CN115015418A - 一种矮地茶汤剂质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种矮地茶汤剂质量检测方法，包括通过对矮地茶汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及岩白菜素含量测定，将矮地茶汤剂含量限定为每1g含岩白菜素为32.0‑66.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及岩白菜素含量测定均采用液相色谱法测定。本发明的矮地茶汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定矮地茶汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立矮地茶汤剂可行的质量标准，实现矮地茶标准汤剂质量的有效控制。

Description

一种矮地茶汤剂质量检测方法
技术领域
本发明涉及中药材质量控制技术领域，具体涉及一种矮地茶汤剂质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。矮地茶为紫金牛科植物紫金牛的全株，夏、秋季茎、叶茂盛时采挖，除去泥沙，干燥，功能主治为化痰止咳，利湿，活血。用于咳嗽、痰中带血、慢性支气管炎、湿热黄疸、跌扑损伤。目前，关于矮地茶饮片汤剂还未形成一个***的质量检测方法，仅采用现有的检测手段来检测矮地茶汤剂是不够全面的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的矮地茶汤剂质量检测方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的就是要解决现有技术的不足，提供一种矮地茶汤剂质量检测方法，以更好的控制矮地茶汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种矮地茶汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，
通过对矮地茶汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及岩白菜素含量测定，将矮地茶汤剂含量标准限定为每1g含岩白菜素为32.0-66.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及岩白菜素含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以矮地茶对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以岩白菜素对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以矮地茶汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
Figure BDA0003674291780000011
Figure BDA0003674291780000021
流速：1.2mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：250nm。
在其中一实施例中，所述煎煮法包括：取矮地茶饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，浓缩干燥，制得矮地茶汤剂干膏粉。
在其中一实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取矮地茶汤剂样品0.1g，加甲醇20mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制得供试品溶液a；
(2)制备对照药材溶液a：取矮地茶对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制得对照药材溶液a；
(3)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a各2uL；展开剂：体积比为5：4：2的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇溶液；显色剂：临用前新配的体积比为1:1的1％三氯化铁-1％铁***混合溶液，日光下检视。
在其中一实施例中，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取矮地茶对照药材1.0g，加入25％甲醇25mL，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取岩白菜素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为200ug/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取矮地茶汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的25％甲醇25mL，密塞，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液b。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定岩白菜素含量包括：进行液相色谱仪分析，以岩白菜素对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以矮地茶汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行洗脱；流速：1.2mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：275nm。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定岩白菜素含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取岩白菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含岩白菜素的浓度为200ug/ml的溶液，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取矮地茶汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)通过对矮地茶汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及岩白菜素含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定矮地茶汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立矮地茶汤剂可行的质量标准，实现矮地茶标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。
(2)矮地茶饮片煎煮制得矮地茶饮片汤剂，拟定矮地茶标准汤剂的岩白菜素含量范围为：32.0～66.0mg/g；岩白菜素平均转移率为56.32％，拟定矮地茶标准汤剂的岩白菜素含量转移率范围为：35.3～77.4％，结果表明，本发明多个批次汤剂中岩白菜素含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为矮地茶配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1(a)和1(b)为本发明一实施例中矮地茶饮片27批次标准汤剂薄层图谱；其中，1组图谱为阴性对照样品薄层图谱，2组、17组为矮地茶对照药材溶液薄层图谱，3～16、18～30组为矮地茶饮片27批次标准汤剂薄层图谱。
图2为矮地茶饮片标准汤剂照薄层色谱法的检测波长考察中不同检测波长对比图；其中，S1的检测波长为270nm，S2的检测波长为230nm，S3的检测波长为250nm。
图3为矮地茶饮片标准汤剂照薄层色谱法的柱温考察中不同柱温对比图；其中，S1的柱温为30℃，S2的柱温为25℃，S3的柱温为20℃。
图4为矮地茶饮片标准汤剂照薄层色谱法的流速考察中不同流速对比图；其中，S1的流速为0.8mL/min，S2的流速为1.0mL/min，S3的流速为1.2mL/min。
图5为矮地茶饮片标准汤剂照薄层色谱法的流动相考察中不同流动相对比图；其中，S1的流动相为0.1％磷酸，S2的流动相为0.1％乙酸，S3的流动相为0.1％甲酸。
