CN104614482A

CN104614482A - 龙加通络胶囊中薯蓣皂苷含量的测定方法

Info

Publication number: CN104614482A
Application number: CN201410726072.4A
Authority: CN
Inventors: 任为之; 王现昌; 于丽云; 李云鹏; 段丽萌; 王顺先
Original assignee: Tianjin Century Tian Long Pharmaceutcal Corp Ltd
Current assignee: Tianjin Century Tian Long Pharmaceutcal Corp Ltd
Priority date: 2014-12-04
Filing date: 2014-12-04
Publication date: 2015-05-13

Abstract

本发明公开了龙加通络胶囊中薯蓣皂苷含量的测定方法。它是样品以甲醇超声提取,采用Diamonsil C18（1）（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，流动相：乙腈-水（53-58:45）；流速：1.0ml?Min^-1，设置温度：90℃，气流量：2.4L/min；柱温：35℃。结果：薯蓣皂苷在1.03-6.18μg范围内峰面积呈良好的线性关系，(r=0.9998)，平均回收率100.96%，RSD＝1.97%。本发明建立了高效液相色谱一蒸发光散射检测法(HPLC—ELSD)对成品中薯蓣皂苷进行含量测定的方法，克服了在紫外末端检测时流动相带来的干扰，所得图谱基线平直，灵敏度高，与杂质有很好的分离度，提高了方法的专属性，测定结果更为准确。

Description

龙加通络胶囊中薯蓣皂苷含量的测定方法

技术领域

本发明属于中药制剂含量测定技术领域，涉及龙加通络胶囊中薯蓣皂苷含量的测定方法。

背景技术

龙加通络胶囊是天津世纪天龙药业有限公司生产的中药六类新药，该药具有活血化瘀、益气通络的功效，临床用于中风病（轻中度脑梗塞）恢复期气虚血瘀证，症见半身不遂，口舌歪斜，语言蹇涩或不语，偏身麻木，手足肿胀，舌暗或有瘀斑，苔薄白。临床疗效确切，使用安全。

龙加通络胶囊，专利申请号：02156786.7。发明名称：一种治疗中风的药物组合物、其制备方法和应用。它是由穿山龙和刺五加或由穿山龙和刺五加浸膏制成。组方中穿山龙属为薯蓣科植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino，以根状茎入药，具有舒筋活络，祛风止痛功效。刺五加为五加科植物刺五加Acanthopanax senticosus（Rupr.et Maxim.）Harms，以干燥根和根茎或茎入药，具益气健脾，补肾安神功效。

目前龙加通络胶囊在质量的控制上采用对薯蓣皂苷元进行测定，此方法须经酸水解、萃取、调节pH等步骤，存在操作繁琐，检测时间长，易产生误差等问题。尚没有龙加通络胶囊中薯蓣皂苷的定量测定方法。为了更好的控制龙加通络胶囊的质量，现对龙加通络胶囊中的薯蓣皂苷含量进行测定，摸索建立了薯蓣皂苷的高效液相色谱一蒸发光散射(HPLC-ELSD)测定法，从而完成了本发明。本法预处理操作简单，检测时间短，更适于大生产的要求。

发明内容

本发明建立了高效液相法测定龙加通络胶囊中薯蓣皂苷含量的方法，它是采用Diamonsil C18（1）（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相：乙腈-水（53-58:45）；流速：1．0 ml·Min-1，设置温度：90℃，气流量：2.4L/min；柱温：35℃ 。结果：薯蓣皂苷在1.03-6.18μg范围内峰面积呈良好的线性关系， (r=0.9998)，平均回收率100.96%，RSD＝1.97%。结论：本方法简便、准确、重现性好，可用于龙加通络胶囊中薯蓣皂苷的质量控制。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

一种龙加通络胶囊的含量测定方法，其特征在于它是采用高效液相色谱一蒸发光散射测定法，测定胶囊中薯蓣皂苷的含量，按如下的步骤进行：

（1）对照品溶液的制备：取薯蓣皂苷对照品约5mg，精密称定，置5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；

