CN115029249B - 一种拮抗马铃薯疮痂病病菌的真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拮抗马铃薯疮痂病病菌的产紫篮状菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明公开一种产紫篮状菌，其于2022年03月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。还公开产紫篮状菌以及包含产紫篮状菌和/或其代谢产物的微生物菌剂在防治马铃薯疮痂病中的应用和在抑菌中的应用。本发明公开的产紫篮状菌及其代谢产物可以抑制致病性链霉菌在寄主上引起细菌性病害的发生，为马铃薯疮痂病的防治提供新的生防菌类型，对解决马铃薯生产的瓶颈问题具有重要意义。

Description

一种拮抗马铃薯疮痂病病菌的真菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种拮抗马铃薯疮痂病病菌的真菌及其应用。
背景技术
马铃薯是世界上仅次于小麦、水稻和玉米的第四大粮食作物，而我国是世界上第一大马铃薯生产国。马铃薯含有丰富的营养物质，常作为主要粮食、蔬菜和加工原料作物在我国广泛种植。马铃薯块茎生长在土壤之内，常常遭受土传病害的严重困扰，尤其是长期连作种植导致病虫害大量聚集和流行，大大限制了马铃薯增产的潜能，其中以马铃薯疮痂病最为严重，所造成的的经济损失也最大。
马铃薯疮痂病(Potato common scab)，一种土传性细菌病害，其可影响马铃薯块茎的外观、等级和品质。该病害在绝大多数种植马铃薯的土壤中均分布，是一种非常严重的世界级病害。马铃薯疮痂病是由致病性链霉菌(Streptomyces spp.)引起，至今已鉴定和报道了20多种病原菌，并不断有一些新的链霉菌致病种被发现，呈现出较大的多样性和复杂性。其中，S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies被世界公认为引起马铃薯疮痂病的最普遍的病原菌，发病比例可达90％以上。此外，上述马铃薯疮痂病病原菌除危害马铃薯外，还可危害甜菜、芜菁、红薯、胡萝卜、萝卜等其它根茎类作物。
马铃薯疮痂病的病原菌可在土壤或马铃薯块茎上越冬成为次年的初侵染源，该致病菌在土壤中一旦定植就很难根除。如何防治马铃薯疮痂病长期以来一直是一个棘手的问题，许多防治策略已用于马铃薯疮痂病的防治工作中，但田间效果十分有限。其中，生物防治马铃薯疮痂病取得了较好的效果，但是，可以有效拮抗致病性链霉菌的生防工程菌种类很少，目前报道的仅有芽孢杆菌、假单胞菌菌株，还有少数哈茨木霉菌。因此，进一步开发针对顽固的土传细菌病害进行防治的新的生防菌类型，对解决马铃薯生产的瓶颈问题具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种拮抗马铃薯疮痂病病菌的真菌及其应用，为马铃薯疮痂病的防治提供新的生防菌类型。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种产紫篮状菌(Talaromycespurpureogenus)H39，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2022年03月02日。
本发明还提供一种植物病害防治剂，包括所述的产紫篮状菌H39。
进一步地，所述的植物病害防治剂包括所述的产紫篮状菌H39的发酵液或孢子悬浮液或代谢产物。
进一步地，所述孢子悬浮液的浓度为108cfu/ml。
本发明还提供一种防治植物病害的方法，将所述的产紫篮状菌H39或所述的植物病害防治剂施用给植物以防止植物受到植物病原菌的侵染。
进一步地，所述植物病原菌包括致病性链霉菌。
进一步地，所述植物病害为马铃薯疮痂病。
本发明还提供所述的产紫篮状菌H39或所述的植物病害防治剂在防治致病性链霉菌引起的植物病害中应用。
进一步地，所述致病性链霉菌引起的植物病害包括马铃薯疮痂病。
本发明公开了以下技术效果：
(1)本发明公开的产紫篮状菌是一种分离自土壤的真菌，能够在土壤中良好的定殖，本发明首次发现了该真菌能够拮抗致病性链霉菌的生长和发病，实验证实该菌株可以通过抑制及寄生的方式，抑制致病性链霉菌的正常生长，其菌株、孢子或代谢产物能够抑制马铃薯疮痂病菌的生长和毒素的分泌。
(2)该产紫篮状菌对马铃薯无害，可作为防治马铃薯疮痂病的新的生防菌，在应用中具有安全性，对解决马铃薯生产的瓶颈问题具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为H39 ITS基因***发育树；