图6为矮地茶饮片标准汤剂照薄层色谱法的洗脱梯度考察中梯度1、梯度2、梯度3的特征图；其中，S1为梯度1，S2为梯度2，S3为梯度3。
图7为本发明提取方法考察中不同提取方法对比图；其中，S1为回流提取供试品溶液特征图谱；S2为超声提取供试品溶液特征图谱。
图8为本发明提取时间考察中不同提取时间对比图；其中，S1为超声提取20min供试品溶液特征图谱；S2为超声提取30min供试品溶液特征图谱；S3为超声提取40min供试品溶液特征图谱。
图9为本发明提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图；其中，S1为25％乙醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S2为25％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S3为水提取制备的供试品溶液特征图谱。
图10为本发明溶剂用量考察中不同样品量对比图；其中，S1为溶剂用量15ml的供试品溶液特征图谱；S2为溶剂用量25ml的供试品溶液特征图谱；S3为为溶剂用量35ml的供试品溶液特征图谱。
图11为本发明特征图谱特征峰指认中混合对照品溶液特征图谱。
图12为本发明特征图谱特征峰指认中供试品溶液特征图谱。
图13为本发明特征图谱特征峰指认中没食子酸光谱对比图，其中(a)为供试品没食子酸光谱图，(b)为标准品没食子酸光谱图。
图14为本发明特征图谱特征峰指认中岩白菜素光谱对比图，其中(a)为供试品岩白菜素光谱图，(b)为标准品岩白菜素光谱图。
图15为本发明特征图谱特征峰指认中槲皮苷光谱对比图，其中(a)为供试品槲皮苷光谱图，(b)为标准品槲皮苷光谱图。
图16为本发明专属性考察中空白溶剂对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为供试品溶液特征图谱，S3为空白溶剂(25％甲醇)特征图谱。
图17为本发明重复性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S(1)5为重复性1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(2)5为重复性2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(3)5为重复性3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(4)5为重复性4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(5)5为重复性5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(6)5为重复性6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图18为本发明精密度试验共有峰叠加特征图谱；其中，S(1)5为精密度1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(2)5为精密度2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(3)5为精密度3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(4)5为精密度4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(5)5为精密度5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(6)5为精密度6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图19为本发明稳定性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S(1)5为于0h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(2)5为于2h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(3)5为于4h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(4)5为于8h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(5)5为于12h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S(6)5为于24h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图20为本发明不同色谱柱考察中色谱柱试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为批号PF-108的色谱柱，S2为批号PF-51的色谱柱，S3为中谱红的色谱柱。
图21为本发明不同柱温考察；其中，S1为柱温23℃的色谱柱，S2为柱温25℃的色谱柱，S3为柱温27℃的色谱柱。
图22为本发明不同流速考察中流速试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1流速为1.20min/mL，S2流速为1.15min/mL，S3流速为1.25min/mL。
图23为本发明特征色谱图测定中岩白菜素对照品图谱。
图24为本发明特征色谱图测定中岩白菜素、没食子酸、槲皮苷、供试品叠加图谱。
图25为本发明特征色谱图测定中岩白菜素、供试品叠加图谱。
图26为本发明特征色谱图测定中矮地茶对照药材图谱。
图27为本发明特征色谱图测定中27批矮地茶中药饮片叠加图谱；其中，S1-S27分别表示1-27批矮地茶中药饮片叠加图谱。
图28为本发明特征色谱图测定中27批矮地茶中药材共有峰图谱。
图29为本发明特征色谱图测定中27批矮地茶标准汤剂叠加图谱；其中，S1-S27分别表示1-27批矮地茶标准汤剂叠加图谱。
图30为本发明特征色谱图测定中27批矮地茶标准汤剂拟合图。
图31为本发明含量测定中岩白菜素光谱图。
图32为本发明含量测定方法学验证专属性考察中空白溶剂对比图；其中，S1为对照品溶液特征图谱；S2为供试品溶液特征图谱，S3为空白溶剂(甲醇)特征图谱。
图33为本发明线性范围试验中岩白菜素对照品不同浓度线性曲线图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。
本发明提供一种矮地茶汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对矮地茶汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及岩白菜素含量测定，将矮地茶汤剂含量标准限定为每1g含岩白菜素为32.0-66.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及岩白菜素含量测定均采用液相色谱法测定。
本实施例中：
制备矮地茶标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的煎煮法，取15批次矮地茶饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得15批次矮地茶标准汤剂干膏粉。
1.干浸膏出膏率测试
取27批次矮地茶饮片，按上述制法制得27批次标准汤剂干膏粉，计算干浸膏出膏率(见表1)，并计算均值、SD值、出膏率允许范围。根据国家药监局《中药配方颗粒质量控制与标准制定的技术要求》中“标准汤剂的表征与应用”项下出膏率：以干膏粉计算浸膏得率及标准偏差(SD)。均值加减3倍SD(或均值的70％～130％)为出膏率的允许范围。由27批次标准汤剂出膏率数据，可计算出出膏率均值、SD、出膏率允许范围。
表1：出膏率
Figure BDA0003674291780000061
Figure BDA0003674291780000071
上述结果表明，标准汤剂出膏率允许范围按照均值加减3倍SD计算，为8.77％～16.69％；按照均值的70％～130％计算，为8.91％～16.55％。结合两组计算数据，拟定标准汤剂出膏率允许范围为9％～16.5％。
2.性状考察
根据27批次标准汤剂的实物性状特征，本品为黄棕色至棕色的粉末；气微，味微苦。
3.薄层鉴别
