ES2253813T3 - Induccion de esterilidad masculina en plantas por la expresion de niveles elevados de estreptavidina. - Google Patents
Induccion de esterilidad masculina en plantas por la expresion de niveles elevados de estreptavidina.Info
- Publication number
- ES2253813T3 ES2253813T3 ES98918556T ES98918556T ES2253813T3 ES 2253813 T3 ES2253813 T3 ES 2253813T3 ES 98918556 T ES98918556 T ES 98918556T ES 98918556 T ES98918556 T ES 98918556T ES 2253813 T3 ES2253813 T3 ES 2253813T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- gene
- sequence
- plant
- promoter
- dna molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/465—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from birds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8231—Male-specific, e.g. anther, tapetum, pollen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
- C12N15/8289—Male sterility
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Una molécula de DNA aislada que comprende un promotor específico de anteras unido operativamente a una secuencia nucleotídica que codifica estreptavidina.
Description
Inducción de esterilidad masculina en plantas por
la expresión de niveles elevados de estreptavidina.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para controlar la fertilidad de plantas usando
moléculas de DNA que codifican estreptavidina. En particular, esta
invención se refiere a procedimientos para producir plantas con
esterilidad masculina transgénicas las cuales expresan
estreptavidina. Además, esta invención se refiere a procedimientos
para restaurar la fertilidad masculina en la progenie de plantas con
esterilidad masculina. La invención se refiere también a
procedimientos para la producción de semillas híbridas, en
particular, semillas híbridas con uno o más rasgos deseados del
grano o la semilla, usando plantas con esterilidad masculina las
cuales expresan estreptavidina.
El control de la fertilidad del polen es esencial
en producción de cosechas híbridas. Véase, por ejemplo, J.M.
Poehlman, BREEDING FIELD CROPS, 3ª edición (Van Nostrand and
Reinhold, Nueva York, NY, 1987). En la producción de maíz híbrido,
por ejemplo, el control de la fertilidad del polen se lleva a cabo
típicamente eliminando físicamente la inflorescencia masculina, o
penacho, antes de la emisión polínica. La eliminación manual del
penacho es un trabajo altamente intensivo. Aunque la eliminación
mecánica del penacho es un trabajo menos intensivo que la
eliminación manual del penacho, es menos fiable y requiere el examen
subsiguiente de la cosecha y comúnmente, es de refuerzo de la
eliminación manual del penacho. Ambos procedimientos de eliminación
del penacho causan una pérdida de la producción parental
femenina.
La mayoría de las plantas de cultivo principales
de interés, sin embargo, tienen tanto órganos masculinos como
femeninos funcionales en la misma flor; por lo tanto, la
emasculación no es un procedimiento simple. Mientras que es posible
eliminar manualmente los órganos formadores de polen antes de que el
polen se emita, esta forma de producción híbrida es extremadamente
intensiva y cara como tarea.
La fertilidad del polen también se puede
controlar aplicando un pulverizador foliar que tiene propiedades
gametocidas contra los gametos masculinos. Cross y col., Sex
Plant Reprod. 4: 235 (1991). Por ejemplo, la aplicación
de ethrel a las anteras da como resultado mitosis polínica adicional
en trigo, degeneración de las células tapetales en cebada, y polen
malformado o abortado en Eragrostis. Bennet y col.,
Nature 240: 566 (1972), Colhoun y col., Plant Cell
Environ. 6: 21 (1983); Berthe y col., Crop Sci.
18: 35 (1978). Sin embargo, la aproximación química es
intensiva como trabajo, presenta problemas potenciales con la
toxicidad de los productos químicos introducidos en el ambiente, y
puede ser muy sensible al momento de la aplicación.
Además, la producción comercial de semilla
híbrida usando gametocidas está limitada por el gasto y la
disponibilidad de los productos químicos, igual que por la
fiabilidad y duración de acción de las aplicaciones. Una seria
limitación de los gametocidas es que tienen efectos fitotóxicos, la
gravedad de los cuales depende del genotipo. Otras limitaciones
incluyen que estos productos químicos pueden no ser efectivos para
cultivos con un periodo de floración prolongado debido a que las
nuevas flores producidas no se afectan. Consecuentemente, se
requiere la aplicación repetida de productos químicos.
Muchos sistemas de producción de semillas
híbridas comerciales actuales para cultivos de campo dependen de un
medio genético de control de la polinización. Las plantas que se
usan como hembras bien fallan al emitir polen, bien producen polen
que es bioquímicamente incapaz de efectuar autofertilización, o bien
fallan al fabricar polen. Las plantas que son incapaces de
autofertilizarse se dice que son "autoincompatibles". Las
dificultades asociadas con el uso de un sistema de
autoincompatibilidad incluyen disponibilidad y propagación de la
línea femenina autoincompatible, y estabilidad de la
autocompatibilidad. En muchos casos, la autoincompatibilidad se
puede superar químicamente, o los brotes inmaduros se pueden
polinizar manualmente antes de que los mecanismos bioquímicos que
bloquean el polen se activen. Los sistemas de autoincompatibilidad
que se pueden desactivar son a menudo muy vulnerables a las
condiciones climáticas estresantes que rompen o reducen la
efectividad del bloque bioquímico de autopolinización.
De interés más amplio para la producción
comercial de semillas son los sistemas genéticos basados en control
del polen que causan esterilidad masculina. Estos sistemas son de
dos tipos generales: (1) esterilidad masculina nuclear, la cual es
el fallo de la formación de polen debido a mutaciones en uno o más
genes nucleares o (2) esterilidad masculina
citoplásmica-genética, referida comúnmente a como
"esterilidad masculina citoplásmica" (CMS), en la cual la
formación de polen se bloquea o aborta debido a una alteración en un
orgánulo citoplásmico, el cual generalmente es la mitocondria.
La esterilidad nuclear puede ser bien dominante o
bien recesiva. Típicamente, la esterilidad dominante sólo se puede
usar para la formación de semillas híbridas si la propagación
vegetativa o clonal de la línea femenina es posible. La esterilidad
recesiva se puede usar si las plantas estériles y fértiles se
discriminan fácilmente. La utilidad comercial de sistemas de
esterilidad dominantes y recesivos está limitada, sin embargo, por
el gasto de la propagación clonal y el enrojecimiento de las líneas
femeninas de las plantas autofertilizables, respectivamente.
\newpage
Aunque hay esquemas de hibridación que implican
el uso de CMS, hay limitaciones para su valor comercial. Un ejemplo
de un sistema CMS es una mutación específica en la mitocondria
situada en el citoplasma la cual puede, cuando está en el adecuado
antecedente nuclear, conducir al fallo de la formación de polen
maduro. En algunos ejemplos, el antecedente nuclear se puede
compensar por la mutación citoplásmica y tiene lugar la formación de
polen normal. Los genes restauradores nucleares específicos permiten
la formación de polen en plantas con mitocondria de CMS.
Generalmente, el uso de CMS para producción comercial de semillas
implica el uso de tres líneas de cría: una línea con esterilidad
masculina (parental femenina), una línea mantenedora la cual es
isogénica a la línea masculina estéril pero contiene mitocondria
plenamente funcional, y una línea parental masculina. La línea
parental masculina puede o no puede llevar los genes restauradores
específicos en el citoplasma.
Para cultivos tales como vegetales para los
cuales la recuperación de semillas del híbrido no es importante, un
sistema CMS se puede usar sin restauración. Para cultivos para los
cuales la fruta o semilla del híbrido es el producto comercial, la
fertilidad de la semilla del híbrido se debe restaurar mediante los
genes restauradores específicos en el progenitor masculino o se debe
polinizar el híbrido con esterilidad masculina. La polinización de
híbridos no restaurados se puede lograr incluyendo un pequeño
porcentaje de plantas fértiles masculinas para llevar a cabo la
polinización. En la mayoría de las especies, la característica CMS
se hereda maternalmente, dado que todos los orgánulos citoplásmicos
se heredan usualmente sólo de la célula huevo.
Los sistemas CMS poseen limitaciones que pueden
descartarlos como una solución única para la producción de plantas
con esterilidad masculina. Por ejemplo, un tipo particular de CMS en
maíz (citoplasma T) confiere sensibilidad a la toxina producida
mediante infección por un hongo particular. Aunque usados aún para
un número de cultivos, los sistemas CMS pueden fallar bajo ciertas
condiciones ambientales.
Es patente por lo tanto que un medio de controlar
la producción polínica mediante un procedimiento diferente a los
procedimientos manuales, mecánicos, químicos y genéticos
tradicionales es grandemente deseable.
De acuerdo con ello, es un objeto de la presente
invención proporcionar una molécula de DNA aislada que comprende un
promotor específico de anteras unido operativamente a una secuencia
de nucleótidos que codifica estreptavidina.
Es un objeto adicional de esta invención
proporcionar un vector de expresión que comprende la molécula de DNA
aislada de acuerdo con la invención. En una realización preferida de
la presente invención, el vector de expresión es uno en el que una
secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal está unida
operativamente a dicha secuencia de nucleótidos que codifica
estreptavidina. En una realización adicional, el vector de expresión
es uno en el que dicha secuencia señal es la secuencia señal de la
alfa amilasa de levadura.
En un aspecto adicional de la invención se
proporciona una planta transgénica en la que dicha planta comprende
el vector de expresión de acuerdo con la invención. En realizaciones
preferidas la planta transgénica es una planta de maíz, una planta
de soja, una planta de colza, o una planta de girasol.
Es otro objeto de la invención proporcionar un
procedimiento de producir una planta con esterilidad masculina
transgénica, que comprende introducir dentro de las células de la
planta un vector de expresión que comprende un promotor unido
operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica
estreptavidina y que regenera una planta transgénica a partir de
dichas células transformadas, en la que dicho promotor controla la
expresión de dicho gen, y a través de la cual dicha expresión
genética causa esterilidad masculina de dicha planta
transgénica.
En un aspecto adicional de la invención hay
proporcionado un procedimiento de usar un gen de estreptavidina para
producir una planta híbrida con fertilidad masculina, que comprende
las etapas de: (a) producir una primera planta con esterilidad
masculina que comprende una molécula de DNA que comprende un
promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que
codifica estreptavidina en el que la expresión de dicha
estreptavidina causa esterilidad masculina; (b) producir una segunda
planta parental transgénica la cual expresa un segundo gen extraño;
y (c) fertilizar de forma cruzada dicho primer progenitor con dicho
segundo progenitor para producir una planta híbrida; en el que dicha
planta híbrida expresa dicho segundo gen extraño, y en el que el
producto de dicho segundo gen extraño reduce la expresión de
estreptavidina en dicha planta híbrida, produciendo de este modo una
planta híbrida con fertilidad masculina.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención se selecciona el segundo gen extraño del grupo que
consta de un gen antisentido, un gen de ribozima y un gen de
secuencia guía externa. En realizaciones adicionales preferidas la
molécula de DNA de la primera planta parental comprende
adicionalmente un operador LexA el cual se une operativamente al
citado promotor, en el que el segundo gen extraño es el gen represor
de LexA.
En un aspecto adicional de la invención hay
proporcionado un procedimiento para producir semillas que tienen una
característica de grano deseada, que comprende las etapas de: (a)
producir una primera planta transgénica que es estéril como macho y
comprende una secuencia de nucleótidos que codifica estreptavidina
operativamente unida a una secuencia promotora; (b) producir una
segunda planta parental la cual es fértil como macho y lleva uno o
más genes que controlan dicha característica de grano deseada; (c)
fertilizar de forma cruzada dicho primer padre con dicho segundo
padre para producir semillas híbridas con dicha característica de
grano, y (d) cosechar dichas semillas.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención la primera planta padre es una planta híbrida. En aún
otras realizaciones, la citada característica del grano se
selecciona del grupo que consta de contenido en aceite, proteína o
almidón. En realizaciones preferidas la planta parental es maíz,
soja, colza o girasol.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, la secuencia promotora es un promotor específico de
anteras que comprende una caja de anteras seleccionada del grupo que
consta de la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 1; la
secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 2, la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 3; y un fragmento funcional de la
misma.
En aún otra realización preferida de la invención
la caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.:
1 y en la que dicho promotor específico de anteras comprende
adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que
consta de: el promotor esencial CaMV 35S; la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4; la secuencia de nucleótidos de SEQ.
ID Nº.: 5; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y un
fragmento funcional de la misma.