（2）供试品溶液的制备：龙加通络胶囊内容物研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用；

（3）测定：分别精密吸取步骤（1）得到的对照品溶液10ul、20ul，步骤（2）提取的供试品溶液7～20ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量。色谱条件:反相高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器检测，流动相乙腈与水的体积比为53-58:45，色谱柱为Diamonsil C18（1）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1．0 ml·Min-1，设置温度为90℃，气体流速设置为2.4L/min，柱温为35℃，理论板数以薯蓣皂苷峰计算应不低于4000；每粒龙加通络胶囊含穿山龙按薯蓣皂苷（C₂₇H₄₂O₃）计不得少于3mg。其中所述的超声处理指的是：功率120W，频率40KHz，30分钟。

本发明在对成品薯蓣皂苷含量测定的方法研究中，参考了2010年版《中国药典》一部（国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．北京：中国医药出版社，2010：250．）收载的穿山龙药材薯蓣皂苷含量测定方法，但因龙加通络胶囊为复方中药制剂，以药典法203nm 的紫外末端作为检测波长，基线不平，干扰大，使检测的灵敏度降低。故无法完全按药典方法对龙加通络胶囊进行含量测定。

本发明更加详细的制备方法及测定方法如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器　Agilent 1260高效液相色谱（美国安捷伦公司）；Alltech 2000ES ELSD检测器；9860D超声波清洗器（天津科贝尔光电技术有限公司）；电子分析天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药　薯蓣皂苷对照品（供含量测定用，批号111707-200501）由中国药品生物制品检定所提供；乙腈（色谱纯，天津康科德科技有限公司）；其余试剂均为分析纯；市售。龙加通络胶囊（本公司生产; 规格：0.45g/粒;批号：1312203，1312204，1312205）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件反相高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器检测，流动相为乙腈-水（53-58:45），色谱柱为Diamonsil C₁₈（1）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1．0 ml·Min^-1，设置温度为90℃，气体流速设置为2.4L/min，柱温为35℃，理论板数以薯蓣皂苷峰计算应不低于4000。

2.2 溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备取薯蓣皂苷对照品约5mg，精密称定，置5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；

2.2.2　供试品溶液的制备龙加通络胶囊内容物研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量。超声处理（功率120W，频率40KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3阴性对照溶液的制备取缺穿山龙的处方药，按制备工艺制成阴性样品，按供试品溶液处理方法制成阴性对照液。

2.3方法学考察

2.3.1 专属性试验　精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液适量，注入液相色谱仪，按“2．1项”下色谱条件实验，结果表明供试品色谱中薯蓣皂苷色谱峰与其他成分的色谱峰分离良好，且阴性样品溶液色谱峰未见干扰（见图1-3）。

2.3.2 线性关系精密吸取薯蓣皂苷对照品溶液(0.206 mg／m1)5、10、15、20 、25、30μl，注入高效液相色谱仪，测定色谱峰面积，以峰面积对数值为纵坐标，进样量(μg)对数值为横坐标，绘制标准曲线。

其回归方程：Y=1.6784 X+5.7976 g=0.9998

结果表明，薯蓣皂苷在1.03~6.18μg范围内线性关系良好。

2.3.3 精密度试验取“2.2.1项”下配制的对照品溶液，重复进样6次，得薯蓣皂苷峰面积RSD=0.94％，结果表明本方法精密度较好。

2.3.4 稳定性试验取同一制备样品溶液（批号1312203），分别于0、2、4、6、8、12、24、26、28小时进样测定，RSD=1.1％ (n=9)，结果表明供试品溶液在28小时内含量稳定。

2.3.5 重复性试验取上稳定性试验同批样品，按“2.2.2项”下方法制备6份样品溶液，按“2.1项”下色谱条件分别测定，结果该批样品每粒中含薯蓣皂苷的平均值为3.58mg，RSD=1.71％ (n=6)，表明所用方法重复性好。

2.3.6 加样回收率试验取已知准确含量的样品适量，共6份，精密称定，分别精密加入对照品，按“2.2.2项”下方法，制备供试液，依“2.1项”下色谱条件测定，计算加样回收率(％)，试验结果表明平均回收率为100.96%，RSD为1.97%。所采用的测定方法准确。

