CN110484478B

CN110484478B - 一种枯草芽孢杆菌jz2-1-12及其应用

Info

Publication number: CN110484478B
Application number: CN201910936675.XA
Authority: CN
Inventors: 沈硕; 李玮; 王舰
Original assignee: Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Current assignee: Qinghai Academy of Agricultural and Forestry Sciences
Priority date: 2019-09-29
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2021-04-09
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN110484478A

Abstract

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌JZ2‑1‑12及其应用，所述的枯草芽孢杆菌JZ2‑1‑12已于2019年6月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60696。该菌株分离于青稞白酒糟醅，其发酵产物经试验证明有高效抑制马铃薯干腐病病原菌和马铃薯Y病毒，具有作为生防菌制剂进行马铃薯干腐病和马铃薯Y病毒病防治的潜力和应用前景。

Description

一种枯草芽孢杆菌JZ2-1-12及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌JZ2-1-12及其应用。

背景技术

马铃薯干腐病是由茄病镰孢侵染块茎造成的病害，其病原种类有9个种和变种。受侵害的块茎在温度较低湿度较高的环境下痊愈的速度很慢并且病害部位会进一步扩大。另外，马铃薯在收获期间抗病性虽大，但若伤口多就易受到病害的侵染。马铃薯干腐病在我国各地产区十分常见，干腐病的发生严重降低了我国马铃薯的产量。通常情况下，在马铃薯窖藏期间由干腐病造成的马铃薯产量损失为6～25％，严重时高达60％。由此可见，马铃薯干腐病的防治，尤其是生物防治具有重要的意义。一般而言，生物制剂易受外界坏境因素(如温度、土壤酸碱度、紫外强度)的影响使其在实际应用中有效成分利用率降低。因此，生防制剂稳定性是否良好将直接影响生物制剂推广和开发。

马铃薯Y病毒(Potato Virus Y，PVY)既可以通过40多种蚜虫介体进行非持久性传播，也可以通过寄主无性繁殖及机械摩擦进行传播。在世界各地均有广泛分布，可对茄科、藜科、豆科和葫芦科等多种作物进行侵染。其中，在马铃薯(Solanum tuberosum)田间生产中，植株感染PVY后一般会减产50％左右，但当其与马铃薯X病毒(Potato virusX,PVX)或马铃薯A病毒(Potato virusA,PVA)等其它马铃薯病毒复合侵染时，可使马铃薯产生更为严重的病害症状，有时甚至减产高达80％。此外，对烟草(Nicotiana spp.)、番茄(Solanumlycopersicum)和辣椒(Capsicum spp.)等寄主的经济损失也较大。

近年来，从青稞白酒糟醅中分离到的多株活性菌为芽孢杆菌属，并具有较高的抑草、抑菌及抗病毒活性，且具有作为生防菌剂及微生物源生防制剂开发的潜力。目前有关生防细菌抑制植物病原菌的报道越来越多，但有关生防细菌抑制马铃薯干腐病病原菌及马铃薯Y病毒活性方面的报道很少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菌株JZ2-1-12，该菌株对马铃薯干腐病病原菌具有较高抑制活性，为抑制马铃薯干腐病病原菌活性物质的分离纯化和结构鉴定奠定基础，从而为微生物来源的马铃薯干腐病生防制剂的开发提供新的理论依据和技术支持。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明从青稞白酒糟醅分离得到菌株JZ2-1-12，提取所述的菌株JZ2-1-12的16SrDNA，扩增16S rDNA片段，测得的16S序列如SEQ ID NO.1所示。将所测得的16S序列在美国国立生物信息中心(NCBI)数据库进行比对，JZ2-1-12与已知菌株Bacillus subtilissubsp.subtilis(ABQL01000001)聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.93％，从而确定了JZ2-1-12在分类上属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

基于以上特征，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)JZ2-1-12，该菌株已进行保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：中国广州市先烈中路一百号省微生物所实验楼五楼，保藏日期：2019年6月17日，保藏编号为GDMCC No:60696。

本发明提供了所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12在防治马铃薯干腐病中的应用。

优选的，所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12的发酵产物在防治马铃薯干腐病中的应用也在本发明的保护范围之内。

在本发明的另一方面，提供了所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12在制备防治马铃薯干腐病生物制剂中的应用。

优选的，所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12的发酵产物在制备防治马铃薯干腐病生物制剂中的应用也在本发明的保护范围之内。

在本发明的另一方面，提供了所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12在防治马铃薯Y病毒引起的病害中的应用。