En aún otra realización preferida de la invención
la caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.:
2, y en la que dicho promotor específico de anteras comprende
adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que
consta de: el promotor esencial CaMV 35S; la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4; la secuencia de nucleótidos de SEQ.
ID Nº.: 5; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y un
fragmento funcional de la misma.
En aún otra realización preferida de la invención
la caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.:
3, y en la que dicho promotor específico de anteras comprende
adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo que
consta de: el promotor esencial CaMV 35S; la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4; la secuencia de nucleótidos de SEQ.
ID Nº.: 5; la secuencia de nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y un
fragmento funcional de la misma.
La figura 1 muestra el plásmido codificante de
avidina PHI5168 en el cual un promotor de ubiquitina de maíz
(incluyendo su primer exón más su primer intrón) conduce la
expresión de una secuencia señal de exportación de alfa amilasa de
cebada y una región codificante de avidina.
La figura 1 muestra el plásmido codificante
PHI6l0 que codifica el gen bar.
En esta descripción que sigue un número de
términos se usan extensamente. Las siguientes definiciones se
proporcionan para facilitar la comprensión de la invención.
Un gen estructural es una secuencia de DNA
que se transcribe en RNA mensajero (RNAm) el cual se traduce después
en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido
específico.
Un gen extraño se refiere en la presente
descripción a una secuencia de DNA que está unida operativamente a
al menos un elemento regulador heterólogo. Por ejemplo, cualquier
gen distinto al gen estructural 5126 de maíz se considera que es un
gen extraño si la expresión de ese gen se controla mediante un
elemento regulador específico de anteras del gen 5126.
Un promotor es una secuencia de DNA que
dirige la transcripción de un gen, tal como un gen estructural, un
gen antisentido, un gen de ribozima o un gen de secuencia de guía
externa. Típicamente, un promotor está situado en la región 5' de un
gen, próximo al sitio de inicio de la transcripción. Si un promotor
es un promotor inducible, entonces la velocidad de transcripción se
incrementa en respuesta a un agente de inducción. En contraste, la
velocidad de transcripción no está regulada mediante un agente de
inducción si el promotor es un promotor constitutivo. Un promotor
vegetal es una secuencia promotora que dirigirá la transcripción de
un gen en un tejido vegetal.
Un promotor esencial contiene secuencias
nucleotídicas esenciales para la función del promotor, incluyendo la
caja TATA y el inicio de transcripción. Mediante esta definición, un
promotor esencial puede o no puede tener actividad detectable en la
ausencia de secuencias específicas que pueden potenciar la actividad
o conferir actividad específica de tejido. Por ejemplo, el promotor
esencial SGB6 consta de aproximadamente 38 nucleótidos de la zona 5'
del sitio de inicio transcripcional del gen SGB6, mientras que el
promotor esencial de 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor (CaMV)
consta de aproximadamente 33 nucleótidos de la zona 5' del sitio de
inicio transcripcional del genoma de 35S.
Un promotor específico de tejido es una
secuencia de DNA que, cuando se une operativamente a un gen, conduce
a un nivel mayor de transcripción de ese gen en un tejido específico
que en algunos o todos los otros tejidos en un organismo. Por
ejemplo, un promotor específico de anteras es una secuencia
de DNA que conduce a un nivel mayor de transcripción de un gen
asociado en el tejido de las anteras de la planta. El promotor
específico de anteras SGB6, por ejemplo, puede dirigir la expresión
de un gen extraño en tejido de anteras, pero no en el tejido radical
o tejido del coleoptilo.
Como se usa en el presente documento, un
"promotor específico de anteras" comprende dos elementos
funcionales: una "caja de anteras" y un promotor esencial. Una
caja de anteras en particular posee las características funcionales
de un potenciador clásico. La combinación de una caja de anteras y
un promotor esencial puede estimular la expresión génica a una mayor
extensión que un promotor esencial solo. Esto es verdad incluso en
el caso de un promotor quimérico específico de anteras que contiene
una caja de anteras y un promotor esencial derivado de diferentes
genes. Tales elementos reguladores específicos de anteras quiméricos
se describen a continuación.
Un operador es una secuencia de DNA que se
localiza en la zona 5' de un gen y que contiene una secuencia de
nucleótidos la cual se reconoce y une mediante una proteína
represora. La unión de una proteína represora con su operador
conocido como resultado la inhibición de la transcripción del gen.
Por ejemplo, el gen LexA codifica una proteína represora que se une
al operador LexA.
Una molécula de DNA aislada es un
fragmento de DNA que se ha separado del DNA de un organismo. Por
ejemplo, una molécula de DNA clonada que codifica un gen de avidina
es una molécula aislada de DNA. Otro ejemplo de una molécula aislada
de DNA es una molécula de DNA sintetizada químicamente, o de cDNA
producido enzimáticamente, que no está integrado en el DNA genómico
de un organismo.
Un potenciador es un elemento regulador de
DNA que puede incrementar la eficiencia de la transcripción.
El DNA complementario (cDNA) es una
molécula de cadena simple de DNA que se forma a partir de una
plantilla de RNAm mediante la enzima transcriptasa reversa.
Típicamente, un cebador complementario a partes de RNAm se emplea
para la iniciación de transcripción reversa. Aquellos expertos en la
técnica también usan el término "cDNA" para referirse a una
molécula de DNA de doble cadena que consta de tal molécula de DNA de
cadena simple y su cadena de DNA complementaria.
El término expresión se refiere a la
biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen
estructural, la expresión implica transcripción del gen estructural
en RNAm y la traducción de RNAm en uno o más polipéptidos.
Un vector de clonación es una molécula de
DNA, tal como un plásmido, cósmido, o bacteriófago, que tiene la
capacidad de replicarse autónomamente en una célula huésped. Los
vectores de clonación típicamente contienen uno o un pequeño número
de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los
cuales las secuencias de DNA extraño se pueden insertar en un modo
determinado sin pérdida de una función biológica esencial del
vector, igual que un gen marcador que es adecuado para usar en la
identificación y selección de células transformadas con el vector de
clonación. Los genes marcadores incluyen genes que proporcionan
resistencia a tetraciclina o resistencia a ampicilina.
Un vector de expresión es una molécula de
DNA que comprende un gen que se expresa en una célula huésped.
Típicamente, la expresión génica se sitúa bajo el control de ciertos
elementos reguladores, incluyendo promotores constitutivos o
inducibles, elementos reguladores específicos de tejido, y
potenciadores. De un gen tal se dice que está "operativamente
unido a" los elementos reguladores.
Un huésped recombinante puede ser una
célula procariota o eucariota que contiene bien un vector de
clonación o bien un vector de expresión. Este término también
incluye aquellas células procariotas o eucariotas que se han
modificado mediante ingeniería genética para contener el gen/los
genes clonado(s) en el cromosoma o genoma de la célula
huésped.
Una planta transgénica es una planta que
tiene una o más células vegetales que contienen un gen extraño.
En eucariotas, la RNA polimerasa II cataliza la
transcripción de un gen estructural para producir RNAm. Una molécula
de DNA se puede diseñar para contener una plantilla de RNA
polimerasa II en la cual el transcrito de RNA tiene una secuencia
que es complementaria a aquella de un RNAm. El transcrito de RNA se
llama un RNA antisentido y una secuencia de DNA que codifica el RNA
antisentido se llama un gen antisentido. Las moléculas de RNA
antisentido son capaces de unirse a moléculas de RNAm, dando como
resultado una inhibición de traducción de RNAm.
Una ribozima es una molécula de RNA que
contiene un centro catalítico. El término incluye enzimas de RNA,
RNA con capacidad de "autosplicing", y RNA con capacidad de
autoescisión. Una secuencia de DNA que codifica una ribozima se
llama un gen de ribozima.
Una secuencia guía externa es una molécula
de RNA que dirige a la ribozima endógena, RNAsa P, a una especie
particular de RNAm intracelular, dando como resultado la escisión
del RNAm mediante RNAsa P. Una secuencia de DNA que codifica una
secuencia guía externa se llama un gen de secuencia guía
externa.
Una propiedad de grano o semilla es una
característica nutricional o fisiológica de la semilla,
preferiblemente controlada mediante un gen dominante, la cual afecta
significativamente al tipo industrial. Las propiedades de grano o
semilla incluyen características tales como contenido en aceite,
proteína y almidón, igual que calidad proteica y tipo de
almidón.
Un cruce individual es un cruce entre dos
líneas endogámicas.
Un cruce doble es un cruce entre dos
cruces individuales.
Un cruce de tres caminos es la progenie de
un cruce entre un cruce individual y una línea endogámica.
Un híbrido es un vástago de primera
generación de un cruce entre dos individuos que difieren en uno o
más genes.
Una línea endogámica es una línea pura
originada usualmente mediante autopolinización y selección.
Una línea sintética es una mezcla de
cepas, clones, endógamos o híbridos entre ellos, mantenidos mediante
polinización abierta durante un número especificado de generaciones.
Los componentes unidos se propagan y los compuestos de síntesis se
reconstituyen a intervalos regulares.
La capacidad de combinación específica es
la realización de combinaciones específicas de líneas genéticas en
cruces en relación a la realización promedio de todas las
combinaciones.
Una planta polinizadora es el padre fértil
masculino el cual dona polen al progenitor femenino con esterilidad
masculina. Una planta polinizadora puede tener uno cualquiera de
muchos antecedentes genéticos diferentes y por lo tanto puede ser
una línea endogámica, un híbrido, una línea polinizada abierta
sintética o una reserva genética. Una planta polinizadora puede ser
una línea transgénica. Una planta polinizadora puede llevar una o
más características de grano o semilla de interés.
La presente invención proporciona procedimientos
para generar plantas masculinas estériles preparando plantas
transgénicas que expresan estreptavidina. La estreptavidina se puede
expresar constitutivamente, en una forma no específica de tejido, o
se puede expresar en una forma específica de antera. Los
procedimientos para restaurar la fertilidad masculina se
proporcionan también.
También se proporciona un procedimiento para
producir semillas híbridas que tienen una o más características de
grano o semilla de interés. En una realización preferida de esta
invención un primer híbrido, el cual es estéril como macho y tiene
una o más copias del gen de estreptavidina, se cruza como el
progenitor femenino con un segundo híbrido, el cual es fértil como
macho y lleva una o más características de semilla o grano de
interés. Las semillas híbridas se producen con una o más
características de semilla o grano del progenitor masculino.
Un gen de estreptavidina se aísla e inserta
dentro de un vector de expresión adecuado para introducción en el
tejido vegetal. El vector de expresión comprende adicionalmente un
promotor el cual puede ser un promotor constitutivo, un promotor no
específico de tejido, tal como el promotor de ubiquitina, un
promotor específico de tejido tal como un promotor específico de
anteras, o un promotor inducible. El vector de expresión puede
comprender una secuencia señal de exportación. La expresión de alto
nivel de un producto génico el cual se acumula entonces en el
citoplasma puede resultar en toxicidad para la célula vegetal. La
eliminación del producto génico del citoplasma puede dar como
resultado así citotoxicidad reducida. Se conocen genes vegetales y
sus secuencias señal de exportación. Véase Jones y Robinson,
Tansley Review 17: 567-597 (1989). El vector
de expresión se introduce en el tejido vegetal mediante
procedimientos estándar y las plantas transgénicas se seleccionan y
propagan. Las plantas trasgénicas que expresan estreptavidina son
estériles como machos. La fertilidad masculina se puede restaurar
mediante coexpresión en las plantas transgénicas de un segundo gen
que inhibe la transcripción del gen de estreptavidina, o inhibe la
traducción de RNAm de estreptavidina. De acuerdo con esta
realización, la supresión temporal del gen de avidina se logra si el
gen supresor está unido operativamente a un promotor inducible.
Alternativamente, la fertilidad masculina se puede restaurar
pulverizando plantas en desarrollo con disoluciones de biotina.
Las secuencias de nucleótidos que codifican
avidina se pueden aislar mediante procedimiento conocidos. Por
ejemplo, se conoce la secuencia de nucleótidos del gen de la
estreptavidina. Argarana y col., Nucleic Acids Res.,
14(4): 1871-1882 (1986).
Alternativamente, un cDNA que codifica avidina blanca de huevo de
pollo se puede aislar a partir de una biblioteca de cDNA de oviducto
de pollo mediante los procedimientos descritos mediante Gope y col.,
Nucleic Acids Res., 15: 3595 (1987).