本产品为单味饮片矮地茶的干燥提取物，参考《中国药典》矮地茶“薄层鉴别”项下的方法，用矮地茶对照药材作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经27批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品[鉴别]项。试验方法和结果如下：
3.1试验方法照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
供试品溶液的制备：取本品约0.1g，加甲醇20ml，超声处理30分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
对照药材溶液制备：取矮地茶对照药材1g，加甲醇20ml，同法制成对照药材溶液。
色谱条件：薄层板:硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液、对照药材溶液各2μl；展开剂：二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(5:4:2)；显色剂：喷以1％三氯化铁-1％铁***(1:1)的混合溶液(临用前新配)，日光下检视。
对27批次标准汤剂进行试验，如图1(a)、1(b)所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，且斑点清晰。
4.浸出物测定
取27批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。
表2：浸出物测定结果
Figure BDA0003674291780000072
Figure BDA0003674291780000081
上述结果表明，27批次标准汤剂浸出物均值为38.96％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，即均值的70％，为27.27％；参考标准限度允许范围(均值加减3倍SD)的下限，即均值减3SD，为24.56％。通过比较，均值70％的结果既低于27批标准汤剂的最低检测值(31.25％)，也与最低检测值更接近。因此，拟定本品醇溶性浸出物不得少于27.3％。
5.特征图谱测试
5.1仪器、试剂与试药
(1)仪器：岛津高效液相色谱仪(LC-2030puls，日本岛津有限公司)；岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm)；恒温水浴锅(HMTD-7000，北京市永光明医疗仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)；万分之一天平(PX224ZH，奥豪斯仪器有限公司)；十万分之一天平(AWU220D，日本岛津有限公司)。
(2)试剂：乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)、甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)色谱纯；水为超纯水(实验室自制)、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)。
(3)标准品：岩白菜素(批号：111532-201604，含量：94.1％，中国食品药品检定研究院)、没食子酸(批号：110831-201906，含量：91.5％，中国食品药品检定研究院)、槲皮苷(批号：111538-202007，含量：93.5％，中国食品药品检定研究院)、矮地茶对照药材(批号：121213-201102，中国食品药品检定研究院)。
5.2试验方法
5.2.1色谱条件的确定
(1)最佳吸收波长的确定
基于方法的色谱条件结合PAD检测器对矮地茶标准汤剂样品进行多波长的扫描，扫描波长200-400nm，并选取3种检测波长进行研究，确定最佳吸收波长。
取矮地茶标准汤剂细粉(批号：T210706)适量，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入25％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为25℃；检测波长为230、250、270nm。
表3：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～40 2→15 98→85
40～75 15→50 85→50
75～95 50→55 50→45
95～97 55→2 45→98
97～107 2 98
结果显示，样品在200-300nm之间有较强、较多的吸收，详见图2，通过对比3种检测波长色谱图，选取250nm作为检测波长时，各特征峰分离度较好，干扰较小，基线平稳，故选取250nm作为检测波长。
(2)柱温的考察
本次实验选取20℃、25℃、30℃柱温进行比较，选择合适柱温。
取矮地茶标准汤剂细粉(批号：T210706)适量，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入25％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为20、25、30℃；检测波长为250nm。
表4：
Figure BDA0003674291780000091
Figure BDA0003674291780000101
结果显示，通过对比3种不同柱温的色谱图，如图3所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，选取25℃作为柱温时，选取的特征峰分离度较好，故选取25℃作为检测柱温。
(3)流速的考察
本次实验选取0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min 3种流速进行比较，选择合适流速。
取矮地茶标准汤剂细粉(批号：T210706)适量，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入25％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表5中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟0.8ml、1.0ml、1.2ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。
表5：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～40 2→15 98→85
40～75 15→50 85→50
75～95 50→55 50→45
95～97 55→2 45→98
97～107 2 98
结果显示，通过对比3种不同流速的色谱图，如图4所示，3种流动相的色谱峰信息及峰形差异不大，选取1.2ml/min作为流速时，峰分离度较好，故选取1.2ml/min作为流速。
(4)流动相的考察
本次实验选取0.1％甲酸、0.1％磷酸、0.1％磷酸溶液三种流动相进行比较，确定合适的流动相。
取矮地茶标准汤剂细粉(批号：T210706)适量，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入25％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇为流动相A，以0.1％甲酸、0.1％磷酸、0.1％磷酸溶液为流动相B，按表6中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。
表6：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～40 2→15 98→85
40～75 15→50 85→50
75～95 50→55 50→45
95～97 55→2 45→98
97～107 2 98
结果显示，通过对比3种不同流动相的色谱图，如图4所示，选取0.1％乙酸溶液为流动相时，无明显特征峰，选取0.1％磷酸溶液为流动相时，峰的信息完整，分离效果优于0.1％甲酸溶液，故选取0.1％磷酸。
(5)梯度优化
本次实验对矮地茶标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，确定最优梯度。
取矮地茶标准汤剂细粉(批号：T210706)适量，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入25％甲醇25ml，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表7、8、9中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。
