RO120920B1 - Inducerea sterilităţii masculine la plante, prin exprimarea de niveluri ridicate de streptavidină - Google Patents

Abstract

Invenţia se referă la un procedeu pentru controlarea fertilităţii plantelor, folosind molecule ADN care codifică pentru streptavidină. În special, această invenţie se referă la un procedeu pentru obţinerea de plante transgenice cu sterilitate masculină ce exprimă streptavidină.

Description

Invenția se referă la un procedeu pentru controlarea fertilității plantelor, folosind molecule ADN care codifică pentru streptavidină. în special, această invenție se referă la procedee pentru producerea de plante transgenice cu sterilitate masculină, care exprimă streptavidină. Mai mult, această invenție se referă la procedee pentru restaurarea fertilității masculine, la descendenți de la plante cu sterilitate masculină. De asemenea, invenția se referă la un procedeu de obținere a unor plante hibride cu sterilitate masculină, utilizând gena streptavidină.

Controlul fertilității polenului este esențial în producția recoltei hibride (Vezi, de exemplu, J. M. Poehlman, Breeding field crops, 3^RD ED. (Von Nostrand și Reinhold, New York, NY, 1987)), care este încorporată aici prin referire. în producția de porumb hibrid, de exemplu, controlul fertilității polenului este de obicei însoțit de îndepărtarea fizică a inflorescenței masculine sau mătasei de porumb, înainte de împrăștierea polenului, îndepărtarea manuală a mătăsii de porumb reprezentând un proces foarte laborios. Cu toate că îndepărtarea mecanică a mătăsii de porumb este mai puțin laborioasă decât cea manuală, aceasta este mai puțin sigură și necesită examinarea ulterioară a recoltei și, de obicei, corectarea manuală a îndepărtării mătăsii de porumb. Ambele metode pentru îndepărtarea mătăsii de porumb cauzează o pierdere în randamentul părintelui feminin.

Majoritatea plantelor de cultură interes au totuși ambele organe masculin și feminin funcționale în aceeași floare; de aceea, emasculinizarea nu este o procedură simplă. în timp ce este posibilă îndepărtarea manuală a organelor producătoare de polen înainte ca polenul să fie împrăștiat, această formă de producție hibridă este extrem de laborioasă și scumpă.

Fertilitatea polenului, de asemenea, poate fi controlată prin aplicarea unui spray foliar având proprietăți aametocide masculine. Cross și colab., Sex Plant Reprod. 4.: 235(1991). De exemplu, aplicarea etrelei la antere are drept consecință mitoza polenului adițională la grâu, degenerarea celulelor tapetale la orz și malformarea sau încetarea dezvoltării polenului la Eragrostis. Bennet și colab., Nature240:566 (1972), Colhoun și colab., Plant CellEnviron. 6:21 (1983); Berthe și colab., Crop Sci. 18:35 (1978). Cu toate acestea, abordarea chimică este laborioasă, prezintă probleme potențiale cu toxicitatea substanțelor chimice introduse în mediu și eficiența ei depinde de momentul aplicării.

în plus, producția comercială a seminței hibrid, prin folosirea gametocidelor, este limitată de costul și disponibilitatea substanțelor chimice, precum și de siguranța în acțiune și de durata de acțiune a aplicațiilor. O limitare serioasă a gametocidelor constă în faptul că acestea au efecte fitotoxice, a căror gravitate este dependentă de genotip. Alte limitări includ faptul că aceste substanțe chimice nu pot fi eficiente pentru recolte cu o perioadă extinsă de înflorire, deoarece noile flori produse nu pot fi afectate. în consecință, este necesară aplicarea repetată a substanțelor chimice.

Multe sisteme actuale comerciale de producere a seminței hibrid pentru recolte în câmp se bazează pe o cale genetică de control al polenizării. Plantele care se folosesc ca femele fie nu pot împrăștia polen, fie produc polen care nu este apt biochimic pentru a efectua autofertilizarea, fie nu pot produce polen. Plantele care nu sunt apte pentru autofertilizare sunt numite a fi autoincompatibile. Dificultățile asociate cu folosirea unui sistem de autoincompatibilitate includ disponibilitatea și propagarea autocompatibilității. în unele exemple, autoincompatibilitatea poate fi combătută chimic, sau muguri imaturi pot fi polenizați cu mâna înainte să fie activat mecanismul biochimic care blochează polenul. Sisteme autoincompatibile care pot fi dezactivate sunt deseori foarte vulnerabile la condițiile climatice stresante, care distrug sau reduc eficiența blocării biochimice la autopolenizare.

Sistemele genetice bazate pe controlul polenului și care cauzează sterilitate masculină prezintă un interes mai larg răspândit pentru producerea comercială a semințelor.

RO 120920 Β1

Aceste sisteme sunt de două tipuri generale: (1) sterilitate masculină nucleară, adică imposi- 1 bilitatea formării polenului din cauza mutațiilor în una sau mai multe gene nucleare și (2) sterilitate masculină citoplasmic-genetică, la care se face referire de obicei ca sterilitate 3 masculină citoplasmatică (CMS), în care formarea polenului este blocată sau întreruptă din cauza unei alterări într-o organelă citoplasmică, care, în general, este mitocondria. 5

Sterilitatea nucleară poate fi dominantă sau recesivă. în mod tipic, sterilitatea dominantă poate fi folosită numai pentru formarea seminței hibrid, dacă este posibilă propagarea 7 vegetativă sau clonală a liniei feminine. Sterilitatea recesivă poate fi folosită dacă plantele sterile și fertile se deosebesc ușor. Utilitatea comercială a sistemelor de sterilitate dominantă 9 și recesivă este limitată, totuși, datorită costului înmulțirii clonale și, respectiv, marcarea cu roșu a liniilor feminine ale plantelor autofertile. 11

Cu toate că există scheme de hibridizare care implică utilizarea CMS, există limitări ale valorii lor comerciale. Un exemplu al unui sistem CMS este o mutație specifică în mito- 13 condria localizată citoplasmatic care, pe un fond nuclear inițial adecvat, poate duce la imposibilitatea formării polenului matur. în unele exemple, fondul nuclear poate compensa 15 mutația citoplasmațică și are loc formarea polenului normal pentru Gene de restaurare specifice nucleare care permit formarea polenului în plante cu mitocondria CMS. în general, 17 utilizarea CMS pentru producerea de semințe comerciale implică utilizarea celor trei linii de reproducere: o linie masculin sterilă (părinte feminin), o linie de menținere care este 19 izogenică cu linia masculin sterilă, dar conține mitocondria funcțională întreagă și o linie părinte masculin. Linia părinte masculin poate sau nu poate purta în citoplasmă gene de 21 restaurare specifice.

Pentru recolte cum ar fi legume, pentru care îndepărtarea seminței de la hibrid nu 23 este importantă, un sistem CMS poate fi folosit fără restaurare. La recolte pentru care fructul sau sămânța hibridului este un produs comercial, fertilitatea seminței hibride trebuie să fie 25 restaurată prin gene de restaurare specifice. în părintele masculin sau hibridul masculin steril trebuie să fie polenizat. Polenizarea hibrizilor nerestaurați poate fi realizată prin includerea 27 unui procent mic de plante masculin fertile la polenizarea efectivă. La cele mai multe specii, trăsătura CMS se transmite pe linie maternă, în timp ce toate organelele citoplasmice de 29 obicei sunt moștenite numai de la celula ou.

Sistemele CMS posedă limitări care le pot exclude ca o singură soluție pentru pro- 31 ducerea plantelor masculin sterile. De exemplu, un tip CMS special de porumb (T-citoplasmă) conferă sensibilitate la toxina produsă prin infecție cu o ciupercă specială. Deși folo- 33 site încă pentru un număr de recolte, sistemele CMS se pot epuiza în anumite condiții de mediu înconjurător. 35

De aceea, se pare că o cale de control a producției de polen, prin alte metode decât metodele manuale, mecanice, chimice și genetice tradiționale, este mai mult decât de dorit. 37 în conformitate, un obiect al prezentei invenții este acela de a asigura un procedeu pentru producerea de plante cu sterilitate masculină care sunt aduse în stare de sterilitate 39 prin expresia heteroloagă a streptavidinei.

Un obiect suplimentar al acestei invenții îl reprezintă asigurarea unei gene himerice 41 cuprinzând o secvență ADN care codifică streptavidina care se leagă funcțional la o secvență promotor a plantei. 43

Un alt obiect suplimentar al invenției îl reprezintă producerea unei metode de inversare a sterilității masculine cauzată de expresia streptavidinei. 45

Un alt obiect al invenției îl constituie asigurarea unui procedeu pentru producerea de plante hibride cu sterilitate masculină, utilizând gena streptavidina. 47

RO 120920 Β1

Acestea și alte obiecte sunt realizate în conformitate cu o realizare a prezentei invenții, prin asigurarea unei molecule ADN izolate cuprinzând o secvență nucleotidică ce codifică pentru streptavidină legată funcțional la o secvență promotor a plantei, într-o realizare preferată, secvența ADN izolată este conținută într-un vector de expresie. în altă realizare preferată, secvența promotor a plantei este un promotor constitutiv și în altă realizare preferată, promotorul constitutiv este un promotor ubiguitină. în altă realizare preferată, gena streptavidină este legată funcțional la o secvență semnal de export.

în conformitate cu altă realizare a invenției este asigurată o plantă transgenică, în care planta cuprinde o secvență nucleotidică heteroloagă, care cuprinde o genă streptavidină și în care secvența nucleotidică heteroloagă crește concentrația streptavidinei în țesutul plantei, cauzând sterilitate masculină. în realizări preferate, planta transgenică este o plantă de porumb, o plantă de soia, o plantă de canola, o plantă de floarea-soarelui. în altă realizare preferată, molecula ADN heteroloagă cuprinde suplimentaro secvență promotor constitutivă, care într-o realizare preferată este o secvență promotor de ubiguitină. în altă realizare preferată, molecula ADN heteroloagă cuprinde suplimentar un promotor specific țesutului. Promotorul preferat, în mod special specific țesutului, este un promotor specific anterei.

în conformitate cu alt aspect al invenției, este asigurat un procedeu pentru producerea unei plante transgenice masculin sterile, cuprinzând introducerea în celulele plantei a unui vector de expresie care cuprinde un promotor și o genă streptavidină, în care promotorul controlează expresia genei streptavidină și în care expresia genei streptavidină cauzează sterilitate masculină. într-o realizare preferată, o plantă transgenică este regenerată de la celule de plantă. în altă realizare preferată, promotorul cuprinde un promotor de ubiguitină specific țesutului, sau un promotor inductor.

în conformitate cu altă realizare a invenției, este asigurat un procedeu pentru utilizarea genei streptavidină pentru a produce o plantă hibrid masculin fertilă, incluzând producerea unei prime plante părinte masculin sterilă, care cuprinde o moleculă ADN așa cum s-a descris mai sus, în care expresia streptavidinei cauzează sterilitate masculină, producând o a doua plantă părinte transgenică, exprimând o a doua genă străină și fertilizarea încrucișată a primului părinte cu al doilea părinte pentru a produce o plantă hibrid care exprimă a doua genă străină și în care produsul celei de-a doua gene străine reduce expresia avidinei în planta hibrid, prin aceasta producând o plantă hibrid cu fertilitate masculină.