Los clones genómicos del gen de avidina se pueden
obtener a partir del DNA genómico de organismos que son conocidos
por producir avidina. Por ejemplo, un gen de avidina de pollo se
puede clonar a partir de DNA genómico de pollo mediante los
procedimientos descritos en Keinanen y col, Eur. J. Biochem.
220: 615 (1994).
Los genes de avidina se pueden aislar también
usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando
procedimientos estándar. Véase Erlich, PCR TECHNOLOGY: PRINCIPLES
AND APPLICATIONS FOR DNA AMPLIFICATION (Stockton Press, NY,
1989) y Innis y col., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND
APPLICATIONS (Academic Press, San Diego, 1990). Los
procedimientos para amplificación de PCR de secuencias largas de
nucleótidos, tales como el sistema ELONGASE™ (Life Technologies,
Inc., Gaithersburg, MD) se pueden usar también para obtener
secuencias nucleotídicas más largas, tales como clones genómicos que
codifican avidina. Los cebadores de PCR complementarios a los
extremos 5' y 3' de las secuencias génicas conocidas de avidina se
pueden sintetizar usando sintetizadores de oligonucleótidos
comerciales, tales como aquellos suministrados por Applied
Biosystems (Foster City, CA). En una realización preferida, los
cebadores incluyen secuencias de nucleótidos adicionales que
contienen sitios de escisión de endonucleasas de restricción. La
presencia de tales sitios permite la clonación direccional de
productos de PCR en vectores de clonación adecuados después del
tratamiento con una enzima de restricción apropiada. Véase Finney,
"Molecular Cloning of PCR Products" en CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel y col. Eds. (John Wiley
& Sons, Nueva York, 1987) p. 15.7.1.
La plantilla de DNA para el PCR puede bien ser
cDNA o bien DNA genómico, y se puede preparar a partir de un
organismo apropiado usando procedimientos bien conocidos en la
técnica. Sambrook y col., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL, Segunda Edición, (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY 1989). El DNA genómico se puede preparar
directamente a partir de tejido aviar, reptiliano o de anfibio
usando reactivos comerciales, tales como Triazol™ (Life
Technologies, Inc., Gaithersburg, MD). Alternativamente, el cDNA que
codifica avidina se puede preparar usando RNAm extraído del tejido
de oviducto de pollo usando un kit comercialmente disponible
(Pharmacia, Piscataway, NJ). La preparación de RNAm se usa como una
plantilla para la síntesis de cDNA usando poli(dT) o
cebadores hexámeros aleatorios mediante técnicas estándar. Véase
Sambrook y col., supra. La síntesis de cDNA se lleva a cabo
después usando un kit comercialmente disponible (Pharmacia), y el
cDNA se usa directamente para PCR usando el procedimiento de Saiki y
col., Science 239: 487 (1988).
El DNA genómico o los fragmentos de cDNA aislados
mediante los procedimientos descritos anteriormente se pueden
insertar en un vector, tal como un vector bacteriófago o cósmido, de
acuerdo con técnicas convencionales, tales como el uso de digestión
con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, el
uso de tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar la unión
indeseable de moléculas de DNA, y la ligazón con ligasas apropiadas.
Las técnicas para la manipulación de tales vectores se describen por
Ausubel y col. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR
BIOLOGY, páginas 3.0.5-3.17.5 (1990)
["Ausubel"].
Alternativamente, las secuencias nucleotídicas
que codifican avidina se pueden obtener sintetizando moléculas de
DNA que codifican avidina usando oligonucleótidos largos que se
sirven como cebadores mutuamente. Véase, por ejemplo, Ausubel en
páginas 8.2.8 a 8.2.13. Además, véase Wosnick y col., Gene
60: 115 (1987). Las técnicas actuales que usan la reacción en
cadena de la polimerasa proporcionan la capacidad para sintetizar
genes tan largos como 1,8 kilobases de longitud. Adang y col.,
Plant Molec. Biol. 21: 1131 (1993); Bambot y col.,
PCR Methods and Applications 2: 266 (1993). La
secuencia de nucleótidos de un gen de avidina sintetizado se puede
basar en cualquier molécula de DNA codificadora de avidina conocida.
Véase, por ejemplo, Gope y col., supra.
Estos clones se pueden analizar usando una
diversidad de técnicas estándar tales como análisis de restricción,
análisis de Southern, análisis de extensión de cebadores, y análisis
de secuencia de DNA. El análisis de extensión de cebadores o
análisis de protección de la nucleasa S1, por ejemplo, se pueden
usar para localizar el sitio de inicio teórico de transcripción del
gen clonado. Ausubel en páginas 4.8.1-4.8.5;
Walmsley y col., "Quantitative and Qualitative Analisys of
Exogenous Gene Expression by the S1 Nuclease Protection
Assay", en METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 7: GENE
TRANSFER AND EXPRESSION PROTOCOLS, Murray (ed.), páginas
271-281 (Humana Press Inc. 1991). Estas técnicas y
técnicas relacionadas bien conocidas para alguien experto en la
técnica se emplean para aislamiento de otros genes de interés, y su
clonación y expresión.
Una vez un gen de avidina se ha aislado se sitúa
dentro de un vector de expresión mediante procedimientos estándar.
Véase Sambrook y col., supra. La selección de un vector de
expresión apropiado dependerá del procedimiento de introducir el
vector de expresión dentro de las células huésped. Típicamente, un
vector de expresión contiene: (1) elementos de DNA procariótico que
codifican para un origen de replicación bacteriano y un gen de
resistencia a antibióticos para proporcionar para el crecimiento y
selección del vector de expresión en el huésped bacteriano; (2) un
sitio de clonación para inserción de una secuencia de DNA exógena,
por ejemplo un gen de avidina; (3) elementos de DNA eucariótico que
controlan la iniciación de transcripción del gen exógeno, tales como
un promotor; (4) elementos de DNA que controlan el procesamiento de
transcriptos, tales como una secuencia de terminación de la
transcripción/poliadenilación; y (5) un gen que codifica una
proteína marcadora (por ejemplo un gen comunicador), en el que el
gen está unido operativamente a los elementos de DNA que controlan
la iniciación de la transcripción. Adicionalmente, el vector de
expresión puede comprender una secuencia de DNA que codifica una
secuencia señal de exportación unida operativamente a la secuencia
de DNA exógeno. Las descripciones generales de los vectores de
expresión vegetales y los genes comunicadores se pueden encontrar en
Gruber y col., "Vectors for Plant Transformation", en
METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick y
col. (eds.), páginas 89-119 (CRC Press, 1993).
\newpage
En una realización preferida de la presente
invención un sistema promotor de ubiquitina vegetal se conoce bien
en la técnica. Véase, por ejemplo, Solicitud de Patente Europea 0
342 926. El promotor de ubiquitina es un promotor constitutivo.
Un promotor inducible se usa para permitir la
regulación inducible de la expresión de avidina. Un ejemplo de un
promotor inducible tal es el sistema glutation
S-transferasa en maíz. Véase Wiegand y col.,
Plant Mol. Biol. 7: 235 (1986). Este procedimiento
permite también la inducción reversible de esterilidad masculina.
Así, la expresión de avidina y la esterilidad masculina
concomitante, se puede controlar como se desea mediante activación
del promotor. Cuando el promotor no se activa, la avidina no se
expresa, y las plantas son fértiles como machos.
La expresión puede comprender un marcador
seleccionable o rastreable. Muchos de los genes marcadores
seleccionables positivos usados comúnmente para la transformación
vegetal se aislaron a partir de bacterias y codifican para enzimas
que detoxifican metabólicamente un agente químico selectivo el cual
puede ser un antibiótico o un herbicida. Otros genes marcadores
selectivos positivos codifican una diana alterada la cual es
insensible al inhibidor.
Un gen marcador seleccionable comúnmente usado
para la transformación vegetal es el gen de la neomicina
fosfotransferasa II (npyII), aislado a partir de Tn5, el cual
cuando se sitúa bajo el control de las señales reguladoras vegetales
confiere resistencia a kanamicina. Fraley y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 80: 4803 (1983). Otro marcador
seleccionable comúnmente usado es el gen de la higromicina
fosfotransferasa el cual confiere resistencia a antibióticos
incluyendo gentamicinacetiltransferasa,
estreptomicinfosfotransferasa,
aminoglucósido-3'-adeniltransferasa
y el determinante de la resistencia a bleomicina. Hayford y col.,
Plant Physiol. 86: 1216 (1988); Jones y col., Mol.
Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svab y col., Plant Mol.
Biol. 14: 197 (1990), Hille y col., Plant Mol.
Biol. 7: 171 (1986).
Otros genes marcadores seleccionables positivos
para transformación vegetal no son de origen bacteriano. Estos genes
incluyen dihidrofolato reductasa de ratón,
5-enolpiruvilshikimato-3-fosfatosintasa
vegetal y acetolactatosintasa vegetal. Eichholz y col., Somatic
Cell Mol. Genet. 13: 67 (1987); Sha y col.,
Science 233: 478 (1986); Charest y col., Plant Cell
Rep. 8: 643 (1990).
Otros genes marcadores seleccionables comunes
para plantas confieren resistencia a inhibidores herbicidas de la
glutaminasintetasa. La Solicitud de Patente Europea Nº.: 0 333 033
cedida a Kumada y col. y la Patente de los Estados Unidos Nº.:
4.975.374 cedida a Goodman y col. describen las secuencias de
nucleótidos de los genes de glutaminasintetasa los cuales confieren
resistencia a herbicidas tales como
L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un
gen de la fosfinotricin-acetiltransferasa se
proporciona en la Solicitud Europea Nº.: 0 242 246 cedida a Leemans
y col. De Greef y col., Bio/Technology 7: 61 (1989),
describe la producción de plantas transgénicas que expresa genes bar
quiméricos que codifican para la actividad
fosfinotricin-acetil-transferasa.
Otra clase de genes marcadores para
transformación vegetal requiere rastreo de células vegetales
transformadas presumiblemente más que selección genética directa de
células transformadas para resistencia frente a una sustancia tóxica
tal como un antibiótico. Estos genes son particularmente útiles para
cuantificar o visualizar el patrón espacial de expresión de un gen
en tejidos específicos y se refieren frecuentemente como genes
comunicadores debido a que se pueden fusionar a un gen o secuencia
reguladora génica para la investigación de la expresión génica.
Los genes comúnmente usados para rastrear células
presumiblemente incluyen \beta-glucuronidasa
(GUS), \beta-galactosidasa, luciferasa y
cloranfenicolacetiltransferasa. Jefferson, Plant Mol. Biol.
Rep. 5: 387 (1987); Teeri y col., EMBO J.
8: 343 (1989); Koncz y col., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 84: 131 (1987); De Block y col., EMBO J.
3: 1681 (1984). Se ha usado otra aproximación a la
identificación de los eventos de transformación relativamente raros
de un gen que codifica un regulador constitutivo dominante de la vía
de pigmentación con antocianina de Zea mays. Ludwig y col.,
Science 247: 449 (1990).
Los vectores de expresión pueden comprender el
gen de avidina unido operativamente a una secuencia de DNA que
codifica para una secuencia señal de exportación de péptidos. Véase
Hones y Robinson, supra. El vector se hace de tal forma que
una secuencia señal se fusiona al extremo N-terminal
de la secuencia proteica de avidina madura, permitiendo el
procesamiento celular normal para escindir con seguridad la molécula
de proteína y producir avidina activa madura. En una realización
particularmente preferida, la secuencia señal es la secuencia señal
alfa amilasa de cebada. Rogers, J. Biol. Chem. 260:
3731-3738 (1985).
Los vectores de expresión que contienen un gen de
avidina se pueden introducir dentro de protoplastos, o dentro de
tejidos intactos, tales como embriones inmaduros y meristemos, o
dentro de cultivos de callos, o dentro de células aisladas.
Preferiblemente, los vectores de expresión se introducen dentro de
tejidos intactos. Los procedimientos generales de cultivar tejidos
vegetales se proporcionan, por ejemplo, por Miki y col.,
"Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", en
METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick y
col. (eds.), páginas 67-88 (CRC Press, 1993), y por
Phillips y col., "Cell/Tissue Culture and In Vitro
Manipulation", en CORN AND CORN IMPROVEMENT, 3ª Edición, Sprague
y col. (eds.), páginas 345-387 (American Society of
Agronomy, Inc. y col. 1988).
