CN114891670B - 一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh及其应用 - Google Patents

一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh及其应用，该菌株于2021年12月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：62122。本发明研究表明ZJh菌株对多种不同分化型的植物病原真菌具有广谱抑菌性，抑菌率为64.97～89.5％；同时，ZJh菌株可强烈抑制香蕉枯萎病病原菌，抑制率达92.77％；ZJh菌株能够分泌蛋白酶，葡聚糖酶，对香蕉枯萎病病原菌的孢子萌发的抑制率高于90％，能显著抑制孢子的产生以及菌丝的生长；经过喷施生防菌液ZJh能显著降低病菌对香蕉的危害，为植物病原真菌的防治提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。

Description

一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh及其应用
技术领域
本发明属于微生物防治技术领域。更具体地，涉及一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh及其应用。
背景技术
植物病原真菌引起的土传病害严重影响农产品质量和数量，若防治不当将造成重大经济损失。目前，化学农药仍是作物病害管理的主力军。然而，化学杀菌剂的长期使用会污染环境，引起病原菌耐药，甚至会导致作物根际有益菌群的丢失。而且，病原真菌能以孢子形式在土壤中长期存在，一次喷洒难以彻底清除，而生防菌能在土壤中长期存活，可通过分泌抑菌物质等机制抑制病原菌生长，提高作物抗病能力，是绿色、环保的病害防治方法，能促进农业可持续发展，改善农产品质量。
在目前的防治中，筛选对植物病原真菌有抑制作用或具有防治效果的微生物菌株是目前的研究热点，筛选分离的生防菌能够通过抗生、竞争和诱导作物抗病等多种机制防控病害。生防菌生长过程中分泌产生的次生代谢产物中的拮抗性物质能显著抑制病原菌的生长和代谢过程，也能使细胞发生溶解现象，还可分泌水解酶降解真菌的细胞壁。拮抗物质主要有脂肽类抗生素和聚酮类物质等，如2，4-二乙酰间苯三酚、丰源素、吩嗪羧酸、硝吡咯菌素等。
如现有技术中公开了一种拮抗枯萎病的芽孢杆菌及其应用，该菌株是专门用于防治枯萎病的，其抑菌率不高；现有的一些微生物菌株也只是对一两种植物病原真菌具有很好的防治效果，但是土壤中侵染植物的病害菌多种多样，特别引起作物根腐病的土传病原真菌随着单一种植和化肥农药施入的增加也在不断发生变异，农田土传根腐病难以防治。然而目前关于根腐病具有广谱抑菌活性的菌株研究还较少。香蕉枯萎病主要致病病原菌尖孢镰刀菌在土壤中可以残存30年以上，现如今没有任何的农药可以去把它根除掉，香蕉枯萎病防治困难，并且严重威胁下茬作物产品的产量与质量。作物根腐病潜在致病菌镰刀菌有很多分化型，能够引起不同作物根腐病害，而现有技术中筛选出的微生物菌株也仅对一两种不同分化型镰刀菌具有防治效果，如中国专利公开了一株分泌铁载体的暹罗芽孢杆菌Gxun-36及其应用，该菌株可抑制多种植物病原菌，虽然对尖孢镰刀菌引起的香蕉枯萎病具有一定防治效果，但防效较弱，同时该菌株对香蕉枯萎病病原菌孢子产生、孢子萌发的抑制能力，以及该菌株应用环境尚未明确；由于不同土壤环境具有差异性，因此不同地域筛选的微生物也具有土壤环境限制性，针对不同地区香蕉枯萎病病原菌筛选土著生防菌是全面防控香蕉枯萎病的有效策略。因此，针对能抑制多种作物病原菌的生防菌株筛选对农田作物根腐病害绿色防治具有安全、可持续的作用和意义。
发明内容
本发明为了防控土壤中多种病原真菌镰刀菌引起的作物根腐/枯萎病，特别是防控香蕉枯萎病土传病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型，提供一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh及其应用。
本发明的第一个目的是提供一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌ZJh菌株。
本发明的第二个目的是提供所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株的应用。
本发明的第三个目的是提供一种植物病原真菌抑制剂。