优选的，所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12的发酵产物在防治马铃薯Y病毒引起的病害中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种枯草芽孢杆菌JZ2-1-12，该菌株从青稞白酒糟醅中分离获得，对马铃薯干腐病病原菌具有抑制活性，此外，菌株JZ2-1-12发酵液提取物具有很好的热稳定性和酸碱稳定性，作为生物农药开发时可以适应不同酸碱度环境。经试验证明，菌株JZ2-1-12发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌具有较强的抑制活性，具有作为生防菌制剂进行马铃薯干腐病防治的潜力和应用前景。

附图说明

图1是菌株JZ2-1-12的培养性状及革兰氏染色特征；A.在牛肉膏蛋白胨培养基上的形态特征；B.光学显微镜下的革兰氏染色结果(400×)；

图2是菌株JZ2-1-12基于16S r DNA序列的***发育树；

图3是菌株JZ2-1-12发酵液提取物处理下的马铃薯干腐病病原菌菌丝形态；A.正常马铃薯干腐病病原菌；B.正丁醇提取物处理下马铃薯干腐病病原菌；C.乙酸乙酯提取物处理下马铃薯干腐病病原菌；D.乙酸乙酯提取物处理下马铃薯干腐病病原菌；

图4是温度对菌株JZ2-1-12发酵液提取物抑菌活性的影响；

图5是pH值对菌株JZ2-1-12发酵液提取物抑菌活性的影响；

图6是紫外照射对菌株JZ2-1-12发酵液提取物抑菌活性的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1菌株JZ2-1-12的分离

酒糟样品采集自青海互助青稞酒厂酒窖。取酒糟样品5g，置于100ml无菌水中，常温200r/min充分振荡30min，得到酒糟样品原液。吸取1mL样品原液加入到9mL无菌水中，配置成10^-1的溶液。依次类推逐级稀释为10^-2、10^-3。取0.2mL溶液涂布于牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.2)平板上。将培养皿平板放置于28℃培养箱中培养一定时间并观察。待培养基平板上有菌落出现时，挑取少量菌丝或孢子，接种于新的培养基平板上，直到培养基平板上有单一菌落出现时，将菌株保存于试管中的培养基斜面上，并用液体石蜡封存，放置于4℃冰箱保存备用。

实施例2菌株JZ2-1-12的鉴定

1)菌株JZ2-1-12的形态学鉴定

取经活化的菌株JZ2-1-12，观察菌株生长的菌落形态特征(包括形状、大小、光泽、***形状、透明度、边缘等)及菌体形态特征(包括革兰氏染色、芽孢形态及运动性)。

如图1所示，菌株JZ2-1-12经革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌，细胞呈直杆状，以周生鞭毛运动。菌落边缘整齐，呈乳白色，不透明，扁平，表面褶皱。

2)菌株JZ2-1-12的生理生化鉴定

参考《伯杰氏细菌鉴定手册》(第九版)第十四章生化特征测定的相关内容，对菌株JZ2-1-12进行柠檬酸盐利用试验、接触酶、葡萄糖氧化发酵、糖、醇类发酵、甲基红(M.R)、V-P测定、O-硝基苯-β-D吡喃半乳糖苷酶(ONPG)测定、硝酸盐还原、明胶液化以及石蕊牛奶试验。

由表1可知，菌株JZ2-1-12可使明胶液化，可利用柠檬酸盐，蔗糖及甘露醇。石蕊牛奶试验呈凝固状态。有或无氧分子参与均能分解葡萄糖。其中接触酶试验、硝酸盐还原、V-P试验均呈阳性。甲基红和ONPG试验均呈阴性。

表1菌株JZ2-1-12生理生化鉴定结果

3)菌株JZ2-1-12的分子生物学鉴定

采用上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式细菌DNA提取试剂盒的程序提取菌株DNA。

PCR扩增体系：10×PCR Buffer 2.5μL，dNTP(10mmol·L^-1)2μL，引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3')各1μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH₂O补足至25μL。

PCR反应条件为：94℃5min；94℃10s，54℃30s，72℃80s，35个循环；72℃10min。

待反应结束，取5μL PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送至上海生物工程股份有限公司进行测序，序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果提交至网站http://www.ezbio cloud.net进行16S rDNA序列比对，确定菌株的分类地位。通过MEGA 7.0软件进行菌株序列分析及***进化树的构建。

将菌株JZ2-1-12(MN083310)测序得到的16S rDNA序列(1379bp)提交至https://www.ezbiocloud.net网站，与数据库中已知的16S rDNA序列进行比对，下载与菌株JZ2-1-12的16S rDNA序列同源性大于95％的菌株序列，通过MEGA 7.0软件构建***发育树(图2)。菌株保藏号：GDMCC No:60696，于2019年6月17日保藏至广东省微生物菌种保藏中心。由图2可知，菌株JZ2-1-12与已知菌株Bacillus subtilis subsp.subtilis(ABQL01000001)聚类于同一分支，亲缘关系最近，相似度高达99.93％。结合菌株JZ2-1-12的形态学、生理生化特征及分子生物学鉴定结果，最终确定菌株JZ2-1-12为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例2菌株JZ2-1-12发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性