Los procedimientos de introducir vectores de
expresión dentro del tejido vegetal incluyen la infección directa o
co-cultivo de tejido vegetal con Agrobacterium
tumefasciens, Horsch y col., Science 227: 1229
(1985). Preferiblemente, un Ti-plásmido desarmado se
usa como un vector para secuencias de DNA extrañas. La
transformación se puede llevar a cabo usando procedimientos
descritos, por ejemplo, en la Solicitud de Patente Europea
Nº^{s}.: 116 718 (1984) y 270 822 (1988). Los vectores del
Ti-plásmido preferidos contienen la secuencia de DNA
extraño entre las secuencias fronterizas, o al menos localizado con
anterioridad en la cadena a la secuencia fronteriza derecha.
Otros tipos de vectores se pueden usar para
transformar las células vegetales usando procedimientos tales como
transferencia génica directa (véase, por ejemplo, la Solicitud PCT
WO 85/01856 y la Solicitud Europea 275 069), transformación in
vitro de protoplastos (por ejemplo, patente de los Estados
Unidos Nº.: 4.684.611), transformación de plantas mediadas por virus
(por ejemplo, Solicitud Europea Nº.: 067 553 y Patente de los
Estados Unidos Nº.: 4.407.956), y transformación mediada por
liposomas (por ejemplo, Patente de los Estados Unidos Nº.
4.536.475). Procedimientos adecuados para la transformación del maíz
se proporcionan por Fromm y col., Bio/Technology 8:
833 (1990), y mediante Gordon-Kamm y col., The
Plant Cell 2: 603 (1990). Los procedimientos estándar
para la transformación del arroz se describen por Christou y col.,
Trends in Biotechnology 10: 239 (1992), y mediante Lee
y col., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 88: 6389 (1991). El trigo
se puede transformar usando procedimientos que son similares a las
técnicas para transformar maíz o arroz. Además, Casas y col.,
Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90: 11212 (1993), describe
un procedimiento para transformar sorgo, mientas que Wan y col.,
Plant Physiol. 104: 37 (1994), describe un procedimiento para
transformar cebada.
En general, los procedimientos de transferencia
directa se prefieren para la transformación de una planta
monocotiledónea, particularmente un cereal tal como arroz, maíz,
sorgo, cebada o trigo. Los procedimientos de transferencia directa
adecuados incluyen administración mediada por microproyectiles,
inyección de DNA, electroporación, y similares. Véase, por ejemplo,
Gruber y col., supra, Miki y col, supra, y Klein y
col., Bio/Technology 10: 268 (1992). Más
preferiblemente, los vectores de expresión se introducen en tejidos
de una planta monocotiledónea que usan administración mediada por
microproyectiles con un dispositivo biolístico.
Para inducir esterilidad masculina se construye
un vector de expresión en el cual una secuencia de DNA que codifica
avidina está unida operativamente a las secuencias de DNA que
regulan la transcripción de genes en tejido vegetal. Los
requerimientos generales de un vector de expresión se describen
anteriormente. Con el fin de lograr esterilidad masculina mediante
expresión de avidina se prefiere que la avidina no se exprese
meramente en una forma transitoria, sino que el vector de expresión
se introduce dentro del tejido embrionario vegetal en una forma tal
que la avidina se expresará como una fase posterior de desarrollo en
la planta adulta. Por ejemplo, la estabilidad mitótica se puede
lograr usando vectores virales vegetales que proporcionan
replicación epicromosomal.
Un procedimiento preferido de obtener estabilidad
mitótica se proporciona mediante la integración de secuencias de
vector de expresión en el cromosoma huésped. Tal estabilidad
mitótica se puede proporcionar mediante la administración con
microproyectiles de un vector de expresión a tejido vegetal, o
usando otros procedimientos estándar como se describe anteriormente.
Véase, por ejemplo, Fromm y col., Bio/Technology 8:
833 (1990), Gordon-Kamm y col., The Plant
Cell 2: 603 (1990), y Walters y col., Plant Molec.
Biol. 18: 189 (1992).
La transcripción del gen de avidina después de la
introducción dentro del tejido vegetal se controla preferiblemente
mediante un promotor constitutivo que estimula no específicamente la
expresión génica en tejidos vegetales. Un ejemplo de un promotor
constitutivo adecuado para este propósito es el promotor de
ubiquitina, como se describe supra.
La transcripción del gen de avidina puede
controlarse también mediante un promotor el cual un promotor el cual
estimula la expresión génica de una manera específica de tejido. Un
promotor específico de anteras particularmente preferido es el
promotor 5126 el cual se aisló de la línea endogámica de maíz línea
B73. El promotor 5126 estimula la expresión de un gen extraño desde
anteras en cuarteto hasta anteras en fase de microspora uninucleada
temprana.
Otro promotor específico de anteras adecuado es
el promotor SGB6, el cual se aisló también a partir de la línea B73.
El promotor SGB6 puede inducir expresión de un gen extraño en las
células tapetales de las anteras desde la fase de cuarteto hasta la
fase semiuninucleada del desarrollo de microspora.
Alternativamente, la expresión de genes
específicos de anteras se puede proporcionar usando una combinación
de una caja de anteras y un promotor esencial. Una caja de anteras
particularmente preferida es una caja de anteras 5126 la cual
comprende la siguiente secuencia de nucleótidos:
Otra caja de anteras adecuada reside en un
fragmento de DNA de 94 pares de bases definido por nucleótidos 583 a
490 corriente arriba del sitio de inicio de transcripción de SGB6.
La secuencia de nucleótidos de la caja de anteras de SGB6 de 94
pares de bases es:
Alternativamente, una caja de anteras adecuada se
obtienen a partir del promotor G9 de maíz, el cual estimula la
expresión de genes durante las etapas de desarrollo de la meiótica a
la de cuarteto. La caja de anteras G9 comprende la siguiente
secuencia de nucleótidos:
Las cajas de anteras 5126, SGB6 y G9 se pueden
obtener sintetizando oligonucleótidos, como se describe
anteriormente. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el
análisis de deleción se puede llevar a cabo para localizar una o
más secuencias reguladoras específicas de anteras en las cajas de
anteras descritas. Tales "fragmentos funcionales" de las cajas
de anteras también se pueden usar para regular la expresión de genes
de avidina en una forma específica de anteras.
Los promotores nucleares preferidos se derivan
del promotor esencial 5126, el promotor esencial SGB6, el promotor
esencial G9 y el 35S del Virus del Mosaico de la Coliflor.
Un promotor esencial particularmente preferido es
el promotor de núcleo 5126 el cual comprende la siguiente secuencia
de nucleótidos:
El promotor esencial SGB6 consta de
aproximadamente 38 nucleótidos anteriores en la cadena al sitio de
inicio transcripcional del gen SGB6. Un promotor esencial apropiado
de SGB6 tiene la siguiente secuencia de nucleótidos:
Un promotor esencial adecuado derivado del gen G9
comprende la secuencia de nucleótidos:
Los promotores nucleares apropiados también se
proporcionan mediante fragmentos funcionales de promotores nucleares
5126, SGB6 y G9. Los procedimientos para obtener tales fragmentos
funcionales se describen anteriormente.
La ventana de desarrollo de expresión del gen de
la avidina se puede extender usando un elemento regulador quimérico
que comprende una caja de anteras de un gen y un promotor específico
de anteras de un segundo gen. Por ejemplo, las secuencias
reguladoras SGB6 estimulan expresión de genes desde la fase de
desarrollo de cuarteto a través de las fases de desarrollo
semiuninucleadas, mientras las secuencias reguladoras de G9
estimulan la expresión génica durante la meiosis y a través del
estado de desarrollo de cuarteto. Aún la combinación de una caja de
anteras SGB6 y un promotor G9 estimula la transcripción de un gen
extraño durante la meiosis y a través de la fase de desarrollo
semiuninucleada. Así, diversas combinaciones de cajas de anteras y
promotores específicos de anteras son particularmente útiles para la
presente invención.
Se puede usar también un promotor esencial viral.
Ejemplos de promotores nucleares virales adecuados incluyen un
promotor esencial (CaMV) del Virus del Mosaico de la Coliflor
(CaMV), un promotor esencial del Virus del Mosaico de la
Escrofularia, y similares. Gruber y col., supra.
Preferiblemente, el promotor esencial viral es el promotor esencial
35S de CaMV, o una variante del mismo.
Con el fin de seleccionar células transformadas,
el vector de expresión contiene un gen marcador seleccionable, tal
como un gel de resistencia a herbicidas. Por ejemplo, tales genes
pueden conferir resistencia a fosfinotricina, glifosato,
sulfonilureas, atrazina, o imidazolinona. Preferiblemente, el gen
marcador seleccionable es el gen bar o el gen pat los
cuales codifican fosfinotricinacetiltransferasa. Las secuencias de
nucleótidos de los genes bar se pueden encontrar en Leemans y
col., Solicitud de Patente Europea Nº.:
0-242-246 (1987), y en White y col.,
Nucleic Acids Res. 18: 1062 (1990). Wohlleben y col.,
Gene 70: 25 (1988), describen la secuencia de
nucleótidos del gen pat. La expresión del gen bar o
pat confiere resistencia a herbicidas tales como glufosinato
(vendido como Basta® e Ignite®, entre otros) y bialafos (vendido
como Herbi-ace® y Liberty®).
El vector de expresión puede contener secuencias
de DNA que codifican avidina bajo el control de un promotor
constitutivo o un promotor específico de anteras, igual que el gen
marcador seleccionable bajo el control de un promotor constitutivo.
Alternativamente, el gen del marcador seleccionable se puede
administrar a las células huéspedes en un vector de expresión de
selección separada mediante cotransformación del tejido
embrionario.
Los procedimientos descritos anteriormente se
pueden usar para producir plantas con esterilidad masculina
transgénicas para la producción de híbridos de F1 en cruces
dirigidos a gran escala entre líneas endogámicas. Si todas las
células huéspedes de las plantas con esterilidad masculina no
contienen el gen de avidina recombinante, después una proporción de
híbridos F1 tendrá un fenotipo de fertilidad masculina. Por otro
lado, los híbridos F1 tendrán un fenotipo de esterilidad masculina
si el gen de avidina recombinante está presente en todas las células
huevo de las plantas con esterilidad masculina transgénicas. Así,
debía ser deseable usar un sistema de restauración de fertilidad
masculina para proporcionar producción de híbridos F1 con fertilidad
masculina. Un sistema de restauración de la fertilidad tal tienen
valor particular en las especies autógamas cuando el producto
cosechado es la semilla.
La aproximación comúnmente propuesta para
restaurar la fertilidad en una línea de plantas con esterilidad
masculina transgénicas requiere la producción de una segunda línea
"restauradora" de plantas transgénicas. Por ejemplo, una planta
transgénica que es estéril como macho debido a la expresión de
barnasa se puede cruzar con una planta con fertilidad masculina que
expresa el inhibidor de barnasa, como se describe anteriormente.
Mariani y col., Nature 357: 384 (1992).
En el presente caso, una aproximación análoga
requeriría la producción de una línea restauradora de las plantas
transgénicas que expresan ribozimas dirigidas a RNAm de avidina o
que expresan avidina antisentido. Por ejemplo, las ribozimas se
pueden diseñar para expresar actividad endonucleasa que se dirige
hacia una cierta secuencia diana en una molécula de RNAm. Por
ejemplo, Steinecke y col., EMBO J. 11: 1525 (1992),
logró hasta el 100% de inhibición de expresión del gen de neomicina
fosfotransferasa mediante ribozimas en protoplastos de tabaco. Más
recientemente, Perrizan y col., Antisense Res. & Devel.
3: 253 (1993), inhibieron actividad
cloranfenicolacetiltransferasa en protoplastos de tabaco usando un
vector que expresó una ribozima con estructura en cabeza de martillo
modificada. En el contexto de la presente invención, el RNAm de
avidina proporciona la molécula de RNA diana apropiada para las
ribozimas.
En una aproximación similar, la fertilidad se
puede restaurar mediante el uso de un vector de expresión que
contiene una secuencia de nucleótidos que codifica un RNA
antisentido. La unión de las moléculas de RNA antisentido a las
moléculas de RNAm diana resulta en la detención traducción por
hibridación. Paterson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74: 4370 (1987). En el contexto de la presente invención, una
molécula de RNA antisentido adecuada tendría una secuencia que es
complementaria al RNAm de avidina. En una realización preferida de
la invención, el RNA antisentido está bajo el control de un promotor
inducible. La activación de este promotor permitirá la restauración
de la fertilidad masculina.