într-o realizare preferată a acestui aspect al invenției, a doua genă străină este selectată de la grupul constând dintr-o genă antisens, o genă ribozom și o genă secvență orientată spre exterior. în altă realizare preferată, gena antisens cuprinde secvențe ARNm streptavidină, care într-o realizare mai preferată este sub controlul unui promotor inductibil în încă o altă realizare preferată, gena ribozom cuprinde secvența mARN streptavidină. într-o altă realizare preferată, gena secvenței orientată spre exterior cuprinde secvența mARN streptavidină. în încă alte realizări preferate suplimentar, molecula ADN a primei plante părinte cuprinde suplimentar un operator LexA care este legat operațional la numitul promotor, în care a doua genă străină este gena represor LexA. într-o altă realizare preferată, secvența promotor este o secvență promotor specifică anterei, cuprinzând o cutie anteră selectată de la grupul constând din secvența nucleotidică a SEG ID NR:1; secvența nucleotidică a SEQ. ID NR:5; secvența nucleotidică a SEQ ID NR:6 și un fragment funcțional al acestora.

în încă altă realizare preferată a acestui aspect al invenției, SEQ ID NR:4, SEQ ID NR: 5 sau SEQ ID NR:6 și promotorul specific anterei care cuprinde în continuare un promotor principal selectat de la grupul care constă din: promotor principal CaMV 25S;

RO 120920 Β1 secvența nucleotidică a SEQ ID NR:7; secvența nucleotidică a SEQ ID NR:8; secvența 1 nucleotidică a SEQ ID NR:9 și fragmentele funcționale ale acestora.

în conformitate cu alt aspect suplimentar al invenției, este asigurat un procedeu 3 pentru restaurarea fertilității într-o plantă având sterilitate masculină datorită expresiei streptavidinei, cuprinzând pulverizarea pe plantă a unei soluții de biotină. 5 în conformitate cu alt aspect al invenției, este asigurată o metodă pentru producerea semințelor care au una sau mai multe trăsături de interes ale granulei sau seminței. într-o 7 realizare preferată a acestei invenții, o primă plantă părinte, care este masculin sterilă și poartă una sau mai multe copii ale genei streptavidină, este încrucișată ca părinte feminin 9 cu o a două plantă părinte, care este masculin fertilă și poartă una sau mai multe trăsături de interes ale granulei sau seminței. Semințele sunt produse cu trăsături ale granulei sau 11 seminței de la părintele masculin. în realizări preferate, planta părinte este porumb, soia, canola sau floarea-soarelui. în încă o altă realizare preferată a invenției, gena streptavidină 13 este gena strepstreptavidină.

Fig. 1 arată plasmidul PHI5168 care codifică streptavidină, în care un promotor de 15 ubiguitină de la porumb (care include primul său exon plus primul intron) determină expresia secvenței semnal export alfa amilază de la orz și o regiune care codifică streptavidină. 17

Fig. 2 arată plasmidul PHI610 care codifică gena bar.

1. Definiții19 în descrierea care urmează, un număr de termeni sunt folosiți extensiv. Definițiile următoare sunt asigurate pentru a facilita înțelegerea invenției.21

O genă structurală este o secvență ADN care este transcrisă în ARN mesager (ARNm), care apoi este translat într-o secvență de aminoacizi caracteristică unei anumite 23 polipeptide.

O genă străină se referă, în prezenta invenție, la o secvență ADN care este legată25 operațional la cel puțin un element de reglare heterolog. De exemplu, orice genă, alta decât gena structurală 5126 de la porumb, este considerată a fi o genă străină dacă expresia27 acestei gene este controlată printr-un element de reglare specific anterei genei 5126.

Un promotor este o secvență ADN care direcționează transcripția unei gene cum ar 29 fi o genă structurală, o genă antisens, o genă ribozom sau o genă a secvenței orientată spre exterior. în mod tipic, un promotor este localizat în regiunea 5' a unei gene, apropiat la situl 31 start transcripțional. Dacă un promotor este un promotor inductiv, atunci rata transcripției crește ca răspuns la agentul inductiv. Prin contrast, rata de transcriere nu este reglată de un 33 agent inductiv dacă promotorul este un promotor constitutiv. Un promotor de plantă este o secvență promotor care va direcționa transcriere genei în țesutul plantei. 35

Un promotor principal conține secvențe nucleotidice esențiale pentru funcția promotorului, incluzând cutia TATA și startul translație. Prin această definiție, un promotor 37 principal poate sau nu să aibă activitate detectabilă în absența secvețelor specifice care pot spori activitatea sau pot conferi activitate specifică țesutului. De exemplu, promotorul 39 principal SGB6 constă din aproximativ 38 nucleotide spre 5'-ul sitului start transcriptional al genei SGB8, în timp ce promotorul principal 35S al virusului mozaicului conopidei (CaMV)¹ 41 constă din aproximativ 33 nucleotide spre 5'-ul sitului start transcriptional al genomului 35S.

Un promotor specific țesutului este o secvență ADN, care atunci când este legată 43 operațional la o genă direcționează un nivel mai ridicat al transcripției acestei gene într-un țesut specific față de același țesut sau toate celelalte țesuturi dintr-un organism. De exemplu, 45 un promotor specific anterei este o secvență ADN care direcționează un nivel mai ridicat al transcripției unei gene asociate în țesutul anterei din plantă. Promotorul SGB6 specific ante- 47 rei, de exemplu, poate direcționa expresia genei străine în țesutul anterei, dar nu în țesutul rădăcinii sau țesutul coleoptil. 49

RO 120920 Β1

Așa cum s-a folosit aici, un promotor specific-anterei cuprinde două elemente funcționale: o cutie anteră și un promotor principal. O anumită cutie anteră poate poseda caracteristicile funcționale ale unui amplificator clasic. Combinația unei cutii anteră cu un promotor principal poate stimula expresia genei mai mult decât un promotor principal singur. Aceasta este adevărat chiar în cazul unui promotor himeric specific anterei conținând o cutie anteră și un promotor principal derivat de la gene diferite. Astfel de elemente himerice de reglare specifice anterei sunt descrise mai jos.

Un operator este o secvență ADN care este localizată spre 5'-ul unei gene și care conține o secvență nucleotidică care este recunoscută și legată printr-o proteină represor. Legarea unei proteine represor cu operatorul său înrudit are drept consecință inhibarea transcrierii genei. De exemplu, gena LexA codifică o proteină represor care se leagă la operatorul LexA.

O moleculă ADN izolată este un fragment al ADN-ului care a fost separat de la ADNul unui organism. De exemplu, o moleculă ADN donată, care codifică o genă streptavidină, este o moleculă ADN izolată. Un alt exemplu de moleculă ADN izolată este o moleculă ADN sintetizată chimic sau cADN produsă enzimatic, care nu este integrată în ADN-ul genomic al unui organism.

Un amplificator este un element de reglare ADN care poate crește eficiența transcrierii.

ADN complementar (cADN) este o moleculă ADN împletită simplu, care este formată de la o matriță ARNm de enzima transcriptază inversă. în mod tipic, o complementaritate primară la porțiunile ARNm-ului este folosită pentru inițierea transcripției inverse. Specialiștii în domeniu folosesc de asemenea termenul ADNc pentru a se referi la o moleculă ADN dublu catenară, care constă dintr-o astfel de moleculă ADNm cu o catenă și catena sa ADN complementar.

Termenul expresie se referă la biosinteza unui produs genă. De exemplu, în cazul unei gene structurale, expresia implică transcripția genei structurale în ARNm și translația ARNm-ului în una sau mai multe polipeptide.

Un vector de donare este o moleculă ADN, cum arfi un plasmid, cosmid, sau bacteriofag, care are capacitatea de replicare autonomă într-o celulă gazdă. Vectori de donare conțin în mod tipic un sit sau un număr mic de situri pentru recunoașterea endonucleazei de restricție la care secvențe ADN străine pot fi inserate într-un mod determinabil, fără pierderea unei funcții biologice esențială a vectorului, așa cum este o genă marker care este corespunzătoare pentru folosirea în identificarea și selectarea celulelor transformate cu vectorul de donare. Gene marker includ în mod tipic gene care asigură rezistență a tetraciclină sau rezistență la ampicilină.

Un vector de expresie este o moleculă ADN cuprinzând o genă care este exprimată într-o celulă gazdă. în mod tipic, expresia genei este situată sub controlul unor anumite elemente de reglare, incluzând promotori constitutivi sala inductivi, elemente de reglare specifice țesutului și amplificatori. O astfel de genă este numită a fi legată operațional la elementele de reglare.

O gazdă recombinantă poate fi orice celulă procariotă sau eucariotă care conține fie un vector de donare, fie un vector de expresie. Acest termen include de asemenea acele celule procariote sau eucariote care au fost prelucrate genetic pentru a conține gena(ele) donată în cromozomul sau genomul celulei gazdă.

O plantă tranșgenică este o plantă având una sau mai multe celule de plantă care conțin o genă străină.

RO 120920 Β1

La eucariote, ARN polimeraza II catalizează transcripția unei gene structurale pentru 1 a produce ARNm. O moleculă ADN poate fi desemnată a conține o matriță ARNm polimeraza II, în care transcriptul ARN este o secvență care este complementară celei a unui 3 ARNm specific. Transcriptul ARN este denumit un ARN antisens și o secvență ADN care codifică ARN-ul antisens este denumită o genă antisens. Moleculele ARN antisens sunt 5 capabile de legare la molecule ARNm, având drept rezultat o inhibare a translației ARNm.

O ribozimă este o moleculă ARN care conține un centru catalitic. Termenul include 7 enzime ARN, ARN-uri de autoîmbinare și ARN-uri de autoclivare. O secvență ADN care codifică o ribozimă este denumită o genă ribozimă. 9

O secvență cu orientare spre exterior este o moleculă ARN care direcționează ribozimă endogenă, RNază P, spre o specie specială de ARNm intracelular, având drept 11 rezultat clivarea ARNm-ului de către RNaza P. O secvență ADN care codifică o secvență cu orientare spre exterior este denumită o genă secvență cu orientare spre exterior. 13

O trăsătură de granulă sau sămânță este o caracteristică nutrițională sau fiziologică a seminței, controlată de preferință printr-o genă dominantă, care afectează semnificativ tipul15 industrial. Trăsăturile de granulă sau sămânță includ astfel de caracteristici cum ar fi conținutul de ulei, proteină sau amidon, precum și calitatea proteinei și tipul de amidon.17

O încrucișare simplă este o încrucișare între două linii rezultate din încrucișări selective.19

O încrucișare dublă este o încrucișare între două încrucișări simple.

O încrucișare pe cale triplă este descendentul unei încrucișări între o încrucișare 21 simplă și o linie rezultată din încrucișări selective.

Un hibrid este prima generație de urmași a unei încrucișări între doi indivizi care 23 diferă prin una sau mai multe gene.

O linie rezultată din încrucișări selective este o linie pură, rezultată de obicei prin 25 autopolenizare și selecție.

O linie sintetică este un amestec de tulpini, clone, linii rezultate din încrucișări selec- 27 tive sau hibrizi, între ei, păstrați prin polenizare deschisă, pentru un număr specificat de generații. Unitățile componente sunt înmulțite și reconstituite sintetic la intervale regulate. 29 Capacitate de combinare specifică este realizarea de combinații specifice ale tulpinilor genetice în încrucișări în legătură cu realizarea medie a tuturor combinațiilor. 31

O plantă polenizatoare este un părinte masculin fertil care donează polen la părintele feminin masculin steril. O plantă polenizatoare poate avea unul dintre mai multe fonduri 33 genetice diferite și astfel poate fi o linie rezultată prin încrucișare selectivă, un hibrid, o linie sintetică polimerizată deschis sau un stoc genetic. O plantă polenizatoare poate fi o linie 35 transgenică. O plantă polenizatoare poate produce una sau mai multe trăsături de sămânță sau granule de interes. 37

Prezenta invenție asigură procedee pentru generarea de plante cu sterilitate masculină prin prepararea de plante transgenice care exprimă streptavidină. Streptavidină 39 poate fi exprimată constitutiv, într-un mod nespecific țesutului, sau poate fi exprimată într-un mod specific anterei. Sunt asigurate, de asemenea, metode pentru restaurarea fertilității 41 masculine.