本发明的第四个目的是提供一种抑制植物病原真菌和/或防治植物病害的方法。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZJh菌株，所述菌株于2021年12月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCCNo：62122，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。该菌株分离自广东雷州连作香蕉园香蕉根际土壤，经传统的生物学鉴定、生理生化特征测定、分子生物学鉴定出该菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)-暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。ZJh菌株在LB培养基上的菌落呈圆形或椭圆形，菌落为乳白色，边缘完整，菌落不透明。后期***、波状、湿润的菌落，在37℃下，pH 7.2下生长良好，但在4℃和42℃条件下下未见生长。
本发明研究表明ZJh菌株对多种植物病原真菌具有广谱的抑菌性，ZJh菌株对11种不同分化型的作物根腐病致病镰刀菌均具有显著的抑制效果，通过平板十字交叉法测定ZJh菌株对香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，FOC4)、水稻立枯丝核(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、大豆根腐病尖孢镰孢菌(Fusarium.oxysporum)、大豆根腐病腐皮镰孢(Fusarium.solani)、南瓜尖孢镰孢菌(Fusarium.oxysporum)、菜豆根腐病菌(Rhizoctonia solani)、大豆链格孢(Alternariaalternate)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)、南瓜腐皮镰孢(Fusarium solani)病原菌抑菌率在64.97～92.77％；其中，ZJh菌株可明显抑制香蕉枯萎病菌的生长，抑制效果达92.77％，具有强烈的抑制作用，同时还对多种作物根腐病具有明显的抑菌效果。
ZJh菌株能够分泌蛋白酶，嗜铁素，纤维素和淀粉酶，破坏病原菌菌丝和抑制孢子的生长作用；ZJh菌株的无菌滤液对香蕉枯萎病病原菌尖镰孢的孢子萌发的抑制率高于90％，对香蕉枯萎病病原菌菌丝生长有明显的抑制效果。同时采用喷施ZJh生防菌液能显著降低病原菌对香蕉的危害，提前24h喷施生防菌液处理防治效果更佳。
本发明提供所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株和/或其菌液、发酵液、发酵代谢物在抑制植物病原真菌或制备抑制植物病原真菌制剂中的应用。
优选地，所述植物病原真菌为香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporumf.sp.Cubense，FOC4)、水稻立枯丝核(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)、大豆根腐病尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、大豆根腐病腐皮镰孢(Fusariumsolani)、南瓜尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、菜豆根腐病菌(Rhizoctonia solani)、大豆链格孢(Alternaria alternate)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)和/或南瓜腐皮镰孢(Fusarium solani)中的一种或多种。
本发明研究表明暹罗芽孢杆菌ZJh菌株对上述11种植物病原真菌具有较好的抑制效果，那么本发明的暹罗芽孢杆菌ZJh菌株对由这11种植物病原真菌引起的植物病害也理应具有一定的防治效果。
本发明提供所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株和/或其菌液、发酵液、发酵代谢物在防治由上述植物病原真菌引起的植物病害中的应用。
优选地，所述植物病害为植物枯萎病、根腐病。
更优选地，所述植物病害为香蕉枯萎病、水稻纹枯病、大豆根腐病、大豆枯萎病、南瓜枯萎病、菜豆根腐病、大豆链格孢黑斑病、辣椒根腐病、南瓜镰孢果腐病、水稻茎腐病等。