将培养好的菌株JZ2-1-12接种于装瓶量为400mL的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放置于恒温摇瓶柜中33℃，180r/min振荡培养5d，收获发酵液。发酵液经布氏漏斗减压过滤去除菌体，即获得去菌体发酵液。

取500mL去菌体发酵液置于3000mL的分液漏斗中，依次用等体积乙酸乙酯和正丁醇与其充分接触混匀，分别萃取3次，静置待发酵物底层少量水和有机相分层，收集并合并有机相。萃取获得的有机相经旋转蒸发仪减压浓缩分别得到乙酸乙酯和正丁醇提取物浸膏。将提取物溶于二甲基亚砜(v/v≤2％)并用无菌水将其分别配制成浓度为6.25、12.50、25.00、50.00和100.00mg/mL的溶液，提取物溶液经0.22μm微孔滤膜抽滤三次，以无菌水与二甲基亚砜(v/v≤2％)混合液作为空白对照，每个处理重复三次。采用牛津杯法测定发酵液提取液的抑菌活性，每个牛津杯中注入200μL经抽滤的提取物溶液。

计算公式如下：

由表2可知，当乙酸乙酯提取物溶液的浓度为12.50mg/mL时对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性最高，抑制率达到75.00％；当正丁醇提取物溶液的浓度为50.00mg/mL时对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性最高，抑菌率为66.13％。经毒力回归方程可得：乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性的EC₅₀分别为0.19和12.96mg/mL。

表2菌株发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性

实施例3发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌菌丝的致畸作用分别挑取实施例2中邻近抑菌带边缘及正常状态下的马铃薯干腐病病原菌菌丝制成玻片标本，每个处理重复三次，在光学显微镜下分别观察处理组及对照组的菌丝形态。

如图3所示，两种发酵液提取物均对马铃薯干腐病病原菌菌丝具有强烈的致畸作用。正常状态的马铃薯干腐病病原菌菌丝粗细均一、表面光滑、饱满并且向四周延伸生长正常。邻近正丁醇提取物处理的抑菌带边缘的菌丝出现盘曲折叠的情况，同时出现菌丝分叉、断裂及粗细不均的现象。邻近乙酸乙酯提取物处理的抑菌带边缘的菌丝末端膨大，同时也出现了不同程度的缠绕、扭曲、畸形和断裂的现象。

实施例4发酵液提取物对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的影响用直径为6mm的打孔器打取马铃薯干腐病病原菌菌饼，将其接种于PDA液体培养基中，置于28℃，180r/min的摇瓶柜中培养3d，用4层纱布进行过滤并于12000r/min离心15min，取上清液，用无菌水将其配制为1×10⁶CFU/mL的孢子悬浮液备用。

采用凹玻片培养法，将菌株JZ2-1-12发酵液的乙酸乙酯及正丁醇提取物分别配制成浓度为6.25，12.50，25.00，50.00和100.00mg/mL的溶液，吸取30μL马铃薯干腐病病原菌孢子悬浮液于凹玻片的凹槽中，再分别吸取30μL不同浓度的提取物溶液于凹槽中并混匀，以无菌水作为对照。盖上盖玻片将其置于培养皿中，放置于28℃培养箱中培养，当对照的孢子萌发数(芽管的长度超过孢子直径的一半)达到70-80％时，用血球计数板在显微镜下观察计数。每个处理重复三次，取其平均值。孢子萌发抑制率按照以下公式计算：

如表3所示，发酵液提取物能有效地抑制马铃薯干腐病病原菌孢子的萌发。当乙酸乙酯提取物溶液浓度为12.50mg/mL时，孢子数最少仅有7950个左右，对病原菌孢子的萌发抑制率达到69.64％；当正丁醇提取物溶液浓度为50.00mg/mL时，对病原菌孢子的萌发抑制率为68.99％；经毒力回归方程可得：乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的EC₅₀分别为0.93和9.36mg/mL。

表3菌株发酵液提取物溶液对马铃薯干腐病病原菌孢子萌发的影响

实施例5不同条件对菌株JZ2-1-12发酵液提取物抑菌活性的影响

1)热稳定性

将浓度为12.50mg/mL的乙酸乙酯提取物溶液和浓度为50.00mg/mL的正丁醇提取物溶液分别进行40、60、80、100℃水浴处理及121℃高压蒸汽灭菌处理60min，待其冷却后，用0.22μm无菌滤膜抽滤，以抽滤后未进行加热处理的溶液作为对照，检测其对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性。