De asemenea, este asigurată o metodă pentru producerea semințelor hibride, având 43 una sau mai multe trăsături de granule sau semințe de interes. într-o realizare preferată a acestei invenții, un prim hibrid, care este masculin steril și poartă una sau mai multe copii ale 45 genei streptavidină, este încrucișat ca părinte feminin cu un al doilea hibrid care este masculin fertil și poartă una sau mai multe trăsături de granulă sau sămânță de interes. 47 Semințe hibrid sunt produse cu una sau mai multe trăsături ale părintelui masculin.

RO 120920 Β1

Gena streptavidină este izolată sau inserată într-un vector de expresie corespunzător pentru introducerea în țesutul de plantă. Vectorul de expresie cuprinde suplimentar un promotor care poate fi un promotor constitutiv, un promotor nespecific țesutului, cum ar fi promotorul ubiguitină, un promotor specific țesutului, cum ar fi un promotor specific anterei, sau un promotor inductiv. Vectorul de expresie poate cuprinde o secvență semnal export. Expresia la un nivel ridicat, a unui produs de genă care apoi se acumulează în citoplasmă, poate avea drept rezultat toxicitatea la celula clanței. îndepărtarea produsului genei de la citoplasmă poate avea astfel drept rezultat toxicitatea celulară redusă. Se cunosc gene de plantă și secvențele lor semnal export. Vezi, Jones și Robinson, Transley Review 17:567-597 (1989). Vectorul de expresie se introduce în țesutul plantei prin metode standard și plantele transgenice sunt selectate și înmulțite. Plantele țransgenice care exprimă streptavidină sunt masculin sterile. Fertilitatea masculină poate fi restaurată prin coexpresia în plantele transgenice a unei a doua gene care inhibă transcripția genei streptavidină, sau inhibă transcrierea ARNm streptavidină. Conform acestei realizări, supresia temporară a genei streptavidină este atinsă dacă gena supresoare este legată operațional la un promotor inductiv. în mod alternativ, fertilitatea masculină poate fi restaurată prin pulverizarea pe plante în dezvoltare a soluțiilor de biotină.

3. Izolarea moleculelor ADN care codifică streptavidină

Secvențele nucleotidice care codifică streptavidină pot fi izolate prin metode cunoscute. De exemplu, este cunoscută secvența nucleotidică a genei strepstreptavidină. (Argarana și colab., Nucleic Acids Res., IHA): 1871-1882 (1986). în mod alternativ, un ADNc care codifică streptavidină de la albuș de ou de pui poate fi izolat de la o bancă ADNc oviduct de pui prin metodele descrise de către Gope și colab., Nucleic Acids Res., L5:3595 (1987), care sunt încorporate aici prin referință.

Clone genomice ale genei streptavidină pot fi obținute de la ADN genomic al organismelor care sunt cunoscute a produce streptavidină. De exemplu, o genă streptavidină de pui poate fi donată de la ADN genomic de pui prin metodele descrise în Keinanen și colab., Eur. J. Biochem., 220:615 (1994).

Gena streptavidină poate fi izolată de asemenea, folosind reacția polimerazică de lanț (PCR) folosind metode standard. Vezi, Erlich, PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (Stockton Press, NY, 1989) și Innis și colab., PCR Protocols: a Guide to Methods andApplications (Academic Press, San Diego, 1990). Metode pentru amplificare PCR a secvențelor nucleotidice lungi, cum ar fi sistemul ELONGASE™ (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) pot fi folosite, de asemenea, pentru obținerea secvențelor nucleotidice mai lungi, cum ar fi clone genomice care codifică streptavidină. Primeri PCR complementari la terminațiile 5* și 3' ale secvențelor genei streptavidină cunoscute pot fi sintetizate folosind dispozitive de sintetizare, cum ar fi cele asigurate de Applied Biosystems (Foster City, CA). într-o realizare preferată, primerii includ secvențe nucleotidice adiționale care conțin situri de clivare de către endonucleazele de restricție. Prezența unor astfel de situri ține seama de donarea direcționată a produselor PCR în vectori de donare corespunzători după tratamentul cu o enzimă de restricție corespunzătoare. Vezi, Finney, Molecular Cloning Of PCR products în Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel și colab., Eds. (John willev and Sons, New York, 1987) p. 15.7.1.

Matrița ADN pentru PCR poate fi fie ADNc, fie ADN genomic și poate fi preparată de la un organism corespunzător,folosind metode binecunoscute în domeniu. Sambrook și colab., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Second Edition, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989). ADN-ul genomic poate fi preparat direct de la țesut avian, de la reptile sau amfibian, folosind reactivi comerciali, cum ar fi Triazol™

RO 120920 Β1 (Life Technologies, Inc. Gaithersburcr. MD). în mod alternativ, ADNc care codifică strepta- 1 vidină poate fi preparat folosind ARNm extras de la țesut de oviduct de pui, folosind o trusă disponibilă comercial (Pharmacia, Piscataway, NY). Prepararea ARNm este folosită ca o 3 matriță pentru sinteza de ADNc, folosind poly(dT) sau primeri hexamer aleator prin tehnici standard. Vezi, Sambrook și colab., supra.). Apoi, sinteza ADNc se realizează folosind o 5 trusă disponibilă comercial (Pharmacia) și ADNc se va utiliza direct pentru PCR, folosind metoda lui Saiki și colab., Science 239.487 (1988). 7

Fragmente ADN genomic sau ADNc izolate prin metodele descrise mai sus pot fi inserate într-un vector, cum ar fi un vector bacteriofag sau cosmid, în concordanță cu tehnici 9 convenționale, cum ar fi utilizarea digestiei cu enzimă de restricție pentru a asigura terminații corespunzătoare, utilizarea tratamentului cu fosfatază alcalină, pentru a evita anexarea 11 nedorită a moleculelor ADN și ligarea cu liganzi corespunzători. Tehnici pentru manipularea unor astfel de vectori sunt descrise de către Ausubel și colab., (eds.) Current Protocols in 13 Molecular Biology, pag. 3.0.5-3.17.5. (1990) [Ausubel].

în mod alternativ, avidina care codifică secvențe nucleotidice poate fi obținută prin 15 sintetizarea moleculelor ADN care codifică streptavidină, folosind inițiere mutuală cu oligonucleotide lungi. Vezi, de exemplu, Ausubel la pag. 8.2.8. până la 8.2.13. De asemenea, 17 vezi, Wosnickși colab., Gene j5C):115 (1987). Tehnici curente folosind reacția polimerazică de lanț asigură capacitatea de a sintetiza gene la fel de lungi ca 1,8 kilobaze în lungime. 19 Adang și colab., Plant. Molec. Biol. 21:1131 (1993); Bambot și colab., PCR Methods and Applications 2:266(1993). Secvența nucleotidică a unei gene streptavidină sintetizată poate 21 fi bazată pe orice moleculă de ADN cunoscută care codifică streptavidină (Vezi, de exemplu, Gope și colab., supra). 23

Aceste clone pot fi analizate folosind o varietate de tehnici standard, cum ar fi analiza de restricție, analiza Southern, analiza extensiei primerului și analiza secvenței ADN. Analiza 25 extensiei primerului sau analiza protecției nucleazei SI, de exemplu, poate fi folosită pentru a localiza situl de start probabil al transcripției genei donate. Ausubel, la pag. 4.8-4.8.5; 27

Walmsley și colab., Guantitative and Gualitative Analysis of Exogenous Gene Expression by the SI Nuclease Proțection Assa< în Methods in Molecular Biology, voi. 7; Gene Transfer 29 andExpression Protocols, Murray (ed.), pagini 271-281 (Humana Press Inc. 1991). Acestea și tehnici înrudite, bine cunoscute unui specialist în domeniu, sunt folosite pentru izolarea 31 altor gene de interes și donarea și expresia lor.

4. Clonarea genei streptavidină într-un vector de expresie și prepararea plantelor 33 transgenice

Odată ce gena streptavidină a fost izolată, aceasta se inserează într-un vector de 35 expresie prin metode standard. (Vezi, Sambrook și colab., supra.). Selectarea unui vector de expresie corespunzător va depinde de metoda introducerii vectorului de expresie în celule 37 gazdă. în mod tipic, un vector de expresie conține: (1) elemente ADN procariotic care codifică pentru o origine de replicare bacteriană și o genă de rezistență la antibiotic pentru 39 a asigura creșterea și selectarea vectorului de expresie în gazda bacteriană, (2) un sit de donare pentru inserția unei secvențe ADN exogenă, de exemplu, o genă streptavidină; (3) 41 elemente ADN eucariotic care controlează inițierea transcrierii genei exogene, cum ar fi un promotor; (4) elemente ADN care controlează producerea transcriptelor, cum ar fi o secvență 43 de terminare transcriere/poliadenilare; și (5) o genă care codifică o proteină marker (de exemplu, o genă raportoare), în care gena este legată operațional la elementele ADN care 45 controlează inițierea transcrierii. în plus, vectorul de expresie poate cuprinde o secvență ADN care codifică o secvență semnal export, legată operabil la secvența ADN exogenă. 47 Caracterizările generale ale vectorilor de expresie ai plantei și genele raportor pot fi găsite

RO 120920 Β1 în Gruber și colab., Vectors forPlant Transformation”, în Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick și colab., (Eds.), pag. 89-119 (CRC Press, 1993).

într-o realizare preferată a prezentei invenții, se utilizează un promotor ubiguitină, cu inhibitori în plantă. Promotori ubiguitină de plantă sunt bine cunoscuți în domeniu. Vezi, de exemplu, cererea de brevet european 034292 6, care este încorporată aici prin referire. Promotorul ubiguitină este un promotor constitutiv.

în altă realizare preferată a invenției, un promotor inductibil este folosit pentru a permite reglarea inductivă a expresiei streptavidinei. Un exemplu de astfel de promotor inductiv este un sistem glutation S-tranferază la porumb. (Vezi, Wiegand și colab., Plant. Mol. Biol. 2:235 (1986). Această metodă ține seama de asemenea de inducerea reversibilă a sterilității masculine. Astfel, expresia avidinei și sterilitatea masculină concomitentă poate fi controlată așa cum se dorește prin activarea promotorului. Când promotorul nu este activat, avidina nu este exprimată și plantele sunt masculin fertile.

Expresia poate cuprinde un marker care poate fi selectat sau cercetat. Multe dintre genele marker selectabile pozitive, folosite de obicei pentru transformarea plantei, s-au izolat de la bacterii și codifică pentru enzime care detoxifică metabolic un agent chimic selectiv, care poate fi un antibiotic sau un erbicid. Alte gene marker selectabil pozitive codifică o țintă alterată care este insensibilă la inhibitor.

O genă marker selectabilă, folosită de obicei pentru transformarea plantei, este gena neomicin fosfotransferază II, izolată de la Tn5, care atunci când se plasează sub controlul semnalelor deregiare a plantei conferă rezistență la kanamicină. Fraley și colab., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803 (1983). Alt marker selectabil, utilizat de obicei, este gena higromicin fosfotransferază care conferă rezistență la antibioticul hidromicină, Vander Elzen și colab., Plant Mol. Biol. 5:299 (1985). Gene marker de selecție pozitivă, adiționale, de origine bacteriană, care conferă rezistență la antibiotice, includ gentamicin acetil transferaza, streptomicin fosfotransferază, amirioglicozid-3' -adenil transferază și determinant rezistent la bleomicin. Hayford și colab., Plant Physiol. 8.6:1216 (1988); Joes și colab., Mol. Gen. Genet. 210: 86 (1987); Svac și colab., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990), Hille și colab., Plant Mol. Biol. 1: 171 (1986).