En una aproximación alternativa adicional, se
pueden construir vectores de expresión en los cuales un vector de
expresión codifica transcriptos de RNA capaces de promover escisión
mediada por RNasa P de moléculas de RNAm de avidina. De acuerdo con
esta aproximación, se puede construir una secuencia guía externa
para dirigir la ribozima endógena, RNasa P, al RNAm de avidina, el
cual se escinde subsiguientemente mediante la ribozima celular.
Altman y col., Patente de los Estados Unidos Nº.: 5.168.053; Yuan y
col., Science 263: 1269 (1994). Preferiblemente, la
secuencia guía externa comprende una secuencia de diez a quince
nucleótidos complementaria con RNAm de avidina, y una secuencia de
nucleótidos de 3'-NCCA, en la que N es
preferiblemente una purina. Id. Los transcriptos de secuencia
guía externa se unen a las especies de RNAm diana mediante la
formación de pares de bases entre el RNAm y las secuencias guía
externas complementarias, promoviendo así la escisión de RNAm
mediante RNasa P y el nucleótido situado en el lado 5' de la región
de pares de bases. Id.
En un procedimiento alternativo para restaurar la
fertilidad masculina, las plantas transgénicas con esterilidad
masculina contienen un vector de expresión que, además de un
secuencia promotora unida operativamente a un gen de avidina,
también contiene un elemento regulador procariótico. Se producen
plantas transgénicas con fertilidad masculina que expresan un
polipéptido procariótico bajo el control del promotor. En los
híbridos F1, el polipéptido procariótico se une a la secuencia
procariótica reguladora y reprime la expresión de avidina.
Por ejemplo, el sistema operador gen LexA/Lex A
se puede usar para regular la expresión génica según la presente
invención. Véase J.S. Patente Nº.: 4.833.080 ("la Patente
'080") y Wang y col., Mol. Cell Biol. 13: 1805
(1993). Más específicamente, el vector de expresión de la planta con
esterilidad masculina contendría la secuencia operadora LexA,
mientras que el vector de expresión de la planta con fertilidad
masculina contendría las secuencias codificantes del represor LexA.
En el híbrido F1, el represor LexA uniría a la secuencia operadora
de LexA e inhibiría la transcripción del gen de avidina.
Las moléculas de DNA del operador LexA se pueden
obtener, por ejemplo, sintetizando fragmentos de DNA que contienen
la secuencia del operador LexA bien conocida. Véase, por ejemplo, la
Patente '080 y Garriga y col., Mol. Gen. Genet. 236:
125 (1992). El gen LexA se puede obtener sintetizando una molécula
de DNA que codifica el represor LexA. Las técnicas de síntesis
genética se discuten anteriormente y las secuencias génicas de LexA
se describen, por ejemplo, por Garriga y col., supra.
Alternativamente, las moléculas de DNA que codifican el represor
LexA se pueden obtener a partir del plásmido pRB500, American Type
Culture Collection número de acceso 67758.
Aquellos expertos en la técnica pueden idear
otras estrategias de restauración de la fertilidad masculina usando
sistemas de regulación procarióticos, tales como el sistema represor
lac/operón lac o el sistema represor trp/operón
trp.
Aún otro procedimiento para restaurar la
fertilidad utiliza la alta afinidad de avidina por biotina,
pulverizando las plantas en desarrollo con una disolución de
biotina. La disolución de biotina puede comprender una mínima
cantidad de un codisolvente orgánico tal como DMSO para asegurar la
solubilidad completa de la biotina. Sin embargo, la disolución de
biotina puede no contener ningún codisolvente orgánico. La
pulverización puede comenzar tan pronto como la fase inicial de
desarrollo del polen. La pulverización puede comenzar también más
tarde en el desarrollo del polen. La pulverización se repite
generalmente a intervalos regulares hasta que se observa la emisión
del polen. Los intervalos entre pulverización variarán entre 1 y 7
días. En una realización preferida de la invención, la
pulverización se repite cada 3-5 días.
Las semillas híbridas con una o más
características de grano o semilla deseadas se pueden producir
ventajosamente usando las líneas vegetales con esterilidad masculina
como se describe anteriormente. Una línea transgénica que lleva el
gen de avidina se cruza como el progenitor femenino con esterilidad
masculina con una planta polinizadora con fertilidad masculina la
cual lleva uno o más genes para una característica de grano o
semilla deseada. La línea vegetal polinizadora con fertilidad
masculina es preferiblemente homocigótica para el/los gene(s)
que controlan la característica de grano o semilla deseada. Las
semillas híbridas tienen característica de grano o semilla deseada
producida por medio de este procedimiento y se cosechan. El
procedimiento para la producción de semillas híbridas en las cuales
un progenitor con esterilidad masculina se cruza con una línea
polinizadora con fertilidad masculina se menciona algunas veces como
el procedimiento de cruzamiento principal. Véase, por ejemplo, la
Patente de los Estados Unidos Nº.: 5.196.636.
Las líneas con esterilidad masculina y con
fertilidad masculina cruzadas para producir las semillas híbridas de
la presente invención pueden ser cualquier combinación de líneas
híbridas, endogámicas o sintéticas. Una línea transgénica que lleva
el gen de avidina unido operativamente a un promotor constitutivo e
inducible se produce usando los procedimientos anteriormente
descritos. La línea con esterilidad masculina puede llevar una o más
copias del gen de avidina.
Una línea con esterilidad masculina la cual lleva
el gen de avidina se puede autocruzar suprimiendo la fertilidad
masculina mediante cualquiera de los procedimientos anteriormente
descritos. Por ejemplo, las ribozimas se pueden diseñar para
expresar actividad endonucleasa que está dirigida a una cierta
secuencia diana en la molécula de RNAm de avidina. El gen que
codifica la ribozima se une operativamente a un promotor inducible.
La planta con esterilidad masculina se trata con el inductor, la
ribozima se expresa, y el RNAm de avidina inactivado conduce a la
restauración de la fertilidad masculina. Alternativamente, la
fertilidad se restaura mediante el uso de una secuencia de
nucleótidos que codifica un RNA antisentido. La unión de moléculas
de RNA antisentido para marcar moléculas de RNAm da como resultado
detención mediante hibridación de traducción. Una molécula de RNA
antisentido adecuada tendría una secuencia que es complementaria a
RNAm de avidina. En una realización preferida de la invención, el
RNA antisentido está bajo el control de un promotor inducible. La
activación de este promotor permite después la restauración de la
fertilidad masculina.
En una aproximación alternativa adicional, los
transcriptos de RNA capaces de promover escisión mediada por RNasa P
de moléculas de RNAm de avidina se producen en la línea con
esterilidad masculina. De acuerdo con esta aproximación, se puede
construir una secuencia guía externa para dirigir la ribozima
endógena, RNasa P, a RNAm de avidina, la cual se escinde
subsiguientemente mediante la ribozima celular. Los transcriptos de
la secuencia guía externa se unen a las especies de RNAm marcados
mediante la formación de pares de bases entre el RNAm y las
secuencias guía externas complementarias, promoviendo así la
escisión de RNAm mediante RNasa P al nucleótido localizado en el
lado 5' de la región de las bases emparejadas.
En aún otra aproximación para restaurar la
fertilidad masculina, se producen líneas vegetales con esterilidad
masculina transgénicas las cuales contienen un vector de expresión
que, además de una secuencia promotora unida operativamente a un gen
de avidina, también contiene un elemento regulador procariótico. Se
producen líneas transgénicas que contienen este gen de avidina
conjuntamente con un gen que codifica un gen procariótico unido
operativamente a un promotor inducible. La línea vegetal transgénica
se trata con inductor para producir el polipéptido procaritótico el
cual se une a la secuencia reguladora procariótica, reprimiendo la
expresión de avidina y restaurando la fertilidad masculina.
Aún otro procedimiento para restaurar la
fertilidad utiliza la alta afinidad de avidina por biotina. Las
líneas estériles masculinas trasgénicas se pulverizan con una
disolución de biotina. La biotina se une a la avidina y la inactiva
restaurando de este modo la fertilidad masculina. Las líneas
transgénicas con esterilidad masculina se pulverizan generalmente
con biotina al mismo tiempo que comienza la fase meiótica del
desarrollo del polen aunque la pulverización con biotina pueda
comenzar más tarde. En una realización preferida, la supresión de
la esterilidad masculina se logra pulverizando la planta con
biotina.
Las líneas polinizadoras con esterilidad
masculina o con fertilidad masculina utilizadas para la producción
de semillas híbridas con una característica deseada de grano o
semilla, de acuerdo con los procedimientos de la presente invención,
son líneas endogámicas, líneas híbridas, líneas polinizadas de forma
abierta sintéticas o reserva genética. Las líneas endogámicas,
líneas híbridas, líneas polinizadas de forma abierta sintéticas o
reserva genética se producen mediante cualquiera de los
procedimientos bien conocidos por los productores de plantas
expertos. Véase, por ejemplo, J.M. Poehlman, BREEDING FIELD
CROPS, 3ª edición (Van Nostrand y Reinhold, Nueva York, NY,
1987). Los cruces de prueba entre líneas seleccionadas endogámicas
y/o híbridas se hacen para evaluar capacidad de combinación
específica. Se identifican las combinaciones aceptables
comercialmente.
Se selecciona una línea vegetal polinizadora con
fertilidad masculina la cual (1) lleva uno o más genes para una
característica deseada de grano o semilla y (2) es compatible con la
línea con esterilidad masculina con la cual se cruzará. El/los
gene(s) que controlan la característica de grano o
característica de semilla seleccionada puede(n) ser
dominante(s) de tal forma que la característica se expresa
fácilmente en las semillas híbridas. Sin embargo, el/los
gene(s) que controlan la característica de grano o
característica de semilla seleccionada puede(n) ser
recesivo(s). En el caso de que el/los gene(s) que
controlan la característica de grano o de semilla de interés
sea(n) recesivo(s), la línea con esterilidad masculina
y la línea polinizadora se cultivan cada una para llevar este
recesivo. En el caso de que el/los gene(s) que
controla(n) la característica de interés de grano o semilla
sea(n) recesivo(s), tanto el estéril como macho como
el polinizador son preferiblemente homozigotos para el/los
gene(s) de tal forma que el fenotipo deseado se exprese en
todas las semillas producidas mediante el cruce. De acuerdo con
ello, las líneas con esterilidad masculina y polinizadora con
fertilidad masculina pueden cada una de ellas llevar genes los
cuales controlan una característica de grano o semilla en las
semillas de la progenie. El/los gene(s) para la
característica de grano o semilla deseada se introducen en la línea
con esterilidad masculina o la línea polinizadora con fertilidad
masculina mediante procedimientos de cultivo tradicionales y/o
técnicas de ingeniería genética.
La característica deseada de grano o semilla es
una característica nutricional o fisiológica de la semilla la cual
afecta significativamente el tipo industrial, la germinación o la
resistencia a enfermedades. La característica deseada de grano o
semilla incluye características tales como contenido en aceite,
proteína y almidón, igual que calidad de proteínas y tipo de
almidón. Los procedimientos de la invención actual se usan para
producir tipos de semillas o granos especializados los cuales se
usan en mercados diferentes. Se usa maíz con alto contenido en
aceite, por ejemplo, para reemplazar grasas animales añadidas a la
alimentación del ganado. Se usa maíz con alto contenido en amilosa
para fabricar adhesivos, películas plásticas degradables y material
de empaquetamiento. Se usa almidón de maíz ceroso en muchos
alimentos diferentes tales como sopas y pudines.
La línea polinizadora con fertilidad masculina
puede llevar uno o más genes que afectan características de almidón
y proteínas. Los genes los cuales afectan a las características de
almidón y proteínas incluyen, pero no se limitan a, azucarado
(su), extendedor de amilosa (ae), frágil (bt),
apagado (du), harinoso (fl), opaco (o), calloso
(h), encogido (sh) y ceroso (wx). Véase, por
ejemplo, Hannah y col., Sci. Hortic. 55:
177-197 (1993). Se han caracterizado las propiedades
de almidón obtenido a partir de plantas de maíz homocigóticas
recesivas para ae, du, wx, ae y
aewx. Véase Brockett y col., Starch/Starke 40:
175-177 (1988) y Patente de los Estados Unidos Nº.:
5.516.939.