表7：梯度1
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～20 5→15 95→85
20～85 15→55 85→45
85～87 55→5 45→95
87～97 5 95
表8：梯度2
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～40 2→15 98→85
40～75 15→50 85→50
75～95 50→55 50→45
95～97 55→2 45→98
97～107 2 98
表9：梯度3
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～30 2→15 98→85
30～45 15→50 85→50
45～75 50→55 50→45
75～77 55→2 45→98
77～87 2 98
结果显示，通过对矮地茶标准汤剂特征图谱的洗脱梯度进行优化，如图6所示，最终确定峰信息较多、峰形分布较均匀、各峰分离度较好的梯度2作为矮地茶标准汤剂特征图谱的洗脱梯度。
5.2.2色谱条件
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表10中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml；柱温为25℃；检测波长为250nm；进样量为10μl。
表10：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～40 2→15 98→85
40～75 15→50 85→50
75～95 50→55 50→45
95～97 55→2 45→98
97～107 2 98
5.3供试品溶液前处理方法考察
对矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)特征图谱的样品前处理方法进行考察，主要考察提取溶剂、提取方式、提取时间和提取溶剂用量(或取样量)对矮地茶标准汤剂特征图谱的影响。
5.3.1初始检测条件
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表11中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml；柱温为25℃；检测波长为250nm。
表11：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～40 2→15 98→85
40～75 15→50 85→50
75～95 50→55 50→45
95～97 55→2 45→98
97～107 2 98
参照物溶液的制备：取1.0g矮地茶对照药材，加25％甲醇25ml，超声30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材参照物溶液。另取岩白菜素对照品适量，精密称定，加甲醇分别制成每1ml含200μg的溶液，作为对照品参照物溶液。理论板数按岩白菜素峰计算应不低于1500。
供试品溶液的制备：取矮地茶标准汤剂细粉适量，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入25％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率100W，频率40kHz)30分钟，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.3.2提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，包括超声提取、回流提取，按上述5.3.1试验方法进行测定。结果表明，如图7所示，主峰个数一致，不同提取方式峰形差别不大，计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为2.83％(见表12)，小于3.0％，为节省时间，为方便操作，故选择样品提取方式为超声。
表12：
Figure BDA0003674291780000131
5.3.3提取时间的考察：分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述5.3.1试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，不同提取时间峰形差别不大(见图8)，故排除超声提取40分钟。计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为0.38％(见表13)，小于3.0％，无明显差别，故选择(总峰面积/取样量)值较大的提取30分钟为提取时间。
表13：
Figure BDA0003674291780000132
Figure BDA0003674291780000141
5.3.4提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.3.1试验方法进行测定。结果表明，如图9，主峰个数一致，不同提取时间峰形差别较大，故排除25％乙醇。计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为0.31％(见表14)，小于3.0％，故选择(总峰面积/取样量)值较大的25％甲醇为提取溶剂。
表14：不同提取溶剂考察结果
Figure BDA0003674291780000142
5.3.5溶剂用量考察：分别取不同溶剂量(15ml、25ml、35ml)制备供试品溶液，按5.3.1试验方法进行测定。结果表明，不同溶剂量，如图10所示，主峰个数一致，不同的不同溶剂量，峰形差别较小。计算结果表明，总峰面积与取样量比值的RSD值为1.58％(见表15)，小于3.0％，故选择(总峰面积/取样量)值较大的溶剂量25ml为提取溶剂用量。
表15：不同溶剂用量考察结果
Figure BDA0003674291780000143
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品细粉适量，取约0.2g，置具塞锥形瓶中，加入25％甲醇25mL，密塞，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.4特征图谱特征峰指认
(1)仪器、试剂与试药
仪器：岛津高效液相色谱仪(LC-2030puls，日本岛津有限公司)；岛津Shim-packGIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm)；恒温水浴锅(HMTD-7000，北京市永光明医疗仪器有限公司)；超声波清洗器(KQ-300DE，昆山市超声仪器有限公司)；万分之一天平(PX224ZH，奥豪斯仪器有限公司)；十万分之一天平(AWU220D，日本岛津有限公司)。
试剂：乙醇(天津市致远化学试剂有限公司)、甲醇(天津市科密欧化学试剂有限公司)色谱纯；水为超纯水(实验室自制)、磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)。
(2)标准品：岩白菜素(批号：111532-202005，含量：94.4％，中国食品药品检定研究院)、没食子酸(批号：110831-201906，含量：91.5％，中国食品药品检定研究院)、槲皮苷(批号：111538-202007，含量：93.5％，中国食品药品检定研究院)、矮地茶对照药材(批号：121213-201102，中国食品药品检定研究院)。
(3)样品测定
按照矮地茶标准汤剂质量标准特征图谱项下条件进行检测，实验结果如图11-15所示，由实验结果可知，在矮地茶标准汤剂特征图谱中能找到与没食子酸、槲皮苷和岩白菜素保留时间一致的色谱峰，经光谱对比确认，峰2为没食子酸、峰3为岩白菜素，峰4为槲皮苷。
5.5特征图谱分析方法验证
5.5.1专属性考察：取供试品用溶剂25％甲醇10ul，按以上5.3.1项下色谱条件进行测定。试验表明，如图16所示，空白溶剂无干扰，该方法专属性良好。
5.5.2重复性试验：取矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)样品约0.2g，共6份，按5.3.1色谱条件进行测定，进样6针测定。测定结果显示，供试品特征图谱峰形、峰数基本一致(见图17)。特征图谱中有5个共有峰，以岩白菜素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对峰面积RSD值、相对保留时间RSD值，均小于3.0％，在合格范围内(见表16、17)。试验表明该方法重现性良好。