图2为H39 BenA基因***发育树；
图3为抑菌实验1接种图示意图；
图4为抑菌实验1中处理组对峙培养6d结果；其中箭头所指为H39菌落；
图5为抑菌实验2中对照组与处理培养6d结果；
图6为产紫篮状菌H39微生物菌剂的抑制发病效果(接种6d)；
图7为产紫篮状菌H39代谢产物的抑制发病效果(接种6d)；
图8为刮取H39-ISP6上的S.scabies菌落接种至薯块上后的效果(接种6d)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1真菌的分离、纯化与鉴定
1、从黑龙江省哈尔滨市道外区马铃薯连作田中均匀取土壤样品，称取10g采集的土壤样品，加入90ml无菌水，室温下150rpm振荡培养30min。之后，吸取上清液采用10倍梯度稀释法进行生防产紫篮状菌的分离，每个选择性培养基(孟加拉红培养基：蛋白胨5g、葡萄糖10g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、琼脂20g、1/3000孟加拉红溶液100mL、蒸馏水1000mL)平板上均匀涂布100μl土壤稀释液。而后，在10-3稀释液平板上挑取单菌落在PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000ml)上进行纯化，用于分类鉴定。根据《真菌鉴定手册》对菌株进行形态学测定。
形态学特征：
H39在PDA培养基上，25℃时菌丝成黄色，且可产生黄色和红色色素。篮状菌的产孢结构为分生孢子梗，产生对称轮生帚状枝，帚状枝排列紧密；梗茎直立、具有横隔，透明状。分生孢子为暗绿色，椭圆形。
2、分子生物学方法鉴定上述分离的菌种
(1)材料与方法
使用TaKaRa公司的Plant DNAKit试剂盒提取所分离的菌种的基因组，方法参照试剂盒说明书。以提取的DNA为模板，利用ITS通用引物(ITS1/ITS4)和基因引物(Bt2a/Bt2b)进行PCR扩增鉴定种类。
其中各条引物序列如下：
ITS1(SEQ ID NO.3)为TCCGTAGGTGAACCTGCGG；
ITS4(SEQ ID NO.4)为TCCTCCGCTTATTGATATGC；
Bt2a(SEQ ID NO.5)为GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC；
Bt2b(SEQ ID NO.6)为ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC。
扩增体系为25μl，其中，含有2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix(TaKaRa)12.5μl、正向引物和反向引物各1μl、DNA模板1μl、双蒸水补充至25μl。
PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸7min，4℃保存。
PCR产物进行测序，并在NCBI网站上进行BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/)比对。
(2)结果与分析
以提取的DNA为模板，利用ITS通用引物进行PCR扩增，测序，获得大小为563bp的片段；而利用β-tubulin(BenA)基因引物的PCR产物测序，获得大小为443bp的片段。二者经过BLAST后，ITS1片段与Talaromycespurpurogenus菌株Q2(KX432212.1)的序列相似度达到100％，BenA基因片段与T.purpurogenus菌株Q2(KY047419.1)的序列相似度达到100％。应用DNAMAN软件与NCBI公布的T.purpurogenus菌株的基因序列，利用最大似然法分别构建***发育树。ITS1***发育树表明，H39与T.purpurogenus的菌株同为一个分支(见图1)。进一步利用BenA基因的***发育树分析发现，H39仍然与T.purpurogenus为同一分支(见图2)。因此，经ITS通用引物和编码蛋白的BenA基因看家基因同时鉴定，结果显示所分离的菌种属于Talaromyces purpurogenus，将其命名为产紫篮状菌H39。
该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2022年03月02日。
上述H39的ITS1基因序列(长563bp，提交至Genbank，登录号为ON005142)(SEQ IDNO.1)
CCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTAACTCCTACCTGATCCGAGGTCAACCTTGTAAAAAGATGTGGTGGTGACCAACCCCCGCAGGTCCTTCCCGAGCGAGTGACAGAGCCCCATACGCTCGAGGACCAGACGGACGTCGCCGCTGCCTTTCGGGCAGGTCCCCAGGGGGACCACACCCAACACACAAGCCGTGCTTGAGGGCAGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACGGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTGACAATTTTCATATCACTCAGACAGCCCATCTTCATCAGGGTTCACAGAGCGCCTCGGCGGGCGCGGGCCCGGGGACGGATGTCCCCCGGCGACCGGGTGGCCCCGGTGGGCCCGCCGAAGCAACAGGTGTTGGAGACAAGGGTGGGAGGTTGGGCCGCGAGGGGCCCTCACTCGGTAATGATCCTTCCGCA。
H39的BenA基因序列(SEQ ID NO.2)
GGTGCTGCTTTCTGGTGAGGAATGACCACGCTTTCAGTCAATTGTCGCGACGACTCGCTGACTATTTTCAGGCAAATCATCTCTGCTGAGCACGGTCTCGATGGATCCGGCGTGTAAGTGTTGATGGGATTCGAAATCCATCTACAATTCGACCGTATCTGATAATCAACAGTTACAATGGCTCCTCCGACCTCCAGTTGGAGCGTATGAACGTTTACTTCAACGAGGTGCGTCGAACAACCAACCAATAGAAACAAAAACAAAAACTCATATCCAATGCTTAACAGGCTTCCGGCAACAAATATGTTCCTCGTGCTGTCCTCGTCGACTTGGAACCCGGCACCATGGATGCCGTCCGCGCTGGTCCCTTTGGTCAGCTCTTCCGTCCCGACAACTTTGTTTTCGGTCAGTCCGGTGCTGGTAACAACTGGGCCAAGGGTCAC。
实施例2产紫篮状菌H39的抑菌效果
1、材料与方法
供试病原细菌：致病性链霉菌S.scabies(菌株编号CGMCC4.1765，购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。
方法：平皿对峙培养法进行产紫篮状菌H39对供试病原细菌抑制作用的鉴定。
利用打孔器分别取产紫篮状菌H39的菌饼(H39于PDA培养基上25℃培养5d后，在菌丝边缘处取菌饼，直径约为6mm)用于对峙培养。
制备致病菌S.scabies菌液：接种环在YME培养基(麦芽浸粉10.0g、酵母提取物4.0g、葡萄糖4.0g、蒸馏水1000ml、琼脂15～18g，液体培养基不加琼脂)上划线，28℃培养7d后，刮取该YME平板上的菌落，置于50mlYME液体培养内，200rpm，28℃振荡培养5d，获得致病菌菌液。
抑菌实验1(对峙培养)：在马铃薯培养基(PDA)平板(直径为90mm)上，1个产紫篮状菌H39与800μl S.scabies菌液对峙接种，H39与菌液前边缘二者之间的距离为20mm(处理组)；以不接种菌饼为阳性对照；以上均在28℃下培养(图3)。重复3次，每次处理组和对照组各接种3个平板。
抑菌实验1中观察H39生长是否可以抑制S.scabies在培养基表面上的扩展，即对病原菌S.scabies生长的拮抗作用。待对峙培养6d后时，测量对照组S.scabies的菌落半径(RC)和处理组S.scabies的菌落半径(RT)，计算抑制率并调查覆盖率级别。抑制率的计算公式为：抑制率(％)＝(RC–RT)/RC×100％。平均抑制率为3次重复实验抑制率的平均数。
抑菌实验2(覆盖培养)：在酵母麦芽精琼脂培养基(YME)平板(直径为60mm)上，800μl S.scabies菌液涂布于YME平板上，待菌液干燥后接种1个产紫篮状菌H39菌饼，即H39菌饼位于S.scabies菌之上(处理组)。以未接种H39菌饼的S.scabies菌为阳性对照，28℃下培养。重复3次，每次处理组和对照组各接种3个平板。
观察H39是否可以覆盖在S.scabies菌株的表面上，以表示H39的寄生能力，其分级标准设为3级：Ⅰ级：菌落与病原菌菌落不接触，菌丝不能覆盖病原菌菌落；Ⅱ级：菌丝覆盖病原菌菌落1/2以下，病原菌菌落健康，颜色无变化；Ⅲ级：菌丝全部覆盖病原菌菌落，并在病原菌菌落上大量产孢，病原菌菌落萎缩，颜色变暗。