Alte gene marker selectabile pozitive pentru transformarea plantei nu sunt de origine bacteriană. Aceste gene includ dihidrofolat sintaza de șoarece, 5-enolpiruvilshikimat-3-fosfat de plantă și acetolactatsintaza de plantă. Eichholy și colab., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987); Sdhah și colab., Science 233: 478 (1986); Charestși colab., Plant Cell Rep. 8.: 643 (1990).

Alte gene marker selectabile obișnuite pentru plante conferă rezistență la inhibitori erbicizi de glutaminsintetază. Cererea de brevet european 0333033 a lui Kumada și colab., și brevetul US 4975374 al lui Goodman și colab. descriu secvența nucleotidică a genelor glutamin sintetaza care conferă rezistență la erbicide cum ar fi L-fosfinotricină. Secvența nucleotidică a genei fosfinotricin-acetil-transferază este prevăzută în cererea europeană 0242246 a lui Leemans și colab., De Greef și colab., Biotechnology 2:61 (1985) descriu producerea plantelor transgenice care exprimă gene himerice bar care codifică pentru activitate fosfinotricin-acetil-transferază.

Altă clasă de gene marker pentru transformarea plantei necesită cercetarea celulelor de plantă transformată, probabil mai degrabă decât selectarea genetică directă a celulelor transformate pentru rezistență la o substanță toxică, cum arfi un antibiotic. Aceste gene sunt utile mai ales pentru a cuantifica sau a vizualiza modelul spațial al expresiei unei gene în țesuturi specifice și frecvent se face referire la acestea ca la gene raportor, deoarece pot fi

RO 120920 Β1 introduse într-o genă sau o secvență de reglare a genei pentru investigarea expresiei genei. 1

Gene folosite de obicei pentru cercetarea celulelor transformate probabile includ 3glucuronidază (GUS), 3-galactozidază, luciferază și cloramfenicol acetiltransferază. 3 (Jefferson, PlantMol. Biol. Rep. 5:387 (1987); Teeri și colab., EmboJ. 8.: 343 (1989); Koncz și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84.: 131 (1987); De Block și colab., EmboJ. 3.: 1681 5 (1984). Altă abordare pentru identificarea evenimentelor de transformare relativ rare a fost utilizarea unei gene care codifică un regulator constitutiv dominant al căii de pigmentare 7 antocianină de la Zea Mays. Ludwig și colab., Science 247:449 (1990).

Vectorii de expresie pot conține gena streptavidină legată funcțional la o secvență 9 ADN care codifică pentru o secvență semnal export peptidă. (Vezi, Hones și Robinson, supra). Vectorul este făcut astfel încât o secvență semnal este fuzionată la N-terminalul 11 secvenței proteinei streptavidină matură, permițând producerea celulară normală, pentru a cliva exact molecula proteinei și a produce streptavidină activă matură. într-o realizare 13 preferată în mod special, secvența semnal este secvența semnal alfa amilază de la orz. Rogers, J. Biol. Chem. 260:3731-3738 (1985). 15

Vectori de expresie conținând o genă streptavidină pot fi introduși în protoplaste sau în țesuturi intacte, cum ar fi embrioni imaturi și meristeme, sau în culturi de calus, sau în 17 celule izolate. De preferință, vectorii de expresie se introduc în țesuturi intacte. Sunt asigurate metode generale de cultivare a țesuturilor de plantă, de exemplu, de către Miki și 19 colab., Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants”, în Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick și colab., (eds.) pag. 67-88 (CRC Press, 1993) și de către 21

Phillips și colab., Cell/Tissue Culture and in Vitro Manipulațion, în Corn and Corn Improvement, 3rd Edition, Sprague și colab. (Eds.), pag. 345-387 (American Society of 23 Agronomy, Inc. și colab., 1988).

Metode pentru introducerea vectorilor de expresie în țesut de plantă includ infectarea 25 directă sau cocultivarea țesutului de plantă cu Agrobacterium tumefaciens. Horsch și colab., Science 277:1229 (1985). De preferință, o plasmidă Ti- dezactivat este folosită ca un vector 27 pentru secvențe ADN străine descrise, de exemplu, în cererile de brevet european 116718 (1984) și 270822 (1988). Vectorii plasmidei Ti- de interes conțin secvența ADN străină între 29 secvențele marginale sau cel puțin localizate în amontele secvenței marginale din dreapta.

Alte tipuri de vectori pot fi folosiți pentru transformarea celulelor de plantă, folosind 31 proceduri cum ar fi transferul direct de genă (vezi, de exemplu, cererea POT WO 85/01856 și cererea europeană 275069), transformarea protoplastică in vitro (de exemplu, brevet US 33 4684611), transformarea plantei mediată virus (de exemplu, cererea-europeană 067553 și brevete US 4407956) și transformarea mediată-lipozom (de exemplu, brevet US 4536475). 35

Metode corespunzătoare pentru transformarea porumbului sunt asigurate de către Fromm și colab., Biotechnology: 833 (1990) și de către Gordon-Kamm și colab., The Plant Cell 2: 37

603 (1990). Metode standard pentru transformarea orezului sunt descrise de către Christou și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6389 (1991). Grâul poate fi transformat folosind 39 metode care sunt similare tehnicilor pentru transformarea porumbului sau orezului. în plus, Casas și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9.0: 11212 (1993), descriu o metodă pentru 41 transformarea sorgului, în timp ce Wan și colab., Plant Physiol. 104: 37 (1994), descriu o metodă pentru transformarea orzului. 43 în genera), metode directe de transfer sunt preferate centru transformarea unei plante monocotiledonate, în special, o cereală cum ar fi orez, porumb, sorg, orz sau grâu. Metode 45 directe de transfer includ eliberarea mediată prin microproiectil, injectare ADN, electroporare și altele asemenea. Vezi, de exemplu, Gruber și colab., supra, Miki și colab., supra, și Klein 47

RO 120920 Β1 și colab., Biotechnology 10:268 (1992). Mai preferabil, vectorii de expresie sunt introduși în țesuturile unei plante monocotiledonate, folosind eliberare mediată prin microproiectile cu un dispozitiv biolistic.

5. Reglarea fertilității masculine

A. Producerea plantelor cu sterilitate masculină

Pentru a induce sterilitate masculină, conform prezentei invenții, este constituit un vector de expresie, care într-o secvență ADN, codificând streptavidină, este legat funcțional la secvența ADN care reglează transcripția genei în țesut de plantă. Cerințele generale ale unui vector de expresie sunt descrise mai sus. în scopul realizării sterilității masculine prin expresia streptavidinei, este de preferat ca streptavidina să nu fie exprimată doar într-un mod tranzitoriu, ci vectorul de expresie să fie introdus în țesut embrionic de plantă, astfel încât streptavidina va fi exprimată la un stadiu mai târziu de dezvoltare în planta adultă. De exemplu, stabilitatea mitotică poate fi realizată folosind vectori virali de plantă care asigură replicarea epicromozomală.

O metodă preferată pentru obținerea stabilității mitotice este asigurată prin reintegrarea secvențelor vectorului de expresie în cromozomul gazdă. O astfel de stabilitate mitotică poate fi asigurată prin bombardarea microproiectilelor cu vectorul de expresie în țesutul de plantă, sau prin folosirea altor metode standard, așa cum s-a descris mai sus. Vezi, de exemplu, Fromin și colab., Bio/Technology 8:833 (1990), Gordon-Kamm și colab., The Plant Cell 7:603 (1990) si Walters și colab., Plant Molec. Biol. 18:189 (1992).

Transcrierea genei streptavidină, după introducerea țesutului de plantă, de preferință, este controlat printr-un promotor constitutiv care stimulează nespecific expresia genei în țesutul de plantă. Un exemplu de promotor constitutiv, corespunzător pentru acest scop, este promotorul ubiguitină, așa cum s-a descris mai sus.

Transcrierea genei streptavidină poate fi controlată, de asemenea, printr-un promotor care stimulează expresia genei, într-un mod specific țesutului. Un promotor specific anterei, preferat, în mod special, este promotorul S126, care a fost izolat de la linia B73 de la porumb rezultată din încrucișare selectivă. Promotorul S126 stimulează expresia unei gene străine de la cvartet până la antere, în stadiul timpuriu de microspor uninucleat.

Un alt promotor adecvat, specific anterei, este promotorul SGB6 care, de asemenea, a fost izolat de la linia B73. Promotorul SGB6 poate induce expresia unei gene străine în celule tapetale de anteră, de la stadiul cvartet până la stadiul mediu-uninucleat al dezvoltării microsporului.

în mod alternativ, expresia genei specifică anterei poate fi asigurată folosind o combinație a unei cutii anteră și un promotor principal. O cutie anteră preferată în mod special este o cutie anteră S126, care cuprinde următoarea secvență nucleotidică:

5^f GCGGCCGCGG ATCCGCTCAT CTGCTCGGTA CCAACCAGCC

CGCCGGCGCC TAGGCGAGTA GACGAGCCAT GGTTGGTCGG

TTTCCTATTA CCATGCACAG ATCT 3' [SEQ ID NR:4]

AAAGGATAAT GGTACGTGTC TAGA

Altă cutie anteră corespunzătoare constă într-un fragment ADN de 94 baze perechi, definit prin nucleotidele 583 până la 490, în avalul sitului de start SGB6 al transcripției. Secvența nucleotidică a cutiei anterei SGB6 de 94 baze perechi este:

(-583) ACAGTTCACT AGATATGCAT GATCTTTAAC AATTGCTGCT

TGTCAAGTGA TCTATACGTA CTAGAAATTG TTAACGACGA

GGATTGTGCG GTTTCTTTTG GCACAAATGG CATGAACAGA CCTAACACGC CAAAGAAAAC CGTGTTTACC GTACTTGTCT GTAATCCGGG ACGC (-490) [SEQ ID NR:5]

CATTAGGCCC TGCG

RO 120920 Β1 în mod alternativ, o cutie anteră corespunzătoare este obținută de la promotorul G9 1 de porumb, care stimulează expresia genei în timpul stadiilor meiotic până la cvartet de dezvoltare. Cutia anteră G9 cuprinde următoarea secvență nucleotidică: 3

5' GCGGCCGCGG ATCCTGGCTG GATGAAACCG ATGCGAGAGA

CGCCGGCGCC TAGGACCGAC CTACTTTGGC TACGCTCTCT5

AGAAAAAAAA ATTGTTGCAT GTAGTTGGCG CCTGTCACCC

TCTTTTTTTT TAACAACGTA CATCAACCGC GGACAGTGGG7

AACCAAACCA GTAGTTGAGG CACGCCCTGT TTGCTCACGA

TTGGTTTGGT CATCAACTCC GTGCGGGACA AACGAGTGCT9

TCACGAACGT AGATCT 3' [SEQ ID NR:6]

AGTGCTTGCA TCTAGA11

Cutiile anteră S126, SGB6 și G9 pot fi obținute prin oliogonucleotide de sinteză, așa cum a fost descris mai sus. Specialiștii în domeniu vor aprecia că analiza deleției poate fi 13 realizată pentru a localiza una sau mai multe secvențe adiționale de reglare specifice anterei, în cutii la antere descrise. Astfel de fragmente funcționale ale cutiilor anterei, de asemenea, 15 pot fi folosite, pentru a regla expresia genei streptavidină, într-un mod specific anterei.