本发明提供一种植物病原真菌抑制剂，含所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株和/或其菌液、发酵液、发酵代谢物。
本发明提供一种抑制植物病原真菌和/或防治植物病害的方法，采用暹罗芽孢杆菌ZJh菌株对病原或植株进行处理。
优选地，所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株为菌液、发酵液和/或发酵代谢物。
优选地，采用发酵液和/或发酵代谢物处理的时间大于24h。
优选地，所述发酵液和/或发酵代谢物的配制方法为：将ZJh菌株置于培养基中25～35℃培养，按2～10％的接种量转接新的培养基中，150～200r/min，25～35℃，继续培养2～5d后稀释备用。
优选地，所述发酵液和/或发酵代谢物的浓度为1.0×106～2.0×109cfu/mL。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZJh菌株，该菌株于2021年12月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62122。本发明研究表明ZJh菌株对多种植物病原真菌具有广谱的抑菌性，ZJh菌株能够有效抑制11种不同分化型的病原真菌，抑菌率为64.97～92.77％；其中，ZJh菌株可强烈抑制香蕉枯萎病，抑菌率达92.77％。ZJh菌株能够分泌蛋白酶，葡聚糖酶，破坏病原菌的菌丝和孢子生长作用；对香蕉枯萎病病原菌的孢子萌发的抑制率高于90％，能显著抑制孢子的产生以及菌丝的生长；经过喷施生防菌液ZJh能显著降低病菌对香蕉的危害，为植物病原真菌的防治提供新的微生物菌株和防治方法策略，具有很好的生物防治效果。
附图说明
图1为菌落的形态特征；
图2为ZJh菌株蛋白酶，嗜铁素，纤维素和淀粉酶的鉴定；
图3为***进化树；
图4为香蕉枯萎病JB9和ZJh培养7d后的平板对峙图；
图5为生防菌代谢液对病菌分生孢子萌发的影响；
图6为生防菌代谢液对病菌分生孢子产生的影响；
图7为生防菌代谢液对病菌菌丝生长的影响；
图8为生防菌ZJh抑制香蕉枯萎病病原菌侵染叶片图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例采用的培养基的配制：
PDA培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL、pH7.0-7.2；
NA培养基：牛肉浸膏3.0g、蛋白陈10g、NaCl 15.0g、琼脂17g、蒸馏水1000mL、pH7.0-7.2；
LB液体培养基配方：称取蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g，蒸馏水定容至1000ml，调节pH 7.0-7.2，高压灭菌待用。
实施例1菌株的分离鉴定
本发明采用广东雷州连作根腐香蕉园根际土制备悬浊液，通过LB培养基分离生防细菌，涂布前将土壤菌悬液于80℃加热15min，然后稀释呈10-5、10-6两个梯度，分别吸取100μL涂布于固体LB培养基上，待培养基中有单菌落长出后，分离单菌落。首先根据菌落颜色，大小及形态挑取单菌落于PDA培养基上连续划线纯化5次。再通过平板十字交叉法筛选出对香蕉枯萎病病原菌拮抗效果最好的拮抗菌株命名为ZJh。然后对拮抗菌株进行平板划线、拍照，将菌株转接至LB液体培养基中，摇菌培养至细菌指数生长期时，保存于25％的甘油水溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。
1、传统的生物学鉴定
菌落形态特征如图1所示，从形态学来看，ZJh菌株在LB培养基上的菌落呈圆形或椭圆形，菌落为乳白色，边缘完整，菌落不透明。后期***、波状、湿润的菌落，在37℃下，pH7.2下生长良好，但在4℃和42℃条件下下未见生长。
2、生理生化特征测定
对菌株进行了生理生化特征的鉴定，ZJh菌株为好氧菌；可利用葡萄糖、5％乳糖、果糖、蔗糖、纤维二糖、甘露糖，不可以利用***糖、木糖、甘露糖、肌醇、鼠李糖；不能分解硫氨基酸产生硫化氢；能分解过氧化氢、酪蛋白、淀粉；可以水解明胶；硝酸盐还原试验、V-P试验、柠檬酸盐、M.R.试验均为阳性。
表1 ZJh菌株的生理生化特征
注：“+”阳性，“-”阴性
