华氏菌)，用一次性涂布棒涂布均匀，每种指示菌涂布一块平板。用镊子取出两个已经灭完菌的牛津杯，放置在一个平板的两个区域内，以保证抑菌圈结果不会相互重叠。设置一组空白实验，向其余三块平板的两个区域中用移液枪分别滴加50、100μL处理后的发酵液。盖上培养皿的盖子，放入指示菌相应37℃的培养箱内培养12h，之后取出培养皿，打开观察并测量抑菌圈大小(mm)、拍照记录，实验重复三次，取平均值。
结果：从图2可以看到，贝莱斯芽孢杆菌BVQ121发酵液对几种致病菌增殖具有明显的抑菌效果，对比抑菌圈直径的大小发现，发酵液抑菌效果与剂量呈正相关，相同剂量下的发酵液对沙门氏菌的抑制效果最为显著，抑菌圈直径最高在添加100μL发酵液时达到了26.50mm，对大肠杆菌和鮰鱼爱德华氏菌的抑菌圈分别为24.5mm和18.0mm。
实施例3发酵液中脂肽生产技术及产品抑菌效果评价
在灭完菌的Landy培养基里，按照1.5％v/v接种量接种活化后的菌液，200r/min，37℃下培养48h制备发酵液。将发酵完毕后的发酵液9000r/min，4℃离心5min，取上层清夜备用。
将上层清液用HCl调节pH至4.0，低温过夜沉淀，9000r/min，4℃离心10min。离心弃去上层清液，收集黄色沉淀，将得到的沉淀加入制备好的乳化体系中进行溶解，之后再进行喷干工艺。
其中，O/W乳化体系的制备方法为：取甘油和水(水的体积为甘油的4倍)充分混合制成乳化液，再分别按照脂肽含量10mg/mL、20mg/mL的比例构建脂肽与乳化液的混合溶液，加入转子进行震荡混匀，24h后获得混合较均匀的乳化体系，保存待用。
其中，喷干工艺的条件为：使用低温喷雾干燥机，连续80℃低温喷雾干燥，进料流量为10％，进料温度20℃，出口温度60℃。
将预先制备好的平板划分成四个区域，并取用沙门氏菌悬液50μL作为指示菌液滴加于PDA平板上，用涂布棒将其涂布均匀。取出灭菌牛津杯放置在平板上的四个区域，设置只添加100μL的LB培养基为空白对照组，其余三个牛津杯中分别滴加配置好的无脂肽甘油乳化液与添加了10mg/mL、20mg/mL脂肽的O/W乳化体系，加样体积依次100μL。随后将平板置于37℃培养箱内培养12h后，观察并测量抑菌圈大小，重复三次，取平均值。
发明者查阅相关文献发现，芽孢杆菌提取的抗菌脂肽能够承受120℃高温长达2-3个小时，对抑菌效果没有显著性的降低影响，因此本发明脂肽生产技术中，最后一步的喷干工艺不会对产品的抗菌性能有所影响。
结果：将上述贝莱斯菌株发酵培养，采用酸沉淀法提取抗菌脂肽，产量为1.527±0.03g/L，抑菌效果显著。将得到的沉淀加入制备好的乳化体系中进行溶解，之后再进行喷干工艺，分子量在1-3Kda。由甘油制备的O/W乳化体系如图3所示。乳液均一呈白色浑浊液体，证明贝莱斯芽孢杆菌脂肽充当乳化剂取得了良好成效。继续采用沙门氏菌作为指示菌进行评价实验，实验结果如图3所示，对比抑菌圈平均值直径的大小可以发现，添加了脂肽的甘油乳液抑菌效果明显，20mg/mL的贝莱斯芽孢杆菌脂肽乳液抑菌效果较10mg/mL的贝莱斯芽孢杆菌脂肽乳液抑菌效果较优。其中添加100μL O/W乳化体系(脂肽/油相＝20mg/mL)的抑菌圈直径最高，达到了(17.85±2.33)mm，以往用甲醇复溶的脂肽，抑菌圈通常为14.20±1.65mm，相较于甲醇复溶，甘油乳化后的脂肽复溶物抑菌效果提升了25％左右，并且在提高了AMPs水溶性的同时解决了有机溶剂的毒性问题。这些数据证明贝莱斯芽孢杆菌脂肽作为乳化剂应用于O/W乳化体系中可提升其抑菌效果。
实施例4发酵液脂肽的成分鉴定
1、高效液相色谱分析
采用安捷伦高效液相色谱仪1260和ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱(AnalyticalC18，5um，150×4.6mm)进行分析。样品与标准品均溶于20％乙腈水溶液，流动相A为乙腈(含0.1％的三氟乙酸)，流动相B为超纯水(含0.1％的三氟乙酸)，流动相A：B的比例为8：2，流速为1mL/min，检测波长为214nm，样品浓度为5mg/mL，进样体积为60μL。
其分析如图4。
结果：根据从BVQ121提取的粗脂肽样品在HPLC上的出峰保留时间和标准品的对比来看，该菌株抗菌肽的保留时间在7-20分钟之间。抗菌脂肽样品在7-10分钟，12-16分钟和16-20分钟的保留时间与标准品一致，可以证实该抗菌脂肽主要由Surfactin的同系物构成，证实了BVQ121发酵产物成分，该Surfactin的同系物已被验证了对几类食源性致病菌有抑菌效果。
2、MALDI-TOF-MS质谱分析
质谱检测条件：抗菌肽10mg，甲醇溶剂，正离子检测，DHB基质。使用UltrafleXtreme MALDI-TOF质谱仪(Bruker Daltonics)在反射正离子模式下进行MALDI仪器质谱分析。用智能束激光辐照产生的离子在100～1700Da的质量范围内获得了质谱，照射频率为1000Hz，PIE为120ns，透镜电压为7kV。第一离子源电压为20kV，第二离子源电压为17.65kV。每个光谱由平均1000次激光发射产生，并且激光辐照度被设置为50-55％。使用FlexAnalysis软件(version：3.3，Bruker)处理所有质谱。