Promotori principali preferați sunt derivați de la promotorul principal S126, promotorul17 principal SGB6, promotorul principal G9 și promotorul principal 35S al virusului mozaicului conopidei.19

Un promotor principal, preferat, în mod special, este promotorul principal S12 6, care cuprinde următoarea secvență nucleotidică:21

5' AGATCTAAGT AAGGTATATA TGTGCATAGT CTCCTAATTC

TCTAGATTCA TTCCATATAT ACACGTATCA GAGGATTAAG23

TTCATCTTCA ACCTCTAGCT GATTGATCTC TGGTATTTAC

GTGAGAAAGG AAGGAAGGAA GGAAGTTAAG ATTTATGGTG25

AAATCAAAGT TGCTTTGCCA TG 3’ [SEQ ID NR: 7]

TTTAGTTTCA ACGAAACGGT AC27

Promotorul principal SGB6 de aproximativ 38 nucleotide în avalul sitului de start transcripțional al genei SGB6. Un promotor principal SGB6 corespunzător are următoarea 29 secvență nucleotidică:

5' ATCTCACCCT ATTAATACCA TGCTGACGAG31

TAGAGTGGGA TAATTATGGT ACGACTGCTC

CCAATAGC 3 [SEQ ID NR:8]33

GGTTATCG

Un promotor principal corespunzător de la gena G9 cuprinde secvența nucleotidică:35

5' AGATCTCTAT AAAACACGCA GGGACTGGAA AGCGAGATTT

TCTAGAGATA TTTTGTGCGT CCCTGACCTT TCGCTCTAAA37

CACAGCTGAA AGCAGCCAAA ACGCAGAAGC TGCACTGCAT

GTGTCGAGTT TCGTCGGTTT TGCGTCTTCG ACGTGACGTA39

ACATCGAGCT AACTATCTGC AGCCATG 3' [SEQ ID NR:9]

TGTAGCTCGA TTGATAGACG TCGGTAC41

Promotori principali, corespunzători, de asemenea, sunt asigurați prin fragmente funcționale ale promotorilor S12 6, SGB6 și G9. Metode pentru obținerea unor astfel de 43 fragmente funcționale sunt descrise mai sus.

Fereastra de dezvoltare a expresiei genei streptavidină poate fi extinsă folosind un 45 element de reglare himeric, cuprinzând o cutie anteră de la o genă si un promotor specificanterei de la o a doua genă. De exemplu, secvențele de reglare SGB6 stimulează expresia 47 genei de la stadiile cvartet prin stadii semiuninucleate. în timp ce secvențe de reglare G9

RO 120920 Β1 stimulează expresia genei în timpul meiozei și prin stadiul cvartit al dezvoltării. în plus, combinarea unei cutii anteră SGB6 și un promotor G9 stimulează transcripția unei gene străine, în timpul meiozei și prin stadiul semiuninucleat al dezvoltării. Astfel, combinări diferite ale cutiilor anteră și promotori specifici anterei sunt utili, în mod special, pentru prezenta invenție.

De asemenea, poate fi folosit un promotor principal viral. Exemple de promotori principali virali corespunzători includ un promotor principal al virusului mozaicului conopidei (CaMV), un promotor principal al virusului mozaicului grâușorului. (Ranunculus ficaria) și altele asemenea. (Gruberși colab., supra.). De preferință, promotorul principal viral este promotorul principal CaMV 25S sau o variantă a acestuia.

Pentru a selecta celule transformate, vectorul de expresie conține o genă marker selectabilă, cum ar fi o genă cu rezistență la erbicid. De exemplu, astfel de gene pot conferi rezistență la fosfinotricină, glifosat, sulfoniluree, atrazină, sau imidazolinonă. De preferință, gena marker seletabilă este gena bar sau gena pat care codifică fosfinotricin acetiltransferază. Secvențele nucleotidice ale genelor bar pot fi găsite în Laemans și colab., cererea de brevet european 0242246 (1987) și în White și colab., Nucleic Acids Res. I£: 1062 (1990). Wohlleben și colab., Gene 70:25 (1988), descriu secvența nucleotidică a genei pat. Expresia genei bar sau par conferă rezistență la erbicide cum ar fi glucosinat (vândut ca Basta® si Ignite®, -printre altele) și bialafos (vândut ca Herbi-ace® și Liberty®).

Vectorul de expresie poate conține secvențe ADN care codifică streptavidină sub controlul unui promotor constitutiv sau un promotor specific anterei, precum și gena marker selectabil sub controlul unui promotor constitutiv. în mod alternativ, gena marker selectabilă poate fi introdusă în celula gazdă, într-un vector de expresie de selecție separat prin cotransformarea țesutului embrionic.

B. Restaurarea fertilității masculine în hibridul F1

Metodele descrise mai sus pot fi utilizate pentru a produce plante transgenice masculin sterile, pentru producerea hibrizilor F1, în încrucișări directe pe scară largă, între linii rezultate din încrucișări selective. Dacă toate celulele de ou ale plantelor transgenice masculin sterile nu conțin gena streptavidină recombinantă, atunci o porțiune a hibrizilor F1 va avea un fenotip masculin fertil. Pe de altă parte, hibrizii F1 vor avea un fenotip masculin steril, dacă gena streptavidină transgenică este prezentă în toate celulele ou ale plantelor masculin sterile. Astfel, ar fi de dorit să se utilizeze un sistem de restaurare a fertilității masculine, pentru a asigura producerea hibrizilor F1 masculin fertili. Un astfel de sistem de restaurare a fertilității a avut valoare, în mod special, la speciile autogame la care produsul recoltat este sămânța.

Calea propusă de obicei pentru restaurarea fertilității într-o linie de plante transgenice masculin sterile necesită producerea unei a doua linii restaurator de plante transgenice. De exemplu, o plantă transgenică care este masculin sterilă datorită expresiei barnază va fi încrucișată cu o plantă masculin fertilă care exprimă inhibitorul barnază, așa cum s-a discutat mai sus (Mariani și colab., Nature 357:384 (1992)).

în cazul prezent, o cale analoagă va necesita producerea unei linii de restaurare a plantelor transgenice care exprimă ribozime țintite la ARNm streptavidină sau care exprimă avidina antisens. De exemplu, ribozime pot fi desemnate pentru a exprima activitate endonuclează care este direcționată către o anumită secvență țintă într-o moleculă ARNm (de exemplu, Steinecke și colab., EMBO J. 11: 1525 (1992)), a realizat până la 100% inhibarea expresiei neomicin fosfotransferazei de către ribozime în protoplaste de tutun. Mai recent, Perriman și colab., Antisense Res and Devei. 3: 253 (1993), a inhibat activitatea cloramfenicol acetil trasnferazei în protoplaste de tutun, folosind un vector care exprimă o ribozimă cap-de-ciocan modificată. în contextul prezentei invenții, ARNm streptavidină asigură molecula ARN țintă corespunzătoare pentru ribozime.

RO 120920 Β1 într-o cale similară, fertilitatea poate fi restaurată prin utilizarea unui vector de 1 expresie conținând o secvență nucleotidică care codifică un ARN antisens. Legarea moleculelor ARN antisens, la moleculele ARNm țintă, are drept rezultat oprirea hibridizării 3 translației. Paterson și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 24:4370 (1987). în contextul prezentei invenții, o moleculă ARN antisens corespunzătoare va avea o secvență care este 5 complementară ARNm streptavidină. într-o realizare preferată a invenției, ARN-ul antisens este sub controlul unui promotor inductiv. Activarea acestui promotor permite apoi 7 restaurarea fertilității masculine.

într-o cale suplimentară alternativă, pot fi construiți vectorii de expresie în care un 9 vector de expresie codifică transcripte ARN capabile de promovarea clivării mediate RNază P a moleculelor ARNm streptavidină. Conform acestei căi, o secvență orientată spre exterior 11 poate fi construită pentru direcționarea ribozimei endogene, RNază P, la ARNm streptavidină, care este clivată ulterior prin ribozima celulară. Altman și colab., brevet US 5168053; 13

Yuan. și colab., Science 261: 1269 (1994). De preferință, secvența orientată spre exterior cuprinde o secvență de 10 până la 15 nucleotide complementare la ARNm streptavidină și 15 o secvență nucleotidică 3'-NCCA, în care N este de preferință o purină. Id. Transcriptele secvenței orientate spre exterior se leagă la speciile ARNm țintite prin formarea perechilor 17 de baze între ARNm și secvențele orientate spre exterior complementare, astfel promovând clivarea niARN-ului de către RNaza P la nucleotidă localizată la situl 5' al regiunii de baze 19 perechi. Id.

într-o metodă alternativă, centru restaurarea fertilității masculine, plantele transgenice 21 masculin sterile conțin un vector de expresie care, față de o secvență promotor legată funcțional la o genă streptavidină, conține de asemenea un element procariotic de reglare. Sunt 23 produse plante transgenice masculin fertile care exprimă o polipeptidă procariotă sub controlul promotorului. în hibrizii F1, polipeptidă procariotă se leagă la secvența procariotă 25 de reglare și reprimă expresia avidinei.

De exemplu, sistemul operator genă LexA/operator LexA poate fi folosit pentru a 27 regla expresia genei conform prezentei invenții. Vezi, brevet US 4833080 (brevetul 080) și Wang și colab., Mol. Cell. Biol. 13:1805 (1993). Mai precis, vectorul de expresie al plantei 29 masculin sterilă va conține secvența operator LexA, în timp ce vectorul de expresie a plantei masculin fertilă va conține secvențele de codificare ale represorului LexA. în hibridul F1, 31 represorul LexA se va lega la 'secvența operator LexA și va inhiba transcripția genei streptavidină. 33

Molecule ADN operator LexA pot fi obținute, de exemplu, prin sintetizarea de fragmente ADN care conțin secvența operator LexA bine cunoscută. Vezi, de exemplu, brevetul 35 080 și Garriga și colab., Mol. Gen. Genet. 236:125 (1992). Gena LexA poate fi obținută prin sintetizarea unei molecule ADN care codifică represorul LexA. Tehnici de sinteză a genei s- 37 au discutat mai sus și s-au descris secvențe genă LexA, de exemplu, de către Garriga și colab., supra. Alternativ, molecule ADN care codifică represorul LexA pot fi obținute de la 39 plasmidul pRB500, număr de acces 67758 la American Type Culture Collection.

Specialiștii în domeniu pot concepe alte strategii de restaurare a fertilității masculine, 41 folosind sisteme procariote de reglare, cum ar fi sistemul represor lac/operon lac sau sistemul represor trp/operon tip. 43 încă o altă metodă pentru restaurarea fertilității utilizează afinitatea ridicată a avidinei pentru biotină, prin pulverizarea pe plante în dezvoltare, a unei soluții de biotină. Soluția de 45 biotină poate cuprinde o cantitate minimă dintr-un cosolvent organic, cum ar fi DMSO, pentru a asigura solubilitatea completă a biotinei. Cu toate acestea, soluția de biotină poate să nu 47 conțină un cosolvent organic. Pulverizarea poate începe de la momentul fazei meiotică a

RO 120920 Β1 dezvoltării polenului. Pulverizarea poate începe la fel de bine mai târziu în dezvoltarea polenului. Pulverizarea se repetă, în general, la intervale regulate până când se observă răspândirea polenului. Intervalul dintre pulverizări va varia între 1 și 7 zile. într-o realizare preferată a invenției, pulverizarea se repetă la fiecare 3 până la 5 zile.