进行蛋白酶检测：根据Nielsen等人(Nielsen et al，1997)的使用方法。A：称取脱脂奶粉(DSM)6.4g溶于240ml蒸馏水中，放于灭菌器121℃灭菌1min。B：称取琼脂(Agar)6.4g，加水定容至240ml，放于灭菌器121℃灭菌20min，待冷却后备用。将A灭菌后，取出冷却，同时用微波炉融化B，冷却至50～60℃将两者混合倒平板。接种ZJh后放在30℃培养箱培养3d，观察是否出现透明圈，拍照记录。
进行纤维素酶检测：参照Ghose(1987)方法。称取蛋白胨(Peptone)10g、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10g、酵母粉(Yeast Extract)10g、氯化钠(NaCI)5g、琼脂(Agar)18g、磷酸二氢钾(KH2PO4)1g，用水定容至1000ml，调节PH为7.0，放于灭菌器高压灭菌，待冷却后倒平板。将ZJh接种后放于30℃培养箱中培养2d，取出，用事先配好浓度为1mg/ml的刚果红溶液染色，静止1h，将染液倒掉，再倒入1mol/l的NaCI溶液，浸泡静止1h，拍照观察记录有无透明圈。
进行嗜铁素检测：根据Shoda(2000)方法。A：称取60.5mg的CAS溶于50ml去离子水中；B：为10mL的三价铁溶液(配置1mmol/FeCI3·6H2O，溶液中相当于含有10mM盐酸)；将A和B混合，玻璃棒揽拌混匀。然后加入C(称取HDTMA 72.9mg溶于40ml去离子水)，调节PH至中性。放于灭菌器高压蒸气(121℃、20min)灭菌后待冷却至50～60℃加入到900ml的WA培养基中，混匀倒平皿。将ZJh接于平板中心，放于30℃培养箱中培养5d，拍照记录观察有无透明圈。
淀粉酶检测采用淀粉酶鉴定培养基：可溶性淀粉2g、FeSO4·H2O 0.005g、KNO33.1g、NaCl 0.5g、K3PO4·3H2O 0.05g、MgSO4·H2O 0.05g、琼脂2g、蒸馏水100mL。调节PH为7.0，放于灭菌器高压灭菌，待冷却后倒平板。将ZJh接种后放于30℃培养箱中培养2d，取出加入稀碘液覆盖整个培养基平板，15min后观察是否有透明圈出现。
测定结果如图2所示，表明ZJh菌株能够分泌蛋白酶，嗜铁素，纤维素和淀粉酶。
3、分子生物学鉴定
使用天根生物公司的细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)抽提保存的单克隆菌株基因组DNA，并以提取的DNA为模板，16rDNA通用引物27F(5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)为上下游引物扩增细菌的16rDNA，PCR反应体系如表2。
表2细菌16rDNA PCR扩增体系(20μL)
PCR反应程序：94℃预变性5min、94℃变性1min、58℃退火1min、72℃延伸1.5min，共36个循环；72℃延伸10min；4℃保存。序列测定：经PCR扩增、纯化后将扩增产物交由上海生工测序。
4、***发育分析
对测序引物27F及1492R的测序结果进行分析，并用SeqMan(DNAStar)拼接序列，然后将该序列与NCBI中rRNA/ITS数据库进行blast比对。取下载整理的与菌株相近的近缘序列，用ClustalW软件进行多序列比对分析，之后用Mega7.0软件采取邻接法(Neighbor-Joining)构建***进化树，调整bootstrap值并检验进化树的可靠性。结果如图3所示，菌株与Bacillus siamensis相似性最高。将其归属于芽孢杆菌属(Bacillus sp.)-暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus sp.)ZJh菌株，所述菌株于2021年12月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，菌种保藏号为GDMCC No：62122，保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2 ZJh菌株的广谱抑菌作用
本实施例采用的香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，FOC4)JB9菌株、水稻立枯丝核(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、大豆根腐病尖孢镰孢菌(Fusarium.oxysporum)、大豆根腐病腐皮镰孢(Fusarium.solani)、南瓜尖孢镰孢菌(Fusarium.oxysporum)、菜豆根腐病菌(Rhizoctonia solani)、大豆链格孢(Alternaria alternate)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、南瓜腐皮镰孢(Fusarium solani)由岭南师范学院地理科学学院热带作物绿色防治课题组和东北农业大学农学院植物保护专业提供。