2、结果与分析
通过对峙培养6d后，测量和统计对照组与处理组各菌落的直径，计算出产紫篮状菌H39的平均抑菌率(见表1)。
表1产紫篮状菌H39对致病性链霉菌S.scabies对峙培养6天的抑菌率和覆盖率指数
Figure BDA0003636342100000071
表1对峙培养结果表明，产紫篮状菌H39对病原细菌S.scabies的生长具有抑制作用(如图4)；同时产紫篮状菌H39还可以寄生在病原细菌S.scabies的菌落上，覆盖率指数为Ⅲ级，即覆盖率可达100％(如图5)。以上结果表明，通过抑制及寄生的方式，产紫篮状菌H39可以抑制病原细菌S.scabies的正常生长。
实施例3产紫篮状菌H39微生物菌剂抑制病原细菌发病
1、产紫篮状菌H39微生物菌剂的制备
分离纯化后的产紫篮状菌H39接种到PDA培养基平板上，25℃培养7d，使用无菌蒸馏水(含表面活性剂Tween80)冲洗上述培养物表面，制备成孢子悬浮液，调整孢子浓度至108cfu/ml，即得到产紫篮状菌H39微生物菌剂。
2、产紫篮状菌H39微生物菌剂的抑菌效果
2.1材料与方法
用切块器将马铃薯块茎切成10mm×10mm，厚10mm的均匀薯块，去离子水浸泡冲洗掉表面的淀粉，1％NaClO表面灭菌5min，用无菌去离子水冲洗3次。产紫篮状菌H39的孢子悬浮液浸泡薯块30min，取出后在超净工作台晾干。灭菌密封盒内放置无菌滤纸后，将晾干的薯块放置于密封盒中滤纸之上。每个薯块中心滴加10μl的病原细菌S.scabies菌液(浓度为1×107cfu/ml)。以产紫篮状菌孢子悬浮液浸泡的薯块为阴性对照，以无菌去离子水浸泡后滴加病原细菌菌液的薯块为阳性对照，重复3次。将密封盒放置于恒温培养箱中，25℃培养6d。
病级调查方法：通过目测观察病斑面积占表面积的比例，再按照以下标准统计发病：0级：未见明显病斑；1级：病斑面积占表面积的比例≤25％；2级：25％＜病斑面积占表面积的比例≤50％；3级：50％＜病斑面占表面积的比例积≤75％；4级：病斑面积占表面积的比例大于75％。
2.2结果与分析
如图6所示，经过产紫篮状菌H39孢子悬浮液浸泡后的薯块接种疮痂病菌的菌液后，目测发病情况非常轻，介于0级和1级之间；而阳性对照发病已经达到3级。以上活体接种试验的结果表明，产紫篮状菌H39能够抑制疮痂病菌在薯肉中的发病。
同时，经过产紫篮状菌H39孢子悬浮液浸泡后的薯块无异常变化，即产紫篮状菌H39不会引起马铃薯病害。
实施例4产紫篮状菌H39代谢产物抑菌效果
1、产紫篮状菌H39代谢产物的制备
分离纯化后的产紫篮状菌H39接种到PDA培养基平板上，25℃培养6d，菌丝边缘打10个菌饼(直径6mm)接种到1LPDA液体培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000ml)，25℃，150rpm振荡培养5d，使用3层无菌滤纸过滤掉菌丝后获得的溶液在120℃下高温高压灭菌20min，常温冷却后得到产紫篮状菌H39代谢产物溶液。
2、产紫篮状菌H39代谢产物的抑菌效果
2.1材料与方法
利用上述制备的产紫篮状菌H39代谢产物溶液代替蒸馏水配制ISP6(蛋白胨酵母提取物铁琼脂)培养基(1L培养基包括酵母提取物1.0g，含铁蛋白胨8.0g，琼脂粉8g，代谢产物溶液定容至1000mL)平板，平皿大小为60mm。
刮取YME平板上的致病菌菌落置于50mlYME液体培养基内，200rpm，28℃振荡培养5d获得致病菌菌液。取800μl致病菌菌液涂布于上述代谢产物溶液配制的平板上。以蒸馏水配制的ISP6培养基为水对照，重复3次。置于28℃培养6d。
病原细菌S.scabies在ISP6培养基上可产生黑色色素。
2.2结果与分析
如图7所示，水对照组中，疮痂病菌S.scabies产生的黑色素已经导致培养基的颜色变成了黑色且菌落变大，说明水对照组的S.scabies生长正常。利用产紫篮状菌H39代谢产物配制的ISP6培养基上接种疮痂病菌S.scabies的菌液后，未有黑色色素产生，培养基的颜色为透明的黄色，且菌落的大小无明显变化，说明该培养基上的S.scabies未生长；随后，分别刮取该H39-ISP6上的S.scabies菌落和水对照组的S.scabies菌落接种至无菌去离子水浸泡30min的薯块上，结果表明：接种水对照组菌落的薯块出现组织坏死等发病症状，而接种H39-ISP6处理组菌落的薯块未见发病(见图8)。
综上说明，产紫篮状菌H39代谢产物可以抑制疮痂病菌的生长及发病。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 黑龙江省农业科学院经济作物研究所