6. Producerea semințelor hibrid cu trăsături de granulă dorite

Semințe hibrid cu una sau mai multe trăsături de granulă sau sămânță pot fi produse în mod avantajos, folosind liniile de plantă masculin sterilă ale prezentei invenții. O linie transgenică, purtând gena streptavidină, este încrucișată, ca părinte feminin masculin steril, cu o plantă polenizatoare masculin fertilă care poartă una sau mai multe gene pentru o trăsătură de granulă sau sămânță dorită. Linia de plantă polenizatoare masculin fertilă de preferință este homozigotă, pentru gena(ele) controlând trăsătura de granulă sau sămânță dorită. Semințe hibrid, având trăsătura de granulă sau sămânță dorită, sunt produse prin intermediul acestei metode și sunt recoltate. La metoda pentru producerea semințelor hibrid în care un părinte masculin steril este încrucișat cu o linie polenizatoare masculin fertilă, purtând una sau mai multe gene pentru o trăsătură de granulă sau sămânță dorită, uneori se face referință ca la metoda superioară de încrucișare. (Vezi, de exemplu, brevet US 5196636, care este încorporat aici, prin referire).

Liniile masculin sterile și masculin fertile încrucișate, pentru a face semințe hibrid, ale invenției de față, pot fi orice combinație compatibilă a liniilor hibride, rezultate din încrucișări selective sau sintetice. O linie transgenică, purtând gena streptavidină legată funcțional la un promotor constitutiv sau inductiv, este produsă folosind metodele descrise mai sus. Linia masculin sterilă poate purta una sau mai multe copii ale genei streptavidină.

O linie transgenică masculin sterilă, care poartă gena streptavidină, poate fi individualizată prin supresia sterilității masculine prin oricare dintre metodele descrise mai sus. De exemplu, ribozimele pot fi desemnate să exprime activitate endonuclează, care este direcționată la o anumită secvență țintă în molecula ARNm streptavidină. Gena care codifică ribozima este legată funcțional la un promotor inductiv. Planta masculin sterilă este tratată cu inductorul, ribozima este exprimată și ARNm streptavidină inactivat, ceea ce duce la restaurarea fertilității masculine. în mod alternativ, fertilitatea este restaurată prin utilizarea unei secvențe nucleotidice care codifică un ARN antisens. Legarea moleculelor ARN antisens la molecule ARNm țintă are drept rezultat orpirea hibridizării translației. în contextul prezentei invenții, o moleculă ARN antisens corespunzătoare va avea o secvență care este complementară la ARNm streptavidină. într-o realizare preferată a invenției, ARN-ul antisens este sub controlul unui promotor inductiv. Activarea acestui promotor permite apoi restaurarea fertilității masculine.

într-o cale suplimentară, alternativă, transcriptaze ARN capabile să promoveze clivajul mediat RNază P al moleculelor ARNm streptavidină sunt produse în linia masculin sterilă. Conform acestei căi, o secvență orientată spre exterior poate fi construită pentru direcționarea ribozimei endogene, RNază P, la ARNm streptavidină, care este clivată ulterior prin ribozimă celulară. Transcriptele secvenței orientate spre exterior se leagă la speciile ARNm țintite prin formarea perechilor de baze între ARNm și secvențele orientate spre exterior complementare, promovând astfel clivajul ARNm, de către RNază P, la nucleotida localizată la situl 5' al regiunii de baze perechi.

într-o altă realizare pentru restaurarea fertilității masculine, sunt produse linii de plantă transgenică masculin sterilă, care conțin un vector de expresie care, în plus față de o secvență promotor legată operabil la o genă streptavidină, conține de asemenea un element de reglare procariotic. Sunt produse linii transgenice care conțin această genă streptavidină, împreună cu o genă care codifică o genă procariotică legată funcțional la un

RO 120920 Β1 promotor inductiv. Linia transgenică de plantă este tratată cu inducătorul, pentru a produce 1 polipeptidă procariotă care se leagă la secvența procarită de reglare, reprimă expresia avidinei și restaurează fertilitatea masculină. 3 încă o altă metodă pentru restaurarea fertilității utilizează afinitatea ridicată a avidinei pentru biotină. Linii transgenice masculin sterile sunt pulverizate cu o soluție de biotină. 5 Biotina se leagă la streptavidină și inactivează, prin aceasta restaurând fertilitatea masculină.

Liniile transgenice masculin sterile, în general, sunt pulverizate cu biotină, chiar în faza 7 meiotică, când începe dezvoltarea polenului, deși pulverizarea biotinei poate începe mai târziu. într-o realizare preferată, supresia sterilității masculine este atinsă prin pulverizarea 9 plantei cu biotină.

Liniile polinezatoare, masculin sterile și masculin fertile, pentru producerea semințelor 11 hibrid cu o trăsătură de granulă sau sămânță dorită, conform metodelor invenției de față, sunt linii rezultate din încrucișări selective, linii hibride, linii deschise polenizate sintetic sau stoc 13 genetic. Liniile rezultate din încrucișări selective, liniile hibride, liniile deschise sintetic polenizate sau stocul genetic sunt produse prin oricare dintre metodele bine cunoscute 15 specialiștilor care cresc plante. Vezi, de exemplu, J. M. Roehlman. BREEDING FIELD CROPS, 3rd ed (Van Nostrand and Reinhold, New York, NY, 1986), care este încorporat aici 17 prin referire. S-au făcut încrucișări test între linii selectate, rezultate din încrucișări selective și/sau linii hibrid, pentru a evalua capacitatea specifică de combinare. S-au identificat 19 combinații acceptabile comercial.

Este selectată o linie de plantă polenizatoare masculin fertilă, care (1) poartă una sau 21 mai multe gene pentru o trăsătură de granulă sau sămânță dorită și (2) este compatibilă cu linia masculin sterilă cu care se va încrucișa. Gena(ele) care controlează trăsătura de 23 granulă sau trăsătura de sămânță selectată poate fi dominanză, astfel încât trăsătura este exprimată rapid în semințele hibrid. Cu toate acestea, gena(ele) care controlează trăsătura 25 de granulă sau trăsătura de sămânță selectată poate fi recesivă. în situația în care aena care controlează trăsătura de granulă sau sămânță este recesivă, linia masculin sterilă și linia 27 polenizatoare masculin fertilă sunt fiecare selecționate pentru a purta această recesivitate. în situația în care gena(ele) care controlează trăsătura de granulă sau de sămânță de interes 29 este recesivă atât planta masculin sterilă, cât și cea polenizatoare, de preferință, sunt homozigote pentru gena(ele), astfel încât fenotipul dorit este exprimat în toate semințele 31 produse prin încrucișare. în conformitate, liniile masculin sterile si polinezatoare masculin fertile pot purta fiecare gene care controlează o trăsătură de granulă sau sămânță în 33 semințele descendente. Gena(ele) pentru trăsătura de granulă sau sămânță sunt introduse în linia masculin sterilă sau linia polenizatoare masculin fertilă prin metode tradiționale de 35 selecționare și/sau tehnici de inginerie genetică.

Trăsătura de granulă sau sămânță dorită este o caracteristică nutrițională sau 37 fiziologică a seminței care afectează semnificativ tipul industrial, germinarea sau rezistența la boli. Trăsătura de granulă sau sămânță dorită include astfel de caracteristici, cum ar fi 39 conținutul de ulei, proteină și amidon, precum și calitatea proteinei și tipul de amidon. Metodele prezentei invenții sunt folosite pentru a produce tipuri de sămânță sau granulă 41 specializate, care se folosesc pe piețe diferite. Uleiul superior de porumb, de exemplu, se folosește pentru a înlocui grăsimile animale adăugate la hrana animalelor. Amiloza 43 superioară de porumb este folosită pentru a face filme de plastic, adezive, degradabile, și materiale de ambalaj. Amidonul de la substanța ceroasă de porumb se utilizează în multe 45 diferite alimente, cum ar fi supe și budinci.

Linia polenizatoare masculin fertilă poate purta una sau mai multe gene care 47 afectează caracteristicile amidonului sau proteinei. Genele care afectează caracteristicile

RO 120920 Β1 amidonului sau proteinei includ, dar nu se limitează la zahăr (su), amiloză-material de umplutură (ae), friabil (bt), teșit (du), făinos (fi), opac (o), transversal (h), ajustat (sh) și ceroș (wx). (Vezi, de exemplu, Hannah și colab., Sci. Hortic. 55: 177-197 (1993)). Proprietățile amidonului obținut de la plante de porumb homozigote recevise pentru ae, du, wx, ae și aewx au fost caracterizate. (Vezi, Brockett și colab., Starch/Starke 40: 175-177(1988) și brevet US 5516939).

în mod alternativ, linia polenizatoare poate fi transformată cu o genă care afectează conținutul de amidon. De exemplu, polenizatorul masculin fertil poate fi transformat cu o genă bacteriană care codifică ADPglucoz pirofosforilaza care este activă în prezența metabolicilor care inhibă enzimă de plantă. Sămânța care rezultă are un conținut de amidon mai ridicat. (Vezi, Sivak și colab., J. ofEnviron. Polymer Degradation 3(3): 145-152 (1995)).

Linia polenizatoare poate purta una sau mai multe gene care afectează conținutul de acid gras. De exemplu, gena fanl controlează acidul gras linolenic inferior în soia. Hammond și colab., Crop Sci. 231: 192 (1993). Gena fas¹ controlează conținutul înalt de acid gras stearic superior în soia. Graef și colab., Crop Sci. 2.5:1076 (1985). Genele fap1 și fap2 controlează conținutul scăzut și, respectiv, ridicat de acid palmiticîn soia. (Erickson și colab., Crop Sci. 18: 544 (1988)).

Linia polenizatoare poate fi transformată cu o genă care afectează conținutul de ulei din semințe. De exemplu, linia polenizatoare poate purta o genă care codifică proteina care poartă stearoil-acil (stearoil-ACP) desaturază care catalizează prima etapă de desaturare în biosinteză uleiului de semințe. Gena stearoil-ACP desaturază poate fi legată operabil la un promotor specific seminței. Plante cum ar fi floarea-soarelui, porumb, canola sau soia, transformate cu gena stearoil-ACP desaturază, produc niveluri alterate de acid stearic și pot fi utilizate pentru a produce ulei din semințe care conține niveluri modificate sau alterate de acizi grași saturați sau nesaturați. (Vezi, de exemplu, brevet US 5443974).

în mod alternativ, linia polenizatoare poate purta o genă antisens care inhibă expresia unei gene țintă, pe calea biosintetică a trăsăturii de granulă sau sămânță- De exemplu, linia polenizatoare poartă o genă antisens care inhibă expresia stearoil-acil desaturazei. Gena antisens poate fi legată operațional la un promotor specific seminței. Plantele transformate cu gena antisens stearoil-ACP desaturază produc niveluri crescute de stearat în semințe. (Vezi, de exemplu, Knutzon și colab., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2624-2628 (1992).

Raportul de semințe părinte masculin sterile la semințe părinte polenizatoare masculin fertile, în câmpul de producție semințe conform metodei de încrucișare Top, depinde caracteristicile genetice ale fiecărui părinte și este variată pentru a conduce la recolte optime. Raportul părinte masculin steril la părinte polenizator masculin fertil variază de la aproximativ 6:1 până la aproximativ 9:1. De preferință, raportul părinte masculin-steril la părinte polenizator masculin fertil este de aproximativ 8:1. Mai preferabil, raportul părinte masculin steril la părinte polenizator masculin fertil este de aproximativ 9:1.

Prezenta invenție, descrisă deci, în general, va fi înțeleasă mai rapid, prin referire la următoarele exemple, care sunt asigurate pe calea ilustrării și nu se intenționează a limita prezenta invenție.

Exemplul 1. Prepararea porumbului transgenic cu sterilitate masculină prin expresia constitutivă înaltă a streptavidinei

O metodă pentru formarea plantelor de porumb transgenic a fost descrisă în cererea de brevet european 0442174A1, care este încorporat aici prin referire. Urmează o descriere pe scurt a acestei metodologii.