Alternativamente, la línea polinizadora se puede
transformar con un gen que afecta al contenido en almidón. Por
ejemplo, el polinizador con fertilidad masculina se puede
transformar con un gen bacteriano que codifica
ADP-glucosa-fosforilasa la cual se
activa en la presencia de metabolitos los cuales inhiben la enzima
vegetal. La semilla resultante tiene un contenido más elevado en
almidón. Véase Sivak y col., J. of Environ. Polymer
Degradation 3(3): 145-152
(1995).
La línea polinizadora puede llevar uno o más
genes que afectan el contenido en ácidos grasos. Por ejemplo, el gen
fan1 que controla ácido graso linolénico bajo en soja.
Hammond y col., Crop Sci. 231: 192 (1993). El, gen
fas controla el contenido de ácido graso esteárico alto en
soja. Graef y col., Crop Sci. 25: 1076 (1985). Los
genes fap1 y fap2 controlan el contenido de ácido
palmítico bajo y el contenido de ácido palmítico alto,
respectivamente, en soja. Ericson y col., Crop Sci.
18: 644 (1988).
La línea polinizadora se puede transformar con un
gen el cual afecta el contenido de aceite de la semilla. Por
ejemplo, la línea polinizadora puede llevar un gen que codifique
proteína transportadora de estearoilo-acilo
(estearoilo-ACP) desaturasa la cual cataliza la
primera etapa de desaturación en la biosíntesis de aceite en
semillas. El gen de la estearoilo-ACP desaturasa se
puede unir operativamente a un promotor específico de semillas. Las
plantas tales como girasol, maíz, colza o soja transformadas con el
gen de la estearoilo-ACP desaturasa produce niveles
de ácido esteárico alterados y se pueden usar para producir aceite
de semillas que contiene niveles modificados o alterados de ácidos
grasos saturados e insaturados. Véase, por ejemplo, la Patente de
los Estados Unidos Nº.: 5.443.974.
Alternativamente, la línea polinizadora puede
llevar un gen antisentido el cual inhibe la expresión de un gen
diana en la ruta biosintética de la característica del grano o
semilla. Por ejemplo, la línea polinizadora lleva un gen
antisentido que inhibe la expresión de
estearoilo-ACP desaturasa. El gen antisentido se
puede unir operativamente a un promotor de semilla específico. Las
plantas transformadas con el gen antisentido de la
estearoilo-ACP desaturasa producen niveles
incrementados de estearato en semillas. Véase, por ejemplo, Knutzon
y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
2624-2628 (1992).
La razón de las semillas plantadas del progenitor
con esterilidad masculina frente a las del progenitor polinizador
con fertilidad masculina en el campo de producción de semillas de
acuerdo con el procedimiento del Cruzamiento Principal depende de
las genéticas de cada progenitor y se varía con el fin de optimizar
la producción. La razón del progenitor con esterilidad masculina
frente al progenitor polinizador con fertilidad masculina varía de
aproximadamente 6:1 a aproximadamente 9:1. Preferiblemente, la razón
del progenitor con esterilidad masculina frente al progenitor
polinizador con fertilidad masculina es aproximadamente 8:1. Más
preferiblemente, la razón del progenitor con esterilidad masculina
frente al progenitor polinizador con fertilidad masculina es
aproximadamente 9:1.
Los siguientes ejemplos no son realizaciones de
la invención.
Un procedimiento para la formación de plantas de
maíz transgénico se ha descrito en la Solicitud de Patente Europea
Nº.: 0 442 174A1. Sigue una breve descripción de esa
metodología.
PHI5168, un vector que lleva el gen de avidina
bajo el control del promotor de ubiquitina y contiene también una
secuencia terminadora de PINII, se usó para formar plantas de maíz
transgénico. La estructura de PHI5168 se muestra en la figura 1.
PHI610, un vector de expresión que lleva el gen bar bajo
control del promotor 35S doble, y que lleva también una secuencia
terminadora de PINII, se cotransformó junto con el constructo de
avidina, permitiendo la selección de plantas transgénicas mediante
tratamiento de la muestra de transformación con bialofos. La
estructura de PHI610 se muestra en la figura 2. Los dos vectores de
expresión se transformaron en cultivos de suspensión embriogénica
derivándose del cultivo embriogénico de tipo II de acuerdo al
procedimiento de Green y col., Molecular Genetics of Plants and
Animals, editores Downey y col., Academic Press, NY, 20, 147
(1983). Los cultivos se mantuvieron en medio de Murashige y Skoog
("MS") como se describe en Murashige y col., Physio.
Plant 15: 453 (1962) suplementado con ácido
2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 2
mg/l y sacarosa a 30 g/l. Los cultivos de suspensión se hicieron
pasar a través de un tamiz de 710 micrómetros 7 días antes del
experimento y el filtrado se mantuvo en medio MS.
Las células se cosecharon a partir del cultivo en
suspensión mediante filtración a vacío sobre un embudo Buchner
(Whatman Nº.: 614), y 100 ml (peso fresco) de células se situaron en
una placa de Petri de 3,3 cm. Las células se dispersaron en 0,5 ml
de medio de cultivo fresco para formar una capa fina de células. La
placa de Petri no cubierta se situó en una cámara de muestras de un
dispositivo de disparo de partículas elaborado por Biolistics Inc.
(Geneva, NY). Se usó una bomba de vacío para reducir la presión en
la cámara a 0,1 atmósferas para reducir la deceleración de las
micropartículas por la fricción del aire. Las células bombardeadas
con partículas de tungsteno tienen un diámetro medio de
aproximadamente 1,2 micrómetros (GTE Sylvania Precision Materials
Group, Towanda, Pennsylvania). Una mezcla igual de PHI5168 y PHI610
se cargó sobre las micropartículas añadiendo 5 \mul de una
disolución de DNA (1 \mul de DNA por 100 lamda) en tampón TE a pH
7,7 a 25 \mul de una suspensión de 50 mg de partículas de
tungsteno por ml de agua destilada en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
Las partículas llegan a agregarse y asentarse en el tubo.
Se cultivaron cultivos de células vegetales
transformadas que contienen los genes extraños durante
4-8 semanas en 56OR (medio) (medio basado en N6 con
bialafos a 1 mg/ml). Este medio selecciona células que expresan el
gen bar.
La formación de embriones se indujo entonces en
los cultivos embriogénicos y las células germinaron en plantas Se
usó una secuencia de dos medios de cultivo para hacer germinar los
embriones somáticos observados en medio de mantenimiento de callos.
Los callos se transfirieron primero a un medio de cultivo (medio de
maduración) que contiene 5,0 mg/l de ácido indolacético (IAA)
durante 10 a 14 días mientras continúa la proliferación en los
callos. La carga de los callos fue a 50 mg por placa para optimizar
la recuperación por unidad de masa de material.
Los callos se transfirieron después desde medio
de "maduración" a un segundo medio de cultivo que contiene un
nivel reducido de IAA (1 mg/l) comparado con el primer medio de
cultivo. Los cultivos se ponen a la luz en este punto. Los embriones
somáticos que germinan se caracterizaban por un brote verde que se
elongaba conectando con un acceso de raíz. Los embriones somáticos
se transfirieron después a un medio en un tubo de cultivo (150 x 25
mm) durante unos 10-14 días adicionales. En este
momento, las plantas eran de aproximadamente 7-10
cm de altas, y eran de tamaño y vigor suficiente para acostumbrarse
a condiciones de invernadero.
Para acostumbrar a plantas regeneradas, las
plantas para transferirse a la cámara de crecimiento se eliminaron
de los contenedores estériles y el medio agar solidificado se aclaró
de las raíces. Las plántulas se situaron en una mezcla de maceta
comercial en una cámara de crecimiento con un dispositivo
nebulizador para mantener la humedad relativa cerca del 100% sin
humedecer excesivamente las raíces de las plantas. Después de
3-4 semanas en la cámara nebulizadora las plantas
fueron suficientemente robustas para transplantarse en las
condiciones del
campo.
campo.
Las plantas en el campo se analizaron observando
esterilidad masculina. Las plantas seleccionadas se analizaron
después adicionalmente en busca de la presencia del gen de avidina
mediante PCR y realización de prueba de bandas de Southern, y en
busca de la expresión de avidina mediante ELISA, mediante
procedimientos estándar.
Se analizaron noventa y cuatro plantas mediante
PCR, 53 de las cuales se encontró que eran fértiles y 41 estériles.
Cuando la fertilidad de cada planta se comparó a la presencia en el
gen de avidina mediante PCR, se halló un 98% de correlación entre
presencia del gen y esterilidad de la planta. Se analizaron en
detalle 5 plantas en busca de la presencia del gen de avidina
realizando prueba de bandas de Southern. Todas las tres plantas
mostraron esterilidad. Dos plantas que no tenían el gen de avidina
fueron completamente fértiles. Hubo así un 100% de correlación entre
la presencia del gen de avidina y la esterilidad masculina.
Un procedimiento para formar plantas de soja
transgénicas es aquel descrito en la Solicitud de Patente de los
Estados Unidos con Nº. de Serie: 07/920.409. Se esteriliza en
superficie semilla de soja (con glicina máxima), de la variedad
Pioneer 9341, mediante exposición a gas de cloro desarrollada en un
bote con forma de campana de vidrio. El gas se produce añadiendo 3,5
ml de ácido clorhídrico (del 34 al 37% p/p) a 100 ml de hipoclorito
de sodio (5,25% p/p). La exposición es durante 16 a 20 horas en un
contenedor de aproximadamente 0,028 m^{3} (1 pie cúbico) en
volumen. La semilla esterilizada en superficie se almacena en placas
de Petri a temperatura ambiente. La semilla se germina plaqueando un
medio solidificado de agar de 1/10 de fuerza de acuerdo a Gambourg
(medio basal B5 con compuestos orgánicos mínimos, Nº. del Catálogo
de Sigma Chemical G5893, sacarosa a 0,32 gm/l; ácido
2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) al 0,2%
peso/volumen, (3,0 mM)) sin reguladores de crecimiento vegetal y
cultivándose a 28º con una duración del día de 16 horas e
iluminación fluorescente blanca fría de aproximadamente 20
\muEm^{-2} \cdot s^{-1}. Después de 3 ó 4 días, se preparó
la semilla mediante cocultivo. La cubierta de la semilla se eliminó
y el radical que se elonga se retiró de 3 a 4 milímetros bajo los
cotiledones.
Los cultivos durante toda una noche de la cepa
LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens que dan cobijo a un
plásmido binario modificado que contiene el gen de avidina se dejan
crecer a fase logarítmica en medio A mínimo que contiene
tetraciclina, a 1 \mug/ml, y se almacenan y se toma una medida de
densidad óptica a 550 nm. Se sitúa suficiente volumen del cultivo en
tubos de 15 ml/cónicos de centrífuga tales que tras la
sedimentación se recogen entre 1 x 10^{10} y 2 x 10^{10}
células en cada tubo con 10^{9} células/ml. La sedimentación es
mediante centrifugación a 6.000 x g durante 10 minutos. Después de
la centrifugación, se decanta el sobrenadante y los tubos se
mantienen a temperatura ambiente hasta que se necesita el inóculo,
pero no más de 1 hora.
Las inoculaciones se llevan a cabo en tandas
tales que cada placa de semillas se trata con un sedimento
recientemente resuspendido de Agrobacterium. Los sedimentos
bacterianos se resuspendieron individualmente en 20 ml de medio de
inoculación, que contiene sales B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, al
2,0% p/v; 6-bencilaminopurina (BAP), a 45 \mum;
ácido indolbutírico (IBA), a 0,5 \muM; acetosiringona (AS), a 100
\muM; tamponado a pH 5,5 con 10 mM de MES. La resuspensión se
logró agitando. El inóculo se vertió después en una placa de Petri
que contiene semilla preparada y los nódulos de los cotiledones se
maceraron con una cuchilla quirúrgica. Esto se logró dividiendo las
semillas por la mitad mediante sección longitudinal a través del
ápice del brote, preservando los dos cotiledones completos. Las dos
mitades del ápice del brote se desprendieron después de sus
respectivos cotiledones separándolos con una cuchilla quirúrgica. El
nódulo de los cotiledones se maceró después con una cuchilla
quirúrgica rayando una vez y otra a lo largo del eje de simetría. Se
tomó cuidado para no cortar enteramente a través del explante al eje
axial. Los explantes se prepararon en 5 minutos aproximadamente y
después se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con
bacteria pero sin agitación. Después de 30 minutos, los explantes se
transfirieron a placas del mismo medio solidificado con Gelrita
(Merck & Company, Inc.), al 0,2% p/v. Los explantes se
incrustaron con el lado adaxial arriba y se nivelaron con la
superficie del medio y se cultivaron a 22ºC durante 3 días bajo luz
fluorescente blanca fría, de aproximadamente 20
\muEm^{2}s^{-1}.