表16：重复性试验特征图谱相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.330 0.330 0.326 0.325 0.325 0.325 0.76
2 0.428 0.427 0.421 0.42 0.419 0.419 0.97
3(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
4 1.487 1.489 1.497 1.498 1.5 1.499 0.37
5 1.604 1.607 1.616 1.617 1.62 1.619 0.41
表17：重复性试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.280 0.279 0.285 0.285 0.291 0.288 1.64
2 0.135 0.134 0.134 0.134 0.134 0.135 0.45
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
4 0.074 0.075 0.076 0.077 0.078 0.077 2.13
5 0.376 0.374 0.361 0.362 0.365 0.362 1.83
5.5.3精密度试验：取矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)样品约0.2g，按5.3.1色谱条件进行测定，连续进样6针测定，测定结果显示，供试品特征图谱峰形、峰数基本一致(见图18)。特征图谱中有5个共有峰，以岩白菜素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对峰面积RSD值、相对保留时间RSD值，均小于3.0％，在合格范围内(见表18、19)。试验表明该方法精密度良好。
表18：精密度试验特征图谱相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.326 0.324 0.325 0.326 0.328 0.329 0.57
2 0.421 0.419 0.419 0.421 0.426 0.427 0.83
3(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
4 1.497 1.499 1.498 1.493 1.489 1.487 0.33
5 1.617 1.619 1.618 1.612 1.607 1.605 0.37
表19：精密度试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.272 0.274 0.275 0.276 0.278 0.279 0.94
2 0.131 0.133 0.133 0.133 0.131 0.134 0.96
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
4 0.078 0.076 0.076 0.076 0.074 0.074 1.95
5 0.360 0.360 0.360 0.359 0.376 0.376 2.27
5.5.4稳定性试验：取矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)样品约0.2g，按5.3.1色谱条件进行测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，测定结果显示，供试品特征图谱峰形、峰数基本一致(见图19)。特征图谱中有5个共有峰，以岩白菜素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对峰面积RSD值、相对保留时间RSD值，均小于3.0％，在合格范围内(见表20、21)。试验表明供试品溶液在24小时内较稳定。
表20：稳定性试验特征图谱相对保留时间
峰号 0 2 4 8 12 24 RSD(％)
1 0.326 0.325 0.325 0.325 0.327 0.324 0.29
2 0.421 0.42 0.419 0.42 0.423 0.417 0.43
3(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
4 1.495 1.497 1.498 1.495 1.493 1.499 0.14
5 1.614 1.617 1.618 1.614 1.611 1.619 0.17
表21：稳定性试验特征图谱相对峰面积
峰号 0 2 4 8 12 24 RSD(％)
1 0.297 0.297 0.298 0.299 0.300 0.303 0.70
2 0.148 0.148 0.137 0.146 0.148 0.149 2.82
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
4 0.077 0.075 0.075 0.076 0.079 0.074 2.22
5 0.372 0.373 0.378 0.377 0.375 0.376 0.56
5.5.5中间精密度考察
由同项目其他分析人员在不同日期和不同设备下操作，取同一批矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)约0.2g，精密称定，平行6份，按“5.3.1”项下方法制备供试品溶液，并进行分析。以岩白菜素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值，实验结果见表22-25。
表22：矮地茶标准汤剂特征图谱中间精密度相对保留时间
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
1 32.71 32.67 32.72 32.79 32.87 32.92 0.30
2 42.19 42.13 42.18 42.22 42.40 42.44 0.30
3(S) 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 0.00
4 151.31 151.35 151.23 151.10 150.92 150.88 0.13
5 163.52 163.56 163.46 163.31 163.12 163.07 0.13
表23：矮地茶标准汤剂特征图谱中间精密度相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
1 28.74 28.78 28.90 28.94 29.03 29.10 0.48
2 13.93 13.93 13.95 13.98 14.06 14.10 0.51
3(S) 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 0.00
4 8.35 8.45 8.48 8.46 8.40 8.30 0.84
5 39.08 39.13 38.97 38.90 38.89 38.76 0.35
表24：矮地茶标准汤剂特征图谱重复性相对保留时间
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
1 32.92 32.74 32.74 32.84 32.81 32.92 0.25
2 42.44 42.28 42.27 42.35 42.30 42.43 0.18
3(S) 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 0.00
4 150.88 150.98 150.95 150.82 150.92 150.74 0.06
5 163.07 163.17 163.16 163.00 163.11 162.92 0.06
表25：矮地茶标准汤剂特征图谱重复性相对峰面积
峰号 1 2 3 4 5 6 RSD(％)
1 29.10 29.35 29.73 29.54 29.66 29.33 0.80
2 14.10 14.06 14.17 14.22 14.22 14.28 0.58
3(S) 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 0.00
4 8.30 8.32 8.48 8.40 8.47 7.87 2.73
5 38.76 39.24 39.08 38.19 38.60 38.08 1.20
5.5.6耐用性考察
(1)不同色谱柱的考察
取矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)样品约0.2g，按“5.3.1”项下试验方法，以不同型号的3根色谱柱(250mmx4.6mm，5μm)(分别是岛津GISTAQ-C18(PF-108)、岛津GIST C18(PF-51)、中谱红(RD-C18))分别进样测定。测定结果显示，供试品特征图谱峰形、峰数不一致(见图20)。特征图谱中有5个共有峰，以岩白菜素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD％值。计算结果显示，相对保留时间RSD％值、相对峰面积RSD值，分别大于3.0％、大于5.0％，均在不合格范围内(见表26、27)。试验表明不同厂家不同型号的色谱柱对特征图谱测定影响较大，即对特征图谱测定只能使用规定型号的色谱柱。
表26：不同色谱柱考察特征图谱相对保留时间
峰号 PF-108 PF-51 中谱红 RSD(％)
1 0.326 0.289 0.270 9.65
2 0.420 0.359 0.383 7.93
3(S) 1.000 1.000 1.000 0.00
4 1.496 1.618 1.528 4.09
5 1.615 1.748 1.659 4.05
表27：不同色谱柱考察特征图谱相对峰面积
峰号 PF-108 PF-51 中谱红 RSD(％)
1 0.299 0.253 0.290 8.80
2 0.142 0.138 0.146 2.75
3(S) 1.000 1.000 1.000 0.00
4 0.080 0.080 0.071 6.34
5 0.371 0.366 0.379 1.75
(2)不同柱温的考察
取矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)样品约0.2g，按“5.3.1”项下试验方法，以柱温为23℃、25℃、27℃分别进样测定。测定结果显示，供试品特征图谱峰形、峰数基本一致(见图21)。特征图谱中有5个共有峰，以岩白菜素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对保留时间RSD％值、相对峰面积RSD％值，均小于3.0％，在合格范围内(见表28、29)。试验表明不同柱温变化对特征图谱测定影响较小，即不同柱温耐用性较好。
表28：不同柱温考察特征图谱相对保留时间
峰号 23℃ 25℃ 27℃ RSD(％)
1 0.334 0.323 0.318 2.52
2 0.426 0.417 0.414 1.49
3(S) 1.000 1.000 1.000 0.00
4 1.489 1.500 1.503 0.49
5 1.608 1.62 1.622 0.47
表29：不同柱温考察特征图谱相对峰面积
峰号 23℃ 25℃ 27℃ RSD(％)
1 0.282 0.277 0.277 1.18
2 0.135 0.130 0.132 1.75
3(S) 1.000 1.000 1.000 0.00
4 0.071 0.072 0.073 1.61
5 0.379 0.373 0.364 2.02
(3)不同流速的考察
取矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)样品约0.2g，按“5.3.1”项下试验方法，以柱温为1.15ml/min、1.20ml/min、1.25ml/min分别进样测定。测定结果显示，供试品特征图谱峰形、峰数基本一致(见图22)。特征图谱中有5个共有峰，以岩白菜素为参照峰S，计算各特征峰与S峰的相对保留时间及相对峰面积，并计算RSD值。计算结果显示，相对保留时间RSD％值、相对峰面积RSD％值，均小于3.0％，在合格范围内(见表30、31)。试验表明细微的流速变化，对特征图谱测定影响较小，即不同流速耐用性较好。
表30：不同流速考察特征图谱相对保留时间
峰号 1.15ml/min 1.20ml/min 1.25ml/min RSD(％)
1 0.335 0.328 0.320 2.29
2 0.431 0.425 0.415 1.91
3(S) 1.000 1.000 1.000 0.00
4 1.485 1.490 1.501 0.55
5 1.603 1.608 1.620 0.54
表31：不同流速考察特征图谱相对峰面积
峰号 1.15ml/min 1.20ml/min 1.25ml/min RSD(％)
1 0.317 0.309 0.308 1.56
2 0.153 0.148 0.147 2.41
3(S) 1.032 1.011 0.979 2.63
4 0.075 0.075 0.077 1.22
5 0.374 0.376 0.373 0.36
该特征图谱方法经专属性、精密度、重复性、稳定性和中间精密度验证及耐用性考察，结果均符合要求，表明建立的方法能很好的用于矮地茶的特征图谱测定。
5.6标准汤剂特征图谱表征分析
5.6.1特征色谱图测定
照上述拟定的特征图谱分析方法，测定27批矮地茶标准汤剂及其制备使用的27批次中药饮片特征图谱，通过岩白菜素、槲皮苷和没食子酸定位，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有5个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的5个特征峰保留时间相对应，其中与定位标准品岩白菜素对照品参照物相对应的峰为峰3，共有峰特征图谱，共有峰特征图谱详见图23～30。
5.6.2特征色谱图相对保留时间评价
按上述拟定的特征图谱分析方法，测定27批矮地茶标准汤剂特征图谱。结果显示，特征图谱中有5个共有峰，以定位标准品参照物峰相对应的峰(3)为参照峰S，计算特征峰峰1、峰2、峰4、峰5与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围(见表32(1)、32(2))。
表32(1)：S1-S15标准汤剂共有峰相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15
1 0.320 0.319 0.320 0.320 0.320 0.320 0.320 0.319 0.319 0.319 0.319 0.319 0.319 0.319 0.319
2 0.401 0.400 0.400 0.401 0.400 0.400 0.400 0.400 0.400 0.400 0.400 0.401 0.400 0.400 0.400
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
4 1.527 1.528 1.528 1.528 1.528 1.529 1.529 1.528 1.529 1.528 1.527 1.527 1.528 1.528 1.528
5 1.648 1.648 1.649 1.649 1.649 1.649 1.649 1.648 1.649 1.648 1.648 1.647 1.648 1.649 1.648
表32(2)：S16-S27标准汤剂共有峰相对保留时间
Figure BDA0003674291780000211
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证及耐用性考察，且符合要求。按上述拟定的特征图谱分析方法，对27批标准汤剂的特征图谱进行测定，结果分析，标定了5个共有特征峰，其中峰3为岩白菜素。以岩白菜素参照物相对应的峰(3)为S峰，计算另4个特征峰相对保留时间，以27批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.319(峰1)、0.400(峰2)、1.528(峰4)、1.659(峰5)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。
6.含量测定
矮地茶为紫金牛科植物紫金牛Ardisiajaponzca(Thunb.)Blume的干燥全草。产于湖南省各地，尤以益阳、安北、桃江、平江等县较多；其他，如长江以南各省区亦都有产。多自采自用，少数地区的贸易市原名紫金牛，始载于宋。矮地茶含紫金牛酚Ⅰ、Ⅱ(ardisinolⅠ、Ⅱ)，紫金牛素(ardisin)、岩石菜内酯(dergenin)、信筒子醌(embelin)，矮地茶素1号(即岩白菜素，Bergenin)等。现代药理研究认为，其中矮地茶素1号具有镇咳的功效。因此，本研究参考中国药典2020年版矮地茶中含量测定项方法，建立岩白菜素的含量方法对于控制矮地茶标准汤剂的质量有重要的参考价值。