PHI5168, un vector purtând gena streptavidină sub controlul promotorului ubiguitină

RO 120920 Β1 și, de asemenea, conținând o secvență terminator PINII, s-a folosit pentru a forma plante de 1 porumb transgenice. Structura PHI5168 este prezentată în fig. 1. PHI610, un vector de expresie purtând gena bar sub controlul promotorului dublu 35S și, de asemenea, purtând 3 o secvență terminator PINII, s-a cotransformat de-a lungul constructului streptavidină, permițând selectarea plantelor transgenice prin tratamentul amestecului de transformare cu 5 bialofos. Structura PHI610 este prezentată în fig. 2. Cei doi vectori de expresie s-au transformat în culturi embriogenice în suspensie, pentru a fi derivate de la cultura embriogenică 7 de tip II, conform metodei lui Green și colab., Molecular Genetics of plants and Animals, editori Downey și colab., Academic Press, NY, 20, 147 (1983). Culturile s-au menținut în 9 mediu Murashige și Skoog (MS), așa cum s-a descris în Murashige și colab., Physio. Plant L5:453 (1962), suplimentat cu 2 mg/l acid 2,4-diclorofenoxiacetic (2,4-D) si 30 g/1 sucroză. 11 Culturile în suspensie s-au trecut printr-o sită cu 710 μ cu 7 zile înainte de experiment și filtratul s-a menținut în mediu MS. 13

Celulele s-au recoltat de la cultura în suspensie prin filtrare în vid pe o pâlnie Buchner (Whatman nr. 614) și 100 ml (greutate proaspătă) celule s-au plasat pe o placă Petri de 3,3 15 cm. Celulele s-au dispersat în 0,5 ml mediu de cultură proaspătă, pentru a forma un strat subțire de celule. Placa Petri neacoperită se plasează în camera de probe a unui dispozitiv 17 cu particulă proiectil, fabricat de către Biolistics Inc. (Geneva, NY). S-a folosit o pompă de vid pentru a reduce presiunea în cameră la 0,1 at, pentru a reduce încetinirea micropar- 19 ticulelor prin amortizare cu aer. Celulele au fost bombardate cu particule de tungsten având un diametru mediu de aproximativ 1,2 μ (GTE Sylvania Precision Materials Group, Towanda, 21

Pennsylvania). Un amestec egal de PHI5168 și PHI610 s-a turnat pe microparticule, prin adăugarea a 5 μΙ dintr-o soluție ADN (1 μg ADN per 100 lamda) în tampon TE la pH 7,7 până 23 la 25 μΙ dintr-o suspensie de 50 mg particule de tungsten per ml apă distilată, într-o eprubetă Eppendorf de 1,5 ml. Particulele formează agregate și se fixează pe eprubetă. 25

Culturile celulelor plantei transformate, conținând gene străine, s-au cultivat timp de

4...8 săptămâni în 560R (mediu)(mediu pe bază de N6 cu 1 mg/ml bialofos). Acest mediu 27 selectează pentru celule care exprimă gena bar.

Formarea embrionului s-a indus apoi în culturi embriogenice și celulele au germinat 29 în plante. S-a folosit o a doua secvență de mediu de cultură la embrioni somatici germinați pe mediu de menținere a călușului. Călușul s-a transferat mai întâi la un mediu de cultură 31 (mediu de maturare) conținând 5,0 mg/l acid indolacetic (IAA), timp de 10 până la 14 zile, în timp ce proliferarea călușului a continuat. încărcarea călușului a fost la 50 mg per placă, 33 pentru a optimiza recuperarea materialului per unitate de masă.

Călușul s-a transferat apoi de la mediul de maturare la un al doilea mediu de cultură 35 care conține un nivel redus de IAA (1 mg/l) în comparație cu primul mediu de cultură. Culturile sunt plasate în lumină la acest punct. Embrioni somatici care germinează sunt 37 caracterizați printr-o alungire a mlădiței verzi cu un acces la rădăcina de legătură. Embrioni somatici s-au transferat apoi la mediu într-o eprubetă de cultură (150x25 mm). Pentru un 39 supliment de 10...14 zile. în acest moment, plantele au aproximativ 7...10 cm înălțime și au fost de mărime și vigoare suficiente pentru a fi rezistente la condițiile de seră. 41

Pentru a întări plantele regenerate, plante care vor fi transferate la camera de creștere, s-au îndepărtat din camera de creștere, din containerele sterile, și s-au spălat rădăcinile 43 cu mediu cu agar solidificat. Plantulele s-au plasat într-un amestec de conservare comercial, într-o cameră de creștere cu un dispozitiv de pulverizare pentru menținerea umidității relative 45 de aproape 100%, fără umezirea excesivă a rădăcinilor de plantă. După 3...4 săptămâni în camera de pulverizare, plantele au fost destul de robuste pentru transplantare în condiții de 47 câmp.

RO 120920 Β1

Plantele din câmp s-au analizat prin observarea sterilității masculine. Plantele selectate s-au analizat apoi suplimentar, prin metode standard, pentru prezența genei streptavidină prin PCR și Southern blotting, și pentru expresia avidinei prin ELISA.

S-au analizat 94 plante prin PCR, dintre care 53 s-au găsit a fi fertile și 41 sterile. Atunci când fertilitatea fiecărei plante s-a comparat prin PCR pentru prezența genei streptavidină, s-a găsit o corelație de 98% între prezența genei streptavidină prin Southern blotting. Cinci plante s-au analizat în detaliu cu analiză Southern pentru prezența genei streptavidină. Trei plante au arătat a conține gena streptavidină prin analiză Southern. Toate cele trei plante au prezentat sterilitate. Două plante care nu au avut gena streptavidină au fost complet fertile. Există astfel o corelație de 100% între prezența genei streptavidină și sterilitate masculină.

Exemplul 2. Utilizarea tulpinilor de Agrobacterium care conțin un vector binar incluzând o secvență ADN care codifică streptavidină la plante de soia transgenice generate masculin sterile

O metodă pentru obținerea plantelor transgenice de soia este cea descrisă în cererea de brevet US Ser. 07/920409, care este încorporat aici prin referire. Sămânță de soia (Glycina max), de varietate Pioneer 9341, se sterilizează la suprafață prin expunerea la clor gazos desfășurat într-un clopot de sticlă. Gazul se produce prin adăugarea a 3,5 ml acid clorhidric (34 până la 37% g/g) până la 100 ml hipoclorit de sodiu (5,25% gig). Expunerea se face timp de 16 până la 20 h, într-un container de aproximativ 1 picior cubic în volum. Sămânța sterilizată la suprafață este depozitată pe un disc Petri la temperatura camerei. Sămânța a germinat prin prin placarea unui mediu de agar solidificat, de rezistență 1/10, conform cu Gambourg (mediu bazai BS cu substanțe organice minime, catalog Sigma Chemical nr. G5893, 0,32 gm/1 sucroză;0,2% greutate/volum acid 2-(N-morfolino) etansulfonic (MES), (0,3 mM) fără regulatori de creștere a plantei și cultivarea la 28°C, cu 16 h lumină naturală și iluminarea fluorescentă albă rece de aproximativ 20 μΕη² S‘¹. După 3 sau 4 zile, sămânța este preparată pentru cocultivare. Sămânța acoperită este îndepărtată și radicalul alungirii este îndepărtat 3 până la 4 mm sub cotiledoane.

Culturi peste noapte, ale tulpinii LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens, adăpostind un plasmid binar modificat, conținând gena streptavidină, sunt crescute la faza log în mediu A minim, conținând tetraciclină, 1 pg/ml și sunt colectate și se ia o măsurătoare de densitate optică la 550 nm. Volumul satisfăcător al culturii se plasează în eprubete conice, pentru centrifugare de 15 ml, astfel încât pe sedimentarea între 1 și 2x10¹⁰ celule, sunt colectate în fiecare eprubetă cu 10⁹ celule/ml. Sedimentarea este prin centrifugare. După centrifugare supernatantul se decantează și eprubetele se păstrează la temperatura camerei, până când inoculul lipsește, dar nu mai mult de o oră.

Inoculările sunt introduse în dozatoare, astfel încât fiecare placă cu semințe se tratează cu un nou pelet resuspendat de Agrobacterium. Peletele bacteriene sunt resuspendate individual în 20 ml mediu de inoculare, conținând săruri BS (GS893) 3,2g/ml, sucroză 2,0% g/v; 6-benzilaminopurină (BAP) 45 pl; acid indolbutiric (IBA) 0,5 μΜ; acetosiringonă (AS) 100 μΜ; tamponat la pH 5,5 cu MES 10 mM. Resuspendarea se realizează prin amestecare turbionară. Apoi inoculul se toarnă într-un disc Petri care conține semințe preparate și nodurile cotiledonare sunt macerate cu o paletă medicinală. Aceasta este însoțită de divizarea seminței la jumătate prin secțiune longitudinală, cu o paletă medicinală, prin curățare repetată de-a lungul axei de simetrie. Se are grijă să nu se taie complet explantul la situl axial. Explantele se prepară în aproximativ 5 min și apoi se incubează timp de 30 min la temperatura camerei cu bacterie, dar fără agitare. După 30 min, explantele sunt transferate în plăci cu același mediu solidificat cu Gelrite (Merck and Company, Inc.), 0,2% g/v.

RO 120920 Β1

Explante sunt încorporate cu situl adaxial superior și îndreptate cu suprafața mediului și 1 cultivate la 22°C, timp de 3 zile sub lumină fluorescentă albă rece, aproximativ 20 pEm’²S'¹.

După 3 zile, explantele s-au mutat la mediu lichid de contraselecție, conținând săruri 3 B5 (G5893), 3,2 g/l; sucroză, 2% g/v; BAP, 5 μΜ; IBA, 0,5 pM; vancomicina, 200 pg/ml; cefotaximă, 500 pg/ml, tamponat la pH 5,7 cu MES, 3 mM. Explantele se spală în fiecare 5 disc Petri, cu agitare giratorie redusă, constantă, la temperatura camerei, timp de 4 zile. Mediul de contraselecție se înlocuiește de 4 ori. 7

Explantele sunt apoi sortate, la mediul de selectare cu agaroză solidificată, conținând săruri B5 (G5893), 3,2 g/l; sucroză, 2% g/v; BAP, 5,0 uM; IBA, 0,5 μΜ; sulfat de kanamicină, 9 pg/ml; vancomicină, 100 ug/ml; cefotaxim, 30 pg/ml; timentin, 30 pg/ml, tamponat la pH 5,7 cu MES, 3 mM. Mediul de selecție este solidificat cu Seakem Agarose, 0,3% g/v. 11 Explantele sunt încorporate în mediu, sit adaxial descendent și se cultivă la 28’C, cu 16 h lumină naturală, în iluminare fluorescentă albă rece, la 60 până la 80 pEm‘²S'¹. 13

După 2 săptămâni explantele s-au spălat din nou cu mediu lichid pe un agitator giratoriu. Spălarea este condusă peste noapte, în mediu de contraselecție conținând sulfat de 15 kanamicină, 50 pg/ml. Următoarea zi, explantele sunt sortate la mediu de selectare cu agaroză solidificată. Acestea sunt încorporate în mediu sit adaxial descendent și se cultivă 17 pentru altă perioadă de 2 săptămâni.