分别将上述病原菌和实施例1中分离得到的ZJh菌株，采用十字交叉培养法，用抑菌钩挑取少量ZJh于NA平板上活化，28℃恒温培养48h，然后将ZJh对角线接种在距离PDA平板中央位置3cm处。将经过扩繁的大豆根腐尖镰孢菌用打孔器打取直径为0.7cm的菌碟后接种在上述PDA平板的中央，用封口膜密封培养，每个细菌菌株3个平板，最后于26℃恒温培养6d。用Image J软件计算病原菌菌丝生长面积(cm2)，设置A，B，C三个重复。
ZJh菌株对多种不同分化型的病原真菌抑菌谱的测定结果如下表3所示，ZJh对大豆疫霉菌、大豆根腐病原菌尖孢镰刀菌具有显著的抑制效果，抑菌率达89％和82％左右；还能有效抑制大豆根腐病腐皮镰孢、木贼镰孢、禾谷镰孢菌、大豆链格孢、南瓜腐皮镰孢、南瓜尖孢镰孢菌、水稻立枯丝核、菜豆根腐病菌等不同分化型的病原菌，其抑菌率均达64％以上。
表3生防菌ZJh对10种病原真菌抑菌谱的测定
ZJh菌株对香蕉枯萎病JB9的抑制结果如图4所示，结果表明ZJh菌株可明显抑制香蕉枯萎病菌的生长，ZJh菌株对香蕉枯萎病JB9的拮抗作用如表4所示，JB9在培养皿中培养7d的菌落面积228.34～230.56cm2，ZJh平板对峙实验JB9在培养皿中培养7d后的直径为166.67～180.65cm2，其抑菌率为92.08～92.77％，表明ZJh对香蕉枯萎病病原菌具有强烈的抑制作用。
表4 ZJh菌株对香蕉枯萎病JB9的拮抗作用
实施例3生防菌代谢液对病菌分生孢子萌发的影响
1、对病菌分生孢子萌发的影响：
供试菌采用生防菌ZJh菌株、香蕉枯萎病病原菌JB9菌株。将生防菌ZJh在定量200mL LB液体培养基中(装液量200mL/500mL锥形瓶)置于28℃、170r/min的摇床培养5-7d，后将其菌液用细菌滤器过滤得到无菌滤液。将病原菌JB9菌株在PDA培养基进行产孢培养，培养第5天，刮掉菌丝，以5ml无菌水洗脱孢子获得孢子悬液。
利用24孔细胞培养板分别按3％、5％、10％的浓度的生防菌无菌滤液加入病菌孢子悬液中最终体积为2mL，加入未接种生防菌的无菌培养液为空白对照，调查生防菌ZJh无菌滤液对病原菌孢子萌发的影响。
结果如图5可知，在5％和10％浓度的生防菌无菌滤液对孢子萌发的抑制率在80％到100％之间，效果显著由于3％浓度的生防菌培养液。在10％浓度的ZJh无菌滤液在8h、36h对孢子萌发的抑制率最好，高达100％。浓度5％的ZJh无菌滤液对孢子萌发的抑制率都在90％到100％之间。而低浓度3％的ZJh无菌滤液对孢子萌发的抑制率均在30％以下。
2、对病菌分生孢子产生的影响：
将在PDA培养基上扩繁5d的香蕉枯萎病病原菌JB9菌株打成7mm菌蝶后转移至PDA培养基上培养至直径4cm后，割掉没有长菌的培养基，将按3％、5％、10％的浓度生防菌无菌溶液15ml加至培养皿中，刮掉菌丝，放置20min，掉倒溶液，放置到放入恒温箱中26℃培养48h后用血球计数板测量孢子悬浮液的浓度，对照加无菌水。
结果如图6可知，在10％浓度的ZJh无菌滤液对孢子产生的影响最大，明显高于0％、3％和5％。48h后加入10％浓度ZJh无菌滤液的孢子悬浮液浓度为2.23×104孢子/mL，没有加入ZJh无菌滤液的孢子悬浮液浓度为2.3×105孢子/mL，其抑制效果较好。
3、对病菌菌丝生长的影响：
将3％、5％和10％的ZJh无菌滤液加入定量的50ml培养基中混匀倒板，将经过扩繁的供试的香蕉枯萎病病原菌JB9菌株的尖镰孢菌碟(d＝0.7cm)接种于PDA平板的中心，每个浓度3个平板，于26℃培养96h后量取植物病原菌菌丝生长面积，对照加无菌水。
结果如图7可知，ZJh无菌滤液对尖镰孢菌丝生长有明显的抑制效果。5％浓度的ZJh无菌滤液对菌丝生长的抑制效果最好，第5天对尖镰孢菌丝生长的抑制率在53％。其次为10％浓度的ZJh无菌滤液，对菌丝生长的抑制率42％。3％浓度的ZJh无菌滤液对尖镰孢菌丝生长的抑制率较差，均在20％以下。结果表明随着ZJh无菌滤液浓度的增加，对菌丝生长的抑制率呈先增加后降低的趋势。
实施例4生防菌ZJh抑制香蕉枯萎病病原菌侵染叶片