Después de 3 días, los explantes se mueven a
medio de contraselección líquido que contiene sales de B5 (G5893), a
3,2 g/l; sacarosa, al 2% p/v; BAP, a 5 \muM; IBA, a 0,5 \muM;
vancomicina, a 200 \mug/ml; cefotaxima, a 500 \mug/ml;
timentina, a 30 \mug/ml, tamponado a pH 5,7 con MES, a 3 mM. Los
explantes se lavaron en cada placa de Petri con agitación giratoria
a temperatura ambiente durante 4 días. El medio de contraselección
se cambia 4 veces.
Los explantes se cogieron entonces a medio de
selección de agarosa solidificado que contiene sales de B5 (G5893),
a 3,2 g/l; sacarosa, al 2% p/v; BAP, a 5 \muM; IBA, a 0,5 \muM;
sulfato de kanamicina, a 50 \mug/ml; vancomicina, 100 \mug/ml;
cefotaxima, 30 \mug/ml; y timentina, 30 \mug/ml, tamponado a pH
5,7 con MES, 3 mM. El medio de selección se solidificó con Agarosa
Seakem, al 0,3% p/v. Los explantes se incrustan en el medio, con el
lado adaxial debajo y se cultivan a 28ºC con un día de 16 horas de
duración en iluminación fluorescente blanca fría de 60 a 80
\muEm^{2}s^{-1}.
Después de 2 semanas los explantes se lavan de
nuevo con medio líquido en el agitador giratorio. El lavado se lleva
a cabo durante toda una noche en medio contraselección que contiene
sulfato de kanamicina, a 50 \mug/ml. El día siguiente, los
explantes se recogieron a un medio de selección de
agarosa/solidificado. Se incrustan en el medio con el lado adaxial
hacia abajo y se cultivan durante otro periodo de 2 semanas.
Después de 1 mes en medio de selección, el tejido
transformado es visible en sectores verdes del tejido que se
regenera frente a un precedente de tejido no saludable decolorado.
Los explantes sin sectores verdes se descartan y los explantes con
sectores verdes se transfieren a medio de elongación que contiene
sales B5 (G5893), a 3,2 g/l; sacarosa, al 2% p/v; IBA a 3,3 \muM;
ácido giberélico, 1,7 \muM; vancomicina, 100 \mug/ml;
cefotaxima, 30 \mug/ml; y timentina, 30 \mug/ml, tamponado a pH
5,7 con MES, 3 mM. El medio de elongación se solidifica con Gelrita,
al 0,2% p/v. Los sectores verdes se incrustan con el lado adaxial
arriba y se cultivan como antes. El cultivo se continúa en este
medio con transferencias a placas frescas cada dos semanas. Cuando
los brotes son de 0,5 cm de longitud se escinden en la base y se
sitúan en medio de arraigado en tubos de ensayo de 13 x 100 ml. El
medio de arraigado consta de sales de B5 (G5893), a 3,2 g/l;
sacarosa, a 15 g/l; ácido nicotínico, a 20 \muM, ácido
piroglutámico (PGA), a 900 mg/l e IBA, a 10 \muM. El medio de
arraigado se tampona a pH 5,7 con MES, a 3 mM y se solidificó con
Gelrita al 0,2% p/v. Los sectores verdes se incrustan con el lado
adaxial hacia arriba y se cultivan como anteriormente. El cultivo se
continúa en este medio con transferencias a placas frescas cada dos
semanas. Cuando los brotes don de 0,5 cm de longitud se escinden en
la base y se sitúan en medio de arraigado en 13 tubos de ensayo de
100 ml. El medio de arraigado consta de sales de B5 (G5893), a 3,2
g/l; sacarosa, a 15 g/l; ácido nicotínico, a 20 \muM, ácido
piroglutámico (PGA), a 900 mg/l e IBA, a 10 \muM. El medio de
arraigado se tampona a pH 5,7 con MES, a 3 mM y se solidificó con
Gelrita al 0,2% p/v. Después de 10 días, los brotes se
transfirieron al mismo medio sin IBA o PGA. Los brotes se arraigan y
mantienen en estos tubos bajo las mismas condiciones ambientales
como anteriormente.
Cuando un sistema radicular está bien
establecido, la plántula se transfiere a suelo estéril. La
temperatura, el fotoperiodo y la intensidad lumínica siguen siendo
los mismos que anteriormente.
La expresión de avidina en plantas de soja
transgénicas se confirma y cuantifica mediante ELISA, y la presencia
del gen se confirma mediante PCR y prueba de manchas de Southern. La
estabilidad de la expresión se puede evaluar mediante estos mismos
procedimientos durante generaciones sucesivas. Se encuentra que los
problemas de esterilidad correlacionan con la expresión de avidina
en las sojas.
Un cartucho de expresión que codifica avidina se
usó para generar plantas y semillas de girasol transgénicas. La
secuencia de DNA que codifica para avidina se insertó dentro de un
cartucho de expresión bajo el control del promotor de ubiquitina.
Este cartucho de expresión se subclonó después dentro de un vector
binario tal como PHI 5765 usando el sitio EcoR1. El vector binario
se transfirió después dentro de una cepa ayudante de
Agrobacterium tumefaciens.
Las plantas de girasol se transformaron con la
cepa LBA4404 de Agrobacterium después del bombardeo con
micropartículas como se describe por Bidney y col., Plant. Mol.
Biol. 18: 301 (1992). Brevemente, las semillas de la
Línea SMF-3 de Girasol Pioneer se descascarillan y
se esterilizan en su superficie. Las semillas se imbuyen en papel
de filtro humedecido con agua en la oscuridad a 26ºC durante 18
horas. Los cotiledones y el radical de la raíz se eliminan y los
explantes meristemáticos se cultivan en medio 374BGA (sales MS,
vitaminas Shepard, sulfato de adenina a 40 mg/l, sacarosa al 3%,
fitagar al 1,8% a pH 5,6 más 0,5 mg/ml de BAP, IAA a 0,25 mg/l, y GA
a 0,1 mg/l). Veinticuatro horas más tarde, las hojas primarias se
eliminan para exponer el meristemo apical y los explantes se sitúan
con el domo apical orientado hacia arriba en un círculo de 2 cm en
el centro de una placa de Petri de 60 mm por 20 mm que contiene agar
con agua. Los explantes se bombardean dos veces con partículas de
tungsteno suspendidas en tampón TE o con partículas asociadas con un
plásmido de expresión que contiene el gen de avidina. Los explantes
meristemáticos se co-cultivan en medio 374BGA a la
luz a 26ºC durante 72 horas adicionales de
co-cultivo.
Los meristemos tratados con Agrobacterium
se transfieren después del periodo de co-cultivo de
72 horas a medio 374 (374BGA con sacarosa al 1% y nada de BAP, IAA o
GA_{3}) y se suplementan con cefalotaxima a 250 \mug/ml. Las
plántulas se dejan desarrollar durante dos semanas adicionales bajo
condiciones de incubación de 16 horas de día y 26ºC para tomar color
verde o decolorarse. Las plántulas se transfieren a medio que
contiene kanamicina y se dejan crecer. Se confirma y cuantifica la
presencia de avidina en las plantas como se describe en el ejemplo
2. Se encuentra que la presencia de esterilidad masculina
correlaciona con la expresión de avidina por las plantas.
Claims (18)
1. Una molécula de DNA aislada que comprende un
promotor específico de anteras unido operativamente a una secuencia
nucleotídica que codifica estreptavidina.
2. Un vector de expresión que comprende la
molécula de DNA aislada de la reivindicación 1.
3. Una planta transgénica en la que dicha planta
comprende dicho vector de expresión de la reivindicación 2.
4. Una planta transgénica de la reivindicación 3,
en la que dicha planta se selecciona del grupo que consta de maíz,
soja y girasol.
5. El vector de expresión de la reivindicación 2,
en el que una secuencia nucleotídica que codifica una secuencia
señal está operativamente unida a dicha secuencia nucleotídica que
codifica estreptavidina.
6. El vector de expresión de la reivindicación 5,
en el que dicha secuencia señal es la secuencia señal de la
alfa-amilasa de cebada.
7. Un procedimiento para producir una planta
masculina estéril, que comprende introducir dentro de las células
vegetales un vector de expresión que comprende un promotor
operativamente unido a una secuencia de nucleótidos que codifica
estreptavidina y regenera una planta transgénica a partir de dichas
células transformadas, en el que dicho promotor controla la
expresión de dicho gen, y donde la expresión de dicho gen causa la
esterilidad masculina de dicha planta transgénica.
8. Un procedimiento que usa un gen de
estreptavidina para producir una planta transgénica híbrida con
fertilidad masculina, que comprende las etapas de:
(a) producir una primera planta progenitora con
esterilidad masculina progenitora que comprende una molécula de DNA
que comprende un promotor operativamente unido a una secuencia
nucleotídica que codifica estreptavidina en la que la expresión de
dicha estreptavidina causa esterilidad masculina;
(b) producir una segunda planta transgénica
progenitora que expresa un segundo gen; y
(c) fertilizar de forma cruzada dicho primer
progenitor con dicho segundo progenitor para producir una planta
híbrida;
en el que dicha planta híbrida expresa dicho
segundo gen extraño, y en el que el producto de dicho segundo gen
extraño reduce la expresión de estreptavidina en dicha planta
híbrida, produciendo de este modo una planta híbrida con fertilidad
masculina.
9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el
que dicho segundo gen extraño se selecciona del grupo que consta de
un gen antisentido, un gen de ribozima y un gen de secuencia externa
guía.
10. El procedimiento de la reivindicación 8, en
el que dicha molécula de DNA de dicha primera planta progenitora
comprende adicionalmente un operador LexA el cual está unido
operativamente a dicho promotor, y en el que dicho gen extraño es el
gen represor LexA.
11. Un procedimiento para producir semillas que
tienen una característica de grano deseada, que comprende las etapas
de:
(a) producir una primera planta progenitora la
cual es estéril como macho y comprende una secuencia de nucleótidos
que codifica estreptavidina operativamente unida a una secuencia
promotora;
(b) producir una segunda planta progenitora la
cual es fértil como macho y lleva uno o más genes que controlan
dicha característica de grano deseada;
(c) fertilizar de forma cruzada dicho primer
progenitor con dicho segundo progenitor para producir semillas
híbridas con dicha característica de grano; y
(d) cosechar dichas semillas.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que dicha planta progenitora es una planta híbrida.
13. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que dicha característica de grano se selecciona del grupo que
consta de contenido de aceite, proteína y almidón.
\newpage
14. El procedimiento de la reivindicación 11, en
el que dicha primera y segunda planta se seleccionan del grupo que
consta de maíz, soja, colza y girasol.
15. El procedimiento de las reivindicaciones 8 u
11, en las que dicha secuencia promotora es una secuencia promotora
específica de anteras que comprende una caja de anteras seleccionada
del grupo que consta de:
(a) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 1;
(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 2;
(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 3; y
(d) un fragmento funcional de (a), (b) o (c).
16. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicha caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de
SEQ. ID Nº.: 1, y en el que dicho promotor específico de anteras
comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo
que consta de:
(a) promotor esencial 35S de CaMV;
(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4;
(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5;
(d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y
(e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d).
17. El procedimiento de la reivindicación 15, en
el que dicha caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de
SEQ. ID Nº.: 2, y en el que dicho promotor específico de anteras
comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo
que consta de:
(a) promotor esencial 35S de CaMV;
(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4;
(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5;
(d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y
(e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d).
18. El procedimiento de la reivindicación 14, en
el que dicha caja de anteras tiene la secuencia de nucleótidos de
SEQ. ID Nº.: 3, y en el que dicho promotor específico de anteras
comprende adicionalmente un promotor esencial seleccionado del grupo
que consta de:
(a) promotor esencial 35S de CaMV;
(b) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 4;
(c) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 5;
(d) una molécula de DNA que tiene la secuencia de
nucleótidos de SEQ. ID Nº.: 6; y
(e) un fragmento funcional de (b), (c) o (d).