由图4可知，温度在80℃以下时，乙酸乙酯及正丁醇发酵液提取物溶液的抑菌活性均达到50.00％以上；当温度升至100℃，乙酸乙酯提取物抑菌活性与对照相比下降14.99％，正丁醇提取物与对照相比仅下降13.75％；当温度达到121℃，提取物的抑菌活性仍保持在45.00％以上。这说明菌株JZ2-1-12发酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物在高温下仍具有较高的抑菌活性，热稳定性较好。

2)酸碱稳定性

将浓度为12.50mg/mL的乙酸乙酯提取物溶液和浓度为50.00mg/mL的正丁醇提取物溶液分别用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠将pH值调节为5、6、7、8、9，静置24h后，溶液经0.22μm的微孔滤膜抽滤，以未调节pH值的溶液作为对照，检测其对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性。

由图5可知，在pH＝6时，乙酸乙酯及正丁醇发酵液提取物溶液的抑菌活性均达到最高，分别为73.75％、67.50％。随着pH值的增大，提取物溶液的抑菌活性虽呈小幅度下降，但仍保持在50.00％以上。这说明菌株JZ2-1-12发酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物的抑菌活性受pH的影响较小，其具有良好的酸碱稳定性。

3)紫外稳定性

将浓度为12.50mg/mL的乙酸乙酯提取物溶液和浓度为50.00mg/mL的正丁醇提取物溶液置于254nm的紫外灯下20cm处分别照射1、3、5、7、9h后，经0.22μm的微孔滤膜抽滤，以未经紫外照射处理的提取物溶液作为对照，检测其对马铃薯干腐病病原菌的抑制活性。

由图6可知，将菌株JZ2-1-12发酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液分别置于254nm的紫外下20cm处照射1、3、5、7、9h后，抑菌活性降幅虽达到10.00％左右，但其抑菌活性仍保持在55.00％以上。发酵液乙酸乙酯提取物的抑菌活性总体高于正丁醇提取物。这就说明菌株JZ2-1-12发酵液乙酸乙酯及正丁醇提取物溶液的抑菌活性成分在紫外照射下具有较好的稳定性。

实施例6菌株JZ2-1-12发酵液提取物抑菌抑制PVY活性的影响

将三生烟于日光温室中进行苗盆种植，待植株4-5片叶完全扩展时，按照钝化模式，将菌株发酵液乙酸乙酯和正丁醇提取物分别与等体积PVY病毒液混合30min作为处理，以磷酸缓冲液等体积混合PVY病毒液为阳性对照，以只接种磷酸缓冲液作为空白对照，以8％宁南霉素水剂等体积混合PVY病毒液作为阴性对照，用传统的摩擦接种法接种三生烟，实验重复3次。接种7d后采取植株顶部叶片，采用Real-time PCR法进行活性菌筛选。

根据Real Time qPCR原始检测结果，按照2^-△△ct相对定量计算公式：

F＝2^{-{[待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值]-[对照组目的基因平均CT值-对照组管家基因平均CT值]}}，计算出各处理中目的基因PVY的表达量。

菌株对PVY抑制率＝(对照中PVY的表达量-处理中PVY的表达量)/对照中PVY的表达量×100％。

由表4可以看出，菌株JZ2-1-12发酵液的正丁醇提取物在50mg/mL和100mg/mL浓度下对PVY具有较高的抑制活性，抑制率分别为80.96％和87.03％。而菌株JZ2-1-12发酵液的乙酸乙酯提取物在100mg/mL浓度下对PVY具有较高的抑制活性，抑制率为83.03％。综上所述，正丁醇提取物对PVY的抑制活性更高。

表4菌株JZ2-1-12发酵液提取物抑制PVY的活性

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 青海省农林科学院

<120> 一种枯草芽孢杆菌JZ2-1-12及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1397

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta 60

acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga tggttgtttg 120

aaccgcatgg ttcaaacata aaaggtggct tcggctacca cttacagatg gacccgcggc 180

gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga 240

gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtag 300

ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt 360

tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag aacaagtacc gttcgaatag ggcggtacct 420

tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 480

ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc 540

tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc 600

agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac 660

cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc 720

gaacaggatt agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg 780

gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg 840

caagactgaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 900

attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ctctgacaat cctagagata 960

ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1020

gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttga tcttagttgc cagcattcag 1080

ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat 1140

catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc 1200

gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa 1260

ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1320

ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg 1380

tgaggtaacc tttagga 1397

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌JZ2-1-12，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12已于2019年6月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60696。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12在防治马铃薯Y病毒引起的病害中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌JZ2-1-12的发酵产物用于防治马铃薯Y病毒引起的病害。