选取长势均一的香蕉7叶龄幼苗，分成3组，分别采用生防菌ZJh菌株、香蕉枯萎病病原菌JB9菌株、生防菌ZJh和香蕉枯萎病病原菌JB9菌株对香蕉幼叶进行喷施处理24h，记为JB9，ZJh，ZJh+JB9，ZJh(24h)+JB9四组，每组3个重复。其中，ZJh(24h)+JB9组为喷施枯萎病病菌悬浮液前24h喷施生防菌液，ZJh+JB9组为喷施生防菌液后同时喷施病菌悬浮液。生防菌液和病菌悬浮液制备方法同实施例3，生防菌液为5mL/处理，病菌悬浮液2mL/处理。黑暗培养24h，保温保湿培养5d后观察病情。
结果如图8所示，结果表明喷施生防菌液能显著降低病菌对香蕉的危害，其中提前24h喷施生防菌液防治效果最好。
实施例5生防菌ZJh对香蕉枯萎病的防治
本实施例采用香蕉品种为湛江的巴西蕉。供试生防菌株采用上述实施例1中分离得到的ZJh菌株，病原菌采用本实验室分离并保存的香蕉枯萎病病原菌JB9菌株。将JB9菌株置于PDA固体培养基上进行培养，刮取PDA固体培养基上培养的病原菌菌丝至PDB液体培养基中，于28℃下200r/min培养5d，用2层纱布过滤去除菌丝，用血球计数板调节孢子浓度至1×106CFU/mL，置于4℃下储存待用。
将ZJh单菌落挑到LB液体培养基中35℃过夜培养作为种子液，按2％的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中，200r/min下35℃培养2d，稀释至OD600＝1.0，用血球计数板调节菌悬液浓度为1.0×108CFU/mL。
供试药剂：采用35％多克福拌种，125g药剂/10kg种子。
土壤处理：试验用土壤和蛭石经121℃高压灭40min，备用。
香蕉枯萎病按陈宇丰(2015)的分级标准确定：0级，无病叶，健株；1级，有25％的黄化病叶；3级，有25％～50％的黄化病叶；5级，有50％～90％黄化的病叶；7级，叶片全部黄化，植株死亡。
香蕉病情指数及防病效果计算：病情指数＝(各级病株数×该病级数)/(调查总株数×最高病级数)×100；防病效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％。
实验设定四个处理：
1.空白处理，抖掉幼苗根部土和麦麸后，用蒸馏水浸泡幼苗30min，栽入内径17cm，底径13.7cm，高18.8cm的花盆内浇灌200mL清水；
2.对照组处理，抖掉幼苗根部土和麦麸后将其用浓度为1×106cuf/mL的JB9孢子悬浮液浸泡30min，移栽入花盆内，并浇灌100mL 1×106cuf/mL的JB9孢子悬浮液，100mL清水；
3.实验组处理，抖掉幼苗根部土和麦麸后将其用1×108cuf/mL的ZJh菌悬液浸泡30min，移栽入已提前两天浇灌过100mL 1×108cuf/mLZJh菌悬液的花盆内，再浇灌100mL 1×106cuf/mL的JB9菌株的病原菌孢子悬浮液；
4.药剂处理组，抖掉幼苗根部土和麦麸后将其用，用蒸馏水浸泡30min，移栽入已提前两天浇灌过35％多克福的花盆内，再浇灌100mL 1×106cuf/mL的JB9孢子悬浮液。每处理10盆，设置三次重复。重复两次实验，验证ZJh菌株防治枯萎病的稳定性。
实验结果如下表5所示，对照组香蕉枯萎病病情指数为60.95～65.71，35％多克福处理组香蕉病情指数为15.24～17.14，菌株ZJh处理组香蕉病情指数为14.26～16.09，防治效果为75.5～76％，表明生防菌ZJh在田间实际防治中对香蕉枯萎病的防治与室内抑菌效果具有一致性。
表5生防菌ZJh对香蕉枯萎病的防治试验结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一株具有广谱抑菌性的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)ZJh菌株，其特征在于，该菌株于2021年12月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：62122。