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/893,049 US5962769A (en) | 1995-06-07 | 1997-07-14 | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin |
US893049 | 1997-07-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2253813T3 true ES2253813T3 (es) | 2006-06-01 |
Family
ID=25400941
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES98918556T Expired - Lifetime ES2253813T3 (es) | 1997-07-14 | 1998-04-22 | Induccion de esterilidad masculina en plantas por la expresion de niveles elevados de estreptavidina. |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5962769A (es) |
EP (1) | EP1000164B1 (es) |
JP (1) | JP2001510052A (es) |
KR (1) | KR20010021940A (es) |
CN (1) | CN1150330C (es) |
AR (1) | AR015402A1 (es) |
AT (1) | ATE310826T1 (es) |
AU (1) | AU742366B2 (es) |
BG (1) | BG104154A (es) |
BR (1) | BR9811697A (es) |
CA (1) | CA2296445A1 (es) |
CR (1) | CR5812A (es) |
DE (1) | DE69832489T2 (es) |
ES (1) | ES2253813T3 (es) |
HU (1) | HU225685B1 (es) |
MX (1) | MXPA00000580A (es) |
NZ (1) | NZ502688A (es) |
RO (1) | RO120920B1 (es) |
SK (1) | SK712000A3 (es) |
TR (1) | TR200000098T2 (es) |
WO (1) | WO1999004023A1 (es) |
ZA (1) | ZA986087B (es) |
Families Citing this family (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL125632A0 (en) * | 1998-08-03 | 1999-04-11 | Israel State | Degeneration and restoration of plant tissue |
CA2354195C (en) * | 1998-12-22 | 2012-07-17 | Dow Agrosciences Llc | Methods and genetic compositions to limit outcrossing and undesired gene flow in crop plants |
DE10015862A1 (de) | 2000-03-30 | 2001-10-11 | Bayer Ag | Polyamidzusammensetzung und Verfahren zu ihrer Herstellung |
US7517975B2 (en) | 2000-09-26 | 2009-04-14 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Nucleotide sequences mediating male fertility and method of using same |
AU2002248325A1 (en) * | 2001-01-04 | 2002-07-16 | Fleit, Lois | Method to maintain a genic male-sterile female parental lines for the production of hybrid wheat |
US20020129399A1 (en) * | 2001-03-09 | 2002-09-12 | Marc Albertsen | Biotin-binding compounds for induction of sterility in plants |
US7230168B2 (en) | 2001-12-20 | 2007-06-12 | The Curators Of The University Of Missouri | Reversible male sterility in transgenic plants by expression of cytokinin oxidase |
FR2836782B1 (fr) * | 2002-03-08 | 2004-06-04 | Biogemma Fr | Nouveau procede de production de semences hybrides de mais |
WO2005001101A1 (en) * | 2003-06-03 | 2005-01-06 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Conditional sterility in plants |
WO2004108903A2 (en) | 2003-06-06 | 2004-12-16 | Arborgen, Llc | Plant transformation and selection |
US7741541B2 (en) * | 2003-07-07 | 2010-06-22 | University Of Delhi South Campus | Method for obtaining improved fertility restorer lines for transgenic male sterile crop plants and a DNA construct for use in said method |
US7696405B2 (en) * | 2003-12-16 | 2010-04-13 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Dominant gene suppression transgenes and methods of using same |
WO2005070088A2 (en) * | 2004-01-15 | 2005-08-04 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. | Chimeric sequences for tissue-specific gene expression in plants |
US7453025B2 (en) * | 2004-09-22 | 2008-11-18 | Arborgen, Llc | Reproductive ablation constructs |
US20060101536A1 (en) * | 2004-11-05 | 2006-05-11 | Arborgen, Llc | Eucalyptus urophylla transformation and regeneration |
EA201070229A1 (ru) | 2007-08-03 | 2010-08-30 | Пайонир Хай - Бред Интернэшнл, Инк. | Нуклеотидные последовательности msca1, влияющие на мужскую фертильность растений, и способ их применения |
US8115060B2 (en) * | 2008-02-22 | 2012-02-14 | Applied Biotechnology Institute, Inc. | Means and methods of controlling plant seed germination |
EP2612918A1 (en) | 2012-01-06 | 2013-07-10 | BASF Plant Science Company GmbH | In planta recombination |
WO2013138309A1 (en) | 2012-03-13 | 2013-09-19 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Genetic reduction of male fertility in plants |
CN104703998B (zh) | 2012-03-13 | 2020-08-21 | 先锋国际良种公司 | 植物中雄性育性的遗传减少 |
EP2781151A1 (en) | 2013-03-18 | 2014-09-24 | Bayer CropScience AG | Methods of separating hybrid seed from a mixture of seeds |
US10428348B2 (en) | 2014-01-02 | 2019-10-01 | Exalt State Holdings Limited | Reproduction of female sterility lines and its application in hybrid seed production |
EP4118955A1 (en) | 2015-03-19 | 2023-01-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions for accelerated trait introgression |
US10934556B2 (en) | 2015-04-16 | 2021-03-02 | Council Of Scientific And Industrial Research | Reversible expression system for transgene expression in plants |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0198015B2 (en) * | 1984-10-02 | 1995-07-19 | Biogen, Inc. | Production of streptavidin-like polypeptides |
US5356799A (en) * | 1988-02-03 | 1994-10-18 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Antisense gene systems of pollination control for hybrid seed production |
ATE112314T1 (de) * | 1988-05-17 | 1994-10-15 | Lubrizol Genetics Inc | Pflanzliches ubiquitinpromotorsystem. |
ATE197816T1 (de) * | 1989-08-04 | 2000-12-15 | Aventis Cropscience Nv | Pflanzen mit modifizierten blüten, samen oder embryos |
DE3926390A1 (de) * | 1989-08-10 | 1991-02-14 | Bayer Ag | Verwendung von lysozym genen in pflanzen zur resistenzerhoehung |
US5225341A (en) * | 1990-07-19 | 1993-07-06 | The Regents Of The University Of California | Biologically safe plant transformation system using a ds transposon |
WO1994000992A1 (en) * | 1992-07-10 | 1994-01-20 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Avidin and homologues as larvicides against insect pests |
US5583210A (en) * | 1993-03-18 | 1996-12-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods and compositions for controlling plant development |
US5837850A (en) * | 1994-04-21 | 1998-11-17 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Regulatory element conferring tapetum specificity |
US5633438A (en) * | 1994-11-22 | 1997-05-27 | Pioneer Hi-Bred International | Microspore-specific regulatory element |
US5795753A (en) * | 1994-12-08 | 1998-08-18 | Pioneer Hi-Bred International Inc. | Reversible nuclear genetic system for male sterility in transgenic plants |
HUP9900885A3 (en) * | 1995-06-07 | 2001-02-28 | Pioneer Hi Bred Int | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin |
US5767379A (en) * | 1995-11-06 | 1998-06-16 | John Howard | Commercial production of avidin in plants |
-
1997
- 1997-07-14 US US08/893,049 patent/US5962769A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-04-22 SK SK71-2000A patent/SK712000A3/sk unknown
- 1998-04-22 KR KR1020007000505A patent/KR20010021940A/ko not_active Application Discontinuation
- 1998-04-22 RO ROA200000048A patent/RO120920B1/ro unknown
- 1998-04-22 MX MXPA00000580A patent/MXPA00000580A/es unknown
- 1998-04-22 DE DE69832489T patent/DE69832489T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-22 BR BR9811697-5A patent/BR9811697A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-04-22 CN CNB988089157A patent/CN1150330C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1998-04-22 EP EP98918556A patent/EP1000164B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-22 AT AT98918556T patent/ATE310826T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-04-22 HU HU0002649A patent/HU225685B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1998-04-22 ES ES98918556T patent/ES2253813T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-04-22 JP JP2000503229A patent/JP2001510052A/ja active Pending
- 1998-04-22 NZ NZ502688A patent/NZ502688A/xx unknown
- 1998-04-22 TR TR2000/00098T patent/TR200000098T2/xx unknown
- 1998-04-22 WO PCT/US1998/008065 patent/WO1999004023A1/en active IP Right Grant
- 1998-04-22 CA CA002296445A patent/CA2296445A1/en not_active Abandoned
- 1998-04-22 AU AU71460/98A patent/AU742366B2/en not_active Ceased
- 1998-07-09 ZA ZA9806087A patent/ZA986087B/xx unknown
- 1998-07-13 AR ARP980103402A patent/AR015402A1/es not_active Application Discontinuation
- 1998-07-14 CR CR5812A patent/CR5812A/es not_active Application Discontinuation
-
2000
- 2000-02-11 BG BG104154A patent/BG104154A/bg unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NZ502688A (en) | 2002-12-20 |
KR20010021940A (ko) | 2001-03-15 |
ZA986087B (en) | 2000-05-16 |
TR200000098T2 (tr) | 2000-11-21 |
WO1999004023A1 (en) | 1999-01-28 |
CA2296445A1 (en) | 1999-01-28 |
BR9811697A (pt) | 2002-01-02 |
RO120920B1 (ro) | 2006-09-29 |
MXPA00000580A (es) | 2005-09-08 |
DE69832489D1 (de) | 2005-12-29 |
CR5812A (es) | 2001-02-15 |
EP1000164B1 (en) | 2005-11-23 |
CN1269837A (zh) | 2000-10-11 |
HUP0002649A2 (hu) | 2000-12-28 |
ATE310826T1 (de) | 2005-12-15 |
EP1000164A1 (en) | 2000-05-17 |
HUP0002649A3 (en) | 2002-01-28 |
AU7146098A (en) | 1999-02-10 |
JP2001510052A (ja) | 2001-07-31 |
AU742366B2 (en) | 2002-01-03 |
DE69832489T2 (de) | 2006-07-20 |
BG104154A (bg) | 2000-08-31 |
AR015402A1 (es) | 2001-05-02 |
SK712000A3 (en) | 2000-08-14 |
HU225685B1 (hu) | 2007-06-28 |
US5962769A (en) | 1999-10-05 |
CN1150330C (zh) | 2004-05-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2253813T3 (es) | Induccion de esterilidad masculina en plantas por la expresion de niveles elevados de estreptavidina. | |
AU708618B2 (en) | Induction of male sterility in plants by expression of high levels of avidin | |
HUT73336A (en) | Methods and compositions for controlling plant development | |
JP2002354954A (ja) | トランスジェニック植物における雄性不稔のための可逆的核遺伝システム | |
BRPI0619837A2 (pt) | método para aumentar o tamanho de semente de uma planta e/ou para aumentar o número de sementes obtenìveis de uma planta, construção genética e métodos para a produção de uma planta transgênica | |
HU225428B1 (en) | Methods for altering organ mass, controlling fertility and enhancing asexual reproduction in plants | |
KR20030031467A (ko) | 트랜스진의 유전을 감소 또는 제거하는 방법 및 조성물 | |
US7439416B2 (en) | Indeterminate gametophyte 1 (ig1)gene from Zea mays and uses thereof | |
BRPI0011101B1 (pt) | Vetor, e, métodos para produzir embriões derivados assexualmente, para modificar a capacidade regenerativa de uma planta, para produzir uma planta apomíctica e para selecionar uma planta modificada | |
JP2002507381A (ja) | 核の雄性不稔性植物、雄性不稔性植物を作出する方法および稔性を回復するための方法 | |
JPH10509023A (ja) | 雄性稔性を仲介するヌクレオチド配列およびその使用方法 | |
US20050120416A1 (en) | Novel method for the production of hybrid maize seeds | |
WO2021137299A1 (ja) | 植物の改変方法 | |
JP4814686B2 (ja) | 雌雄配偶子形成不全植物の作成方法 | |
US7056739B1 (en) | Compositions and methods for modulation of plant cell division | |
AU6442500A (en) | Male sterile plants | |
US20020129399A1 (en) | Biotin-binding compounds for induction of sterility in plants | |
CZ2000182A3 (cs) | Vyvolání samčí sterility u rostlin silnou expresí avidinu | |
MXPA97009731A (es) | Induccion de esterilidad masculina en plantas mediante la expresion de altos niveles de avidina | |
CZ339899A3 (cs) | Ztracené bednění stropů | |
HU221518B (hu) | Hímfertilitást közvetítő nukleotidszekvenciák és eljárások azok alkalmazására |