其分析如图5。
结果：查阅文献并对照图表，发现本发明得到的抗菌肽的主要成分为C13-C16Iturin、C12-C15 Surfactin和C15-C23 Fengycin以及三种抗菌肽的部分同系物，每种成分在食品加工环节种都有相应的应用。
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽，其特征在于，所述的抗菌脂肽由贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis BVQ121 CCTCC NO：M 20211570经发酵、乳化构建O/W乳化体系和喷干制备得到，所述的贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽的分子量在1-3Kda。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis CCTCC NO：M 20211570BVQ121菌种活化；
(2)将步骤(1)活化后的菌种接种到Landy改进培养基中发酵培养获得发酵液后离心保留上清液；
(3)调节步骤(2)的上清液pH，低温过夜后，低温离心，弃上清液收集沉淀；
(4)向步骤(3)得到的沉淀中加入乳化液，震荡混匀后获得O/W乳化体系；
(5)将步骤(4)获得的乳化体系进行喷干，制备得到抗菌脂肽粉末。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的接种，其接种量为1-3％v/v；所述的发酵培养，其条件为：37℃摇床100-300r/min发酵24-48h；所述的Landy改进培养基，其配方为：葡萄糖20.0g/L，谷氨酸钠5.0g/L，酵母提取物1.0g/L，MgSO4 0.5g/L，KCl 0.5g/L，KH2PO4 1.0g/L，FeSO4 0.15mg/L，MnSO4 0.5mg/L，CuSO4 0.16mg/L。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的pH，调节pH至2.0-4.0；所述的低温为4℃；所述的离心，其条件为6000-9000r/min，离心5-10min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的乳化液，其加入量按照使得脂肽含量达到10-20mg/mL的浓度比添加。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的乳化液为甘油和水的混合溶液，其中水的体积为甘油的4-6倍。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的喷干，其工艺条件为：使用低温喷雾干燥机，连续80℃低温喷雾干燥，进料流量为40-60mL/min，进料温度20℃，出口温度60℃。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌抗菌脂肽在抑制食品受食源性致病菌侵染中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的食源性致病菌为鮰鱼爱德华氏菌、大肠杆菌、沙门氏菌中的任意一种。
10.一株产抗菌脂肽的贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，所述的贝莱斯芽孢杆菌，其分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis，菌株号为BVQ121，已于2021年12月8日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211570。
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| CN114231437A (zh) * | 2021-11-08 | 2022-03-25 | 南京农业大学 | 一株贝莱斯芽胞杆菌dmw1菌株及其应用 |
| CN115044505A (zh) * | 2022-06-09 | 2022-09-13 | 江南大学 | 一株贝莱斯芽孢杆菌产抗菌脂肽及其在化妆品和食品的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
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| 赵鹏鹏 等: "培养基组成对贝莱斯芽孢杆菌产抑真菌成分的影响", 《食品与发酵工业》, pages 147 - 151 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116082470B (zh) | 2023-08-15 |
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