După o lună pe mediu de selecție, țesutul transformat este vizibil ca sectoare verzi 19 ale țesutului de regenerare față de un fond de țesut nesănătos decolorat. S-au îndepărtat explante fără sectoare verzi și explante cu sectoare verzi s-au transferat la mediu de alungire 21 conținând săruri B5 (G5893), 3,2 g/l; sucroză, 2% g/v; IBA, 3,3 pM; acid giberelic, 1,7 pM; vacnomicină, 100 pg/ml; cefotaxim, 30 pg/ml; și timentin, 30 pg/ml, s-a tamponat la pH 5,7 23 cu MES, 3 mM. Mediul de alungire este solidificat cu Gelrite, 0,2% g/v. Sectoarele verzi sunt încorporate sit adaxial superior și se cultivă ca mai sus. Cultura se continuă pe acest mediu, 25 cu transferuri la plăci proaspete, la fiecare două săptămâni. Când mlădițele au 0,5 cm în lungime, se execizează la bază și se plasează în mediu de înrădăcinare în eprubete test de 27 13x100 ml. Mediul de înrădăcinare constă din săruri BS (G5893), 3,2 g/l; sucroză, 15 g/l; acid nicotinic, 20 pM; acid piroglutamic (PGA), 900 mg/l si IBA, 10 pM. Mediul de înrădăcinare 29 este tamponat la pH 5,7 cu MES, 3 mM și se solidifică cu Gelrite la 0,2% g/v. După 10 zile, mlădițele sunt transferate la același mediu fără IBA sau PGA. Mlădițele sunt înrădăcinate și 31 se păstrează în aceste eprubete, în aceleași condiții de mediu ca mai înainte.

Când un sistem de rădăcină este bine stabilit, plăntuța este transferată la sol steril. 33 Temperatura, fotoperioada și intensitatea luminii rămân aceleași ca mai înainte.

Expresia streptavidinei în plante transgenice de soia este confirmată și cuantificată, 35 folosind ELISA, și prezența genei este confirmată prin PCR și Southern blotting. Stabilitatea expresiei poate fi evaluată prin aceste aceleași metode pe generații succesive. Probleme de 37 sterilitate se găsesc la corelarea cu expresia avidinei în soia.

Exemplul 3. Prepararea plantelor de floarea-soarelui masculin sterile prin expresia 39 streptavidinei.

O casetă de expresie care codifică streptavidină este folosită pentru a genera plante 41 transgenice de floarea-soarelui și semințe. Secvența ADN care codifică pentru streptavidină este inserată într-o casetă de expresie, sub controlul promotorului ubiguitină. Această casetă 43 de expresie este apoi subclonată într-un vector binar cum ar fi PHI5765, folosind un sit EcoRI. Vectorul binar este apoi transferat într-o tulpină helper de Agrobacteriumtumefaciens. 45

Plante de floarea-soarelui sunt transformate cu tulpina LBA4404 de Agrobacterium, după bombardament cu microparticule, așa cum s-a descris de către Bidney și colab., Plant 47 Mol. Biol. 1£: 301 (1992). Pe scurt, semințe de floarea soarelui linia SMF-3 Pioneer se decojesc și se sterilizează la suprafață. Semințele sunt îmbibate la întuneric,, la 26’C, timp 49

RO 120920 Β1 de 18 h, pe hârtie de filtru umezită cu apă. Cotiledoanele și radicalul de rădăcină sunt îndepărtate și meristemul de explante se cultivă pe mediu 374BGA (săruri MS, vitamine Shephard, 40 mg/l sulfat de adenină, 3% sucroză, 1,3% fitagar, pH 5,6 plus 0,5 mg/l BAP, 0,25 mg/l, IAA și 0,1 mg/l GA). După 24 h, straturile primare s-au îndepărtat pentru a expune meristemul apical și explantele s-au plasat cu dom apical, finisând în amontele unui cerc de 2 cm, în centrul unei plăci Petri 60 mm prin 200 mm conținând apă agar. Explantele sunt bombardate de două ori cu particule de tungsten suspendate în tampon TE sau cu particule asociate cu un plasmid de expresie conținând gena streptavidină. Meristeme de explante sau cocultivat pe mediu 374BGA în lumină, la 26°C, timp de încă 72 h de cocultură.

Meristeme de Agrobaterium tratate sunt transformate, urmând perioada de cocultură de 72 h la mediu 374 (374 BGA cu 1% sucroză și câtuși de puțin BAP, IAA sau GA-,) și suplimentat cu 250 ug/ml cefotaxim. Plantulele se lasă să se dezvolte pentru încă 2 săptămâni în condiții de incubare de 16 h zi și 26’C, până la verde sau decolorare. Plantulele sunt transferate la mediu conținând kanamicină și se lasă să crească. Prezența streptavidinei în plante este confirmată și se cuatifică așa cum s-a descris în exemplul 2. Prezența sterilității masculine se găsește pentru a corela cu expresia streptavidinei din plante.

Deși prin referirile anterioare la anumite realizări preferate, se va înțelege că prezenta invenție nu este limitată. Specialiștii în domeniu vor observa că diferite modificări potfi făcute la realizările descrise și că astfel de modificări se intenționează să fie în întinderea prezentei invenții, care este defintă de către următoarele revendicări. Toate publicațiile și cererile de brevet menționate în această descriere sunt cele care arată nivelul specialistului în domeniu la care invenția se adresează.

LISTA DE SECVENȚE <110> HOWARD, JOHN A.

ALBERTSEN, MARC C.

<120> INDUCEREA STERILITĂȚII MASCULINE LA PLANTE PRIN EXPRIMAREA DE NIVELURI RIDICATE DE STREPTAVIDINĂ <130> 33229/734 <140>

<150> 08/893,049 <151 > 1997-07-14 <150> 08/475,582 <151 > 1995-06-07 <160> 6 <170> Patentln Ver. 3.3.

<210> 1 <211> 64 <212> adn <213> Organism necunoscut <220>

<223> Descrierea organismului necunoscut: casetă anteră 5126 <400> 1 gcggccgcgg atccgctcat ctgctcggta ccaaccagcc tttcctatta ccatgcacag 60 atct 64 <210>2 <211 >94 <212> ADN <213> Organism necunoscut <220>

<223> Descrierea organismului necunoscut: casetă anteră SGB6

RO 120920 Β1 <400> 21 acagttcact agatatgcat gatctttaac aattgctgct ggattgtgcg gtttcttttg 60 gcacaaatgg catgaacaga gtaatccggg acgc 943 <210>3 <211>1365 <212> ADN <213> Organism necunoscut7 <220>

<223> Descrierea organismului necunoscut: casetă anteră G9<400> 39 gccgccgcgg atcctggctg gatgaaaccg atgcgagaga agaaaaaaaa attgttgcat 60 gtagttggcg cctgtcaccc aaccaaacca gtagttgagg câcgccctgt ttgctcacga 12011 tcacgaacgt agatct136 <210> 413 <211> 142 <212>ADN15 <213> Organism necunoscut <220>17 <223> Descrierea organismului necunoscut: promotor principal 5126 <400>419 agatctaagt aaggtatata tgtgcatagt ctcctaattc ttcatcttca acctctagct 60 gattgatctc tggtatttac cactctttcc ttccttcctt ccttcaattc taaataccac 12021 aaatcaaagt tgctttgccatg142 <210> 523 <211> 38 <212> ADN25 <213> Organism necunoscut <220>27 <223> Descrierea organismului necunoscut: promotor principal SGB6 <400> 529 atctcaccct attaatacca tgctgacgag ccaatagc 38 <210>631 <211> 107 <212>ADN33 <213> Organism necunoscut <220>35 <223> Descrierea organismului necunoscut: promotor principal G9 <400> 637 agatctctat aaaacacgca gggactggaa agcgagattt cacagctgaa agcagccaaa 60 acgcagaagc tgcactgcat acatcgagct aactatctgc agccatg 10739

Claims (12)

1. Revendicări41

   1. Moleculă de ADN izolată, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde un 43 promotor specific anterei, legat funcțional la o secvență nucleotidică ce codifică pentru streptavidină.45
2. 2. Vector de expresie, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde molecula de ADN izolată din revendicarea 1.47

   RO 120920 Β1
3. 3. Plantă transgenică, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde numitul vector de expresie din revendicarea 2.
4. 4. Plantă transgenică, conform revendicării 3, caracterizată prin aceea că numita plantă este selectată din grupul de plante alcătuit din porumb, soia și floarea-soarelui.
5. 5. Vector de expresie, conform revendicării 2, caracterizat prin aceea că secvența de nucleotide, codificând pentru o secvență semnal, este legată funcțional la numita secvență de nucleotide, care codifică pentru streptavidină.
6. 6. Vector de expresie, conform revendicării 5, caracterizat prin aceea că numita secvență semnal este o secvență semnal a/fa-amilază de la orz.
7. 7. Procedeu de obținere a unei plante transgenice cu sterilitate masculină, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde introducerea în celulele de plantă a unui vector de expresie cuprinzând un promotor compatibil plantei, legat funcțional la o secvență nucleotidică care codifică pentru streptavidină și regenerarea unei plante transgenice de la numitele celule transformate, în care numitul promotor controlează expresia numitei gene, și prin aceasta, caseta de expresie a numitei gene determină sterilitate masculină, numitei plante transgenice.
8. 8. Procedeu în conformitate cu revendicarea 7, caracterizat prin aceea că numita secvență promotor compatibil plantei este o secvență promotor specific de anteră și cuprinde o casetă anteră, selectată din grupul format din:

   a) o moleculă ADN având secvența de nucleotide din SEQ ID. Nr: 1;

   b) o moleculă ADN având secvența de nucleotide din SEQ ID. Nr: 2;

   c) o moleculă ADN având secvența de nucleotide din SEQ ID. Nr: 3, și

   d) un fragment funcțional al oricăreia dintre secvențele de la punctele a), b) sau c).
9. 9. Procedeu în conformitate cu revendicarea 7, caracterizat prin aceea că numita secvență promotor este o secvență promotor specific de anteră și cuprinde o casetă anteră, selectată din grupul format din:

   a) un promotor principal CaMV 35S;

   b) o moleculă ADN având secvența de nucleotide din SEQ ID. Nr: 4;

   c) o moleculă ADN având secvența de nucleotide din SEQ ID. Nr: 5;

   d) o moleculă ADN având secvența de nucleotide din SEQ ID. Nr: 6, și

   e) un fragment funcțional al oricăreia dintre secvențele de la punctele b), c) sau d).
10. 10. Procedeu de obținere a unei plante hibride cu fertilitate masculină, utilizând gena streptavidină, caracterizat prin aceea că acesta cuprinde etapele:

    a) producerea unei prime plante cu sterilitate masculină părinte, cuprinzând o moleculă ADN cuprinzând un promotor compatibil plantei, legat funcțional la o secvență nucleotidică ce codifică pentru streptavidină, în care expresia numitei streptavidină determină sterilitate masculină;

    b) producerea unei a doua plante transgenice părinte, exprimând o a doua genă străină; și

    c) fertilizarea prin încrucișarea numitului prim părinte cu numitul al doilea părinte, pentru a produce o plantă hibrid, în care numita plantă hibrid să exprime numita a doua genă străină și în care produsul numitei a doua gene străine reduce expresia streptavidinei în numita plantă hibrid, prin aceasta, producând o plantă hibrid cu fertilitate masculină.
11. 11. Procedeu în conformitate cu revendicarea 10, caracterizat prin aceea că numita a doua genă străină este selectată din grupul alcătuit dintr-o genă antisens, o genă ribozimă și o secvență genică ghid cu orientare la exterior.
12. 12. Procedeu în conformitate cu revendicarea 10, caracterizat prin aceea că numita moleculă ADN, a numitei prime plante părinte, cuprinde în plus un operator LexA, care este legat funcțional la numitul promotor și în care numita a doua genă străină este gena represor LexA.