2.权利要求1所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株和/或其菌液在抑制植物病原真菌或制备抑制植物病原真菌制剂中的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，FOC4)、水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、大豆根腐病尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、大豆根腐病腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、南瓜尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、菜豆根腐病菌Rhizoctonia solani、大豆链格孢菌(Alternaria alternate)、木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)和/或南瓜腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)中的一种或多种。
3.权利要求1所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株和/或其菌液在防治由植物病原真菌引起的植物病害中的应用，其特征在于，所述植物病原真菌为香蕉枯萎病病原菌(Fusariumoxysporum f.sp.Cubense，FOC4)、水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、大豆根腐病尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、大豆根腐病腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、南瓜尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、菜豆根腐病菌Rhizoctonia solani、大豆链格孢菌(Alternaria alternate)、木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)和/或南瓜腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)中的一种或多种。
4.一种植物病原真菌抑制剂，其特征在于，含权利要求1所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株和/或其菌液；所述植物病原真菌为香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，FOC4)、水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、大豆根腐病尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、大豆根腐病腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、南瓜尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、菜豆根腐病菌Rhizoctonia solani、大豆链格孢菌(Alternaria alternate)、木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)和/或南瓜腐皮镰孢菌(Fusarium solani)中的一种或多种。
5.一种抑制植物病原真菌和/或防治植物病害的方法，其特征在于，采用权利要求1所述暹罗芽孢杆菌ZJh菌株对病原或植株进行处理；所述植物病原真菌为香蕉枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense，FOC4)、水稻立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)、大豆根腐病尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、大豆根腐病腐皮镰孢菌(Fusarium solani)、南瓜尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)、菜豆根腐病菌Rhizoctonia solani、大豆链格孢菌(Alternaria alternate)、木贼镰孢菌(Fusariumequiseti)、禾谷镰孢菌(Fusarium graminearum)和/或南瓜腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)中的一种或多种。
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