<120> 一种拮抗马铃薯疮痂病病菌的真菌及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 563
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgcttattg atatgcttaa gttcagcggg taactcctac ctgatccgag gtcaaccttg 60
taaaaagatg tggtggtgac caacccccgc aggtccttcc cgagcgagtg acagagcccc 120
atacgctcga ggaccagacg gacgtcgccg ctgcctttcg ggcaggtccc cagggggacc 180
acacccaaca cacaagccgt gcttgagggc agaaatgacg ctcggacagg catgcccccc 240
ggaatgccag ggggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcacggaa ttctgcaatt 300
cacattactt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc cggaaccaag agatccattg 360
ttgaaagttt tgacaatttt catatcactc agacagccca tcttcatcag ggttcacaga 420
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ggcccgccga agcaacaggt gttggagaca agggtgggag gttgggccgc gaggggccct 540
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<210> 2
<211> 443
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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ttgatgggat tcgaaatcca tctacaattc gaccgtatct gataatcaac agttacaatg 180
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ctggtccctt tggtcagctc ttccgtcccg acaactttgt tttcggtcag tccggtgctg 420
gtaacaactg ggccaagggt cac 443
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
accctcagtg tagtgaccct tggc 24

Claims (9)

1.一种产紫篮状菌(Talaromyces purpureogenus)H39，其已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.40086，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间为2022年03月02日。
2.一种植物病害防治剂，其特征在于，包括权利要求1所述的产紫篮状菌H39。
3.根据权利要求2所述的植物病害防治剂，其特征在于，包括权利要求1所述的产紫篮状菌H39的发酵液或孢子悬浮液或代谢产物。
4.根据权利要求3所述的植物病害防治剂，其特征在于，所述孢子悬浮液的浓度为108cfu/ml。
5.一种防治植物病害的方法，其特征在于，将权利要求1所述的产紫篮状菌H39或权利要求2-3任一项所述的植物病害防治剂施用给植物以防止植物受到植物病原菌的侵染。
6.根据权利要求5所述的防治植物病害的方法，其特征在于，所述植物病原菌包括致病性链霉菌。
7.根据权利要求5所述的防治植物病害的方法，其特征在于，所述植物病害为马铃薯疮痂病。
8.一种权利要求1所述的产紫篮状菌H39或权利要求2-4所述的植物病害防治剂在防治致病性链霉菌引起的植物病害中应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述致病性链霉菌引起的植物病害包括马铃薯疮痂病。
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