对岩白菜素对照品(批号：111532-201604)经行全波长扫描，确定其对佳吸收波长，结果表明，如图31所示，在275nm波长下检测，基线平稳，分离度好，无杂质峰干扰，故选择275nm波长作为矮地茶标准汤剂含量测定的检测波长。
6.1试验方法
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)(岛津Shim-pack GIST C18-AQ(4.6mm×250mm，5μm))；以甲醇-水(20：80)为流动相；流速为每分钟1.2ml；柱温为25℃；检测波长为275nm。理论板数按岩白菜素峰计算应不低于1500。
参照物溶液的制备：取岩白菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含岩白菜素200μg的溶液。
供试品溶液的制备：取本品细粉适量，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.2供试品溶液前处理方法考察
对矮地茶标准汤剂(批号：Y210701)含量测定的提取方式、提取溶剂、提取时间和溶剂的量进行考察，确定最佳的样品前处理方式。
6.2.1提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，RSD％小于2％(见表33)，为方便后续实验，故选择样品提取方式为超声处理。
表33：不同提取方法对比
Figure BDA0003674291780000221
6.2.2提取时间的考察：分别以不同的提取时间制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明RSD％小于2％，样品超声处理30分钟，含量最高(见表34)，故选择样品超声时间为30分钟。
表34：不同提取时间对比
Figure BDA0003674291780000222
6.2.3提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂(乙醇、80％甲醇、甲醇)制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，溶剂为甲醇，含量最高(见表35)，故选择样品溶剂为甲醇。
表35：不同提取溶剂对比
Figure BDA0003674291780000223
6.2.4溶剂的量考察分别以不同溶剂用量(35ml、50ml、65ml)制备供试品溶液，按上述6.1试验方法进行测定。结果表明，溶剂用量为50ml，含量最高(见表36)，故选择样品溶剂量50ml。
表36：不同溶剂量对比
Figure BDA0003674291780000231
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取本品细粉适量，取约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.3含量测定方法学验证
6.3.1专属性考察：取样品用溶剂甲醇，按上述6.1试验方法进行测定，试验表明：空白溶剂无干扰(见图32)，该方法专属性良好。
6.3.2重复性试验：取同批次标准汤剂样品约0.2g，共6份，按上述6.1试验方法进行测定，测得样品中岩白菜素含量平均值分别为40.70mg/g，RSD值为0.252％，试验表明该方法重复性良好(见表37)。
表37：
Figure BDA0003674291780000232
6.3.3精密度试验：取同批次标准汤剂样品约0.2g，照上述6.1试验方法连续进样6针，测定其峰面积，计算样品中岩白菜素峰面积的RSD值为0.096％，试验表明仪器精密度良好(见表38)。
表38：
Figure BDA0003674291780000233
6.3.4稳定性试验：取一批标准汤剂样品约0.2g，按上述6.1试验方法，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样，测定其峰面积，计算样品中岩白菜素峰面积的RSD值为0.573％，试验表明供试品溶液在24小时内较稳定(见表39)。
表39：
Figure BDA0003674291780000241
6.3.5线性范围试验：取岩白菜素对照品溶液以浓度：0.39757mg/ml、0.198785mg/ml、0.0993925mg/ml、0.0496962mg/ml、0.024545mg/ml、0.004969mg/ml按6.1项下色谱条件进行测定。
以岩白菜素峰面积为纵坐标，进样质量为横坐标，绘制标准曲线，并进行线性回归，其回归方程为：y＝13492129.9774x+9236.9974，R2＝1，可知岩白菜素在4.9μg/ml～397μg/ml范围内与其峰面积具有良好的线性关系(详见表40和图33)。
表40：岩白菜素线性关系考察结果
编号 峰面积 浓度(mg/ml)
线性1 5377887 0.39757
线性2 2675537 0.198785
线性3 1358495 0.0993925
线性4 689020 0.0496962
线性5 343294 0.024545
线性6 67019 0.004969
6.3.6加样回收率试验：精密称取样品(岩白菜素含量为40.6963mg/g)的样品0.1g、0.13g、0.15g各三份，各加入已知浓度的岩白菜素对照品溶液(378ug/ml)10.5ml、7.0ml、5.0ml，按6.1项下方法制备供试品溶液，并按6.1项下色谱条件进行测定，计算岩白菜素平均加样回收率为97.50％，RSD为2.85％(详见表41)。
表41：岩白菜素加样回收率试验结果
Figure BDA0003674291780000242
Figure BDA0003674291780000251
6.3.7耐用性考察
(1)不同色谱柱的考察
取一批样品约0.2g，按“6.1”项下试验方法，以不同厂家不同型号的3根色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)(分别是岛津GIST C18-AQ、中谱红RD-C18、岛津GIST C18)分别进样测定。计算结果显示，测定的含量RSD值为0.99％，小于2.0％(见表42)，试验表明该方法在不同厂家不同型号色谱柱的耐用性良好。
表42：
Figure BDA0003674291780000252
(2)不同柱温的考察
取一批样品约0.2g，按“6.1”项下试验方法，以流速23℃、25℃、27℃分别进样测定。计算结果显示，测定含量RSD值为0.104％，小于2.0％(见表43)，试验表明该方法对柱温较小变动的耐用性良好。
表43：
Figure BDA0003674291780000253
(3)不同流速的考察
取一批样品约0.2g，按“6.1”项下试验方法，以流速1.0ml/min、1.2ml/min、1.4ml/min分别进样测定。计算结果显示，测定含量RSD值为0.195％，小于2.0％(见表44)，试验表明该方法对流速较小变动的耐用性良好。
表44：
Figure BDA0003674291780000261
(4)不同流动相考察
取一批样品约0.2g，按“6.1”项下试验方法，以甲醇-水(21：79)、(20：80)、(19：81)分别进样测定。计算结果显示，测定含量RSD值为0.855％，小于3.0％(见表45)，试验表明该方法对流动相比例较小变动的耐用性良好。
表45：
Figure BDA0003674291780000262
综上，整个分析方法经专属性、峰纯度、精密度、重复性、稳定性、线性考察、中间精密度、加样回收及耐用性考察，结果均符合要求，表明建立的方法能很好的用于岩白菜素的含量测定。
6.4标准汤剂及中药材含量及转移率测定
矮地茶药材经产地初加工成片，经炮制后加工成矮地茶饮片，其岩白菜素含量不会发生变化，因此矮地茶饮片特征色谱图及岩白菜素含量参考其药材数据。
6.4.1按照上述拟定的含量分析方法，测定27批矮地茶标准汤剂及其制备使用的27批次矮地茶饮片岩白菜素含量，结果详见表46、47、48。
表46：27批矮地茶中药饮片岩白菜素测定结果
Figure BDA0003674291780000263
Figure BDA0003674291780000271
矮地茶饮片中岩白菜素含量平均为9.93mg/g，实测含量范围为8.05mg/g～12.64mg/g，SD为1.27；按均值的70％～130％计算，岩白菜素含量允许范围为6.95mg/g～12.91mg/g。按照均值-SD～均值+3SD来算，含量允许范围为6.12mg/g～13.74mg/g。
表47：27批矮地茶标准汤剂岩白菜素测定结果
Figure BDA0003674291780000272
Figure BDA0003674291780000281
本品标准汤剂中岩白菜素平均含量为44.11mg/g，测得含量范围为32.34mg/g～65.49mg/g，SD为7.93；按均值的70％～130％计算，岩白菜素含量允许范围为30.88mg/g～57.34mg/g。按照均值-3SD～均值+3SD来算，岩白菜素含量允许范围为20.32mg/g～67.90mg/g。27批标准汤剂含量的最高值为65.49mg/g，不在按均值的70％～130％计算的范围(30.88mg/g～57.34mg/g)内；而27批标准汤剂含量的最低值为32.34mg/g与按照均值-3SD～均值+3SD来算的范围底限(20.32mg/g)相差很大。因此，以27批标准汤剂测得含量范围为依据，拟定本标准汤剂的岩白菜素含量范围更合理。故拟定本标准汤剂的岩白菜素含量范围为：32.0mg/g～66.0mg/g。
6.4.1岩白菜素含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对27批标准汤剂及其制备用中药饮片测定结果，计算岩白菜素含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。矮地茶饮片标准汤剂由矮地茶饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其岩白菜素含量转移率见表48。
表48：27批矮地茶标准汤剂岩白菜素含量转移率
Figure BDA0003674291780000282
Figure BDA0003674291780000291
由以上数据可知，矮地茶饮片依方案煎煮制得矮地茶饮片标准汤剂，本品岩白菜素平均转移率为56.32％，测得转移率范围为36.70％～68.63％，SD为7.01。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，岩白菜素含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为39.42％～73.22％；按照均值-3SD～均值+3SD来算，为35.29％～77.35％。27批标准汤剂的转移率范围，都在均值-3SD～均值+3SD的范围内，故拟定本标准汤剂的岩白菜素含量转移率范围为：35.3％～77.4％。
本发明提供的矮地茶汤剂质量检测方法，通过对矮地茶汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及岩白菜素含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定矮地茶汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立矮地茶汤剂可行的质量标准，实现矮地茶标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图；矮地茶饮片煎煮制得矮地茶饮片汤剂，拟定矮地茶标准汤剂的岩白菜素含量范围为：32.0～66.0mg/g；岩白菜素平均转移率为56.32％，拟定矮地茶标准汤剂的岩白菜素含量转移率范围为：35.3～77.4％，结果表明，本发明多个批次汤剂中岩白菜素含量及其转移率均在允许范围之内，因此本发明可为矮地茶配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种矮地茶汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法，
通过对矮地茶汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及岩白菜素含量测定，将矮地茶汤剂含量标准限定为每1g含岩白菜素为32.0-66.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及岩白菜素含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以矮地茶对照药材制成的溶液作为参照物溶液b，以岩白菜素对照品制成的溶液作为对照品溶液b，以矮地茶汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液b，分别精密吸取参照物溶液b、对照品溶液b和供试品溶液b，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～40 2→15 98→85 40～75 15→50 85→50 75～95 50→55 50→45 95～97 55→2 45→98 97～107 2 98
流速：1.2mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：250nm。
2.如权利要求1所述的矮地茶汤剂质量检测方法，其特征在于，所述煎煮法包括：取矮地茶饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，进行固液分离，浓缩干燥，制得矮地茶汤剂干膏粉。
3.如权利要求1所述的矮地茶汤剂质量检测方法，其特征在于，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取矮地茶汤剂样品0.1g，加甲醇20mL，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制得供试品溶液a；
(2)制备对照药材溶液a：取矮地茶对照药材1g，加甲醇20ml，超声处理30min，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制得对照药材溶液a；
(3)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：供试品溶液a与对照药材溶液a各2uL；展开剂：体积比为5：4：2的二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇溶液；显色剂：临用前新配的体积比为1:1的1％三氯化铁-1％铁***混合溶液，日光下检视。
4.如权利要求1所述的矮地茶汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以乙醇为溶剂，采用醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定浸出物范围。
5.如权利要求1所述的矮地茶汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取矮地茶对照药材1.0g，加入25％甲醇25mL，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：取岩白菜素对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制得浓度为200ug/mL的对照品溶液b；
(3)制备供试品溶液b：取矮地茶汤剂样品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入精密称定的25％甲醇25mL，密塞，超声处理30min，放冷，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液b。
6.如权利要求1所述的矮地茶汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定岩白菜素含量包括：进行液相色谱仪分析，以岩白菜素对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以矮地茶汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：以甲醇为流动相A，以水为流动相B，进行洗脱；流速：1.2mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测波长：275nm。
7.如权利要求6所述的矮地茶汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定岩白菜素含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取岩白菜素对照品适量，精密称定，加甲醇制成含岩白菜素的浓度为200ug/ml的溶液，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取矮地茶汤剂样品约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
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