2.4 样品含量测定取龙加通络胶囊3批，分别按“2.2.2项”下方法制备样品溶液，依“2.1项”下方法测定，计算出每1粒中薯蓣皂苷的平均含量，结果见下表。

3. 讨论

3.1 在对成品薯蓣皂苷含量测定的方法研究中，参考了2010年版《中国药典》一部收载的穿山龙药材薯蓣皂苷含量测定方法，但因龙加通络胶囊为复方中药制剂，以药典法203nm 的紫外末端作为检测波长，基线不平，干扰大，使检测的灵敏度降低。故无法完全按药典方法对龙加通络胶囊进行含量测定。

3.2 经摸索建立了薯蓣皂苷的高效液相色谱一蒸发光散射(HPLC-ELSD)测定法。研究表明, 选用蒸发光散射检测器作为检测手段，对成品中薯蓣皂苷进行分析，克服了在紫外末端检测时流动相带来的干扰，所得图谱基线平直，灵敏度高，与杂质有很好的分离度，提高了方法的专属性，测定结果更为准确。

3.3 本方法还对样品的提取溶剂、提取次数及提取时间进行了如下考查，以保证样品的提取操作合理、完全。

3.3.1 提取溶剂的考查　比较不同提取溶剂：分别以65%乙醇、65%甲醇、无水乙醇、甲醇超声提取，按供试品溶液制备方法制成供试液，按含量测定方法测定，结果见下表。

结果表明，65%乙醇、65%甲醇、和甲醇超声提取较无水乙醇提取样品薯蓣皂苷的含量高，但65%乙醇和65%甲醇提取液颜色深，较粘稠，考虑到色谱柱的保护故选用甲醇作为提取溶剂。

3.3.2 提取时间的选择：

提取时间的考查取龙加通络胶囊内容物研细，分别取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量。分别超声处理（功率120W，频率40KHz）25、30分、35分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，做为供试品溶液，按含量测定方法测定，结果见下表。

结果表明，功率120W，频率40KHz，30分钟，薯蓣皂苷总量较高。

3.3.3样品提取次数考查取龙加通络胶囊内容物研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量。超声处理（功率120W，频率40KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，做为供试品溶液Ⅰ（第一次提取）。滤渣按上述操作进行第二次提取，滤过，取续滤液做为供试品溶液Ⅱ(第二次提取)。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液注入液相色谱仪，测定, 结果见下表。

结果表明，第二次提取液在被测成分保留时间处无吸收峰，样品超声提取一次即可提取完全。

3.4 按药典中药质量标准分析方法验证指导原则进行了方法学验证，考查证明，本方法操作简便、准确、重现性好，可用于龙加通络胶囊的质量控制。

本发明公开的龙加通络胶囊含量测定方法的优点在于：

（1）经摸索建立了薯蓣皂苷的高效液相色谱一蒸发光散射(HPLC-ELSD)测定法。研究表明, 选用蒸发光散射检测器作为检测手段，对成品中薯蓣皂苷进行分析，克服了在紫外末端检测时流动相带来的干扰，所得图谱基线平直，灵敏度高，与杂质有很好的分离度，提高了方法的专属性，测定结果更为准确。

（2）经方法学考察证明，本方法操作简便、准确、重现性好，可用于龙加通络胶囊的质量控制。

（3）本发明有效地解决了龙加通络胶囊在质量的控制上采用薯蓣皂苷元进行测定，存在的操作繁琐，检测时间长，易产生误差等问题。本法预处理操作简单，检测时间短，更适于大生产的要求。

附图说明：

图1为龙加通络胶囊对照品的HPLC图谱；其中1为薯蓣皂苷；

图2为供试品的HPLC图谱；其中1为薯蓣皂苷；

图3为阴性对照品溶液的HPLC图谱。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。

实施例1

龙加通络胶囊的制备（批号1312203）

（1）穿山龙1524g加水煎2次，每次2-3小时，水提液经过滤，减压浓缩，相对密度1.06-1.08（60℃），浓缩液放冷后加入95%（v/v）乙醇至含乙醇70%（v/v）混匀，静置过夜，滤去沉淀；

（2）刺五加1246g按2010年药典383页法制备，加入步骤（1）得到的穿山龙提取滤液中减压浓缩；

（3）浓缩物中加入40-60g碳酸氢钙或二氧化硅混匀；

（4）真空干燥，制成能通过5号筛的粉末，填装成1000粒胶囊，密封包装。

检测结果：（1）胶囊内容物呈棕黄色，（2）以异嗪皮啶对照品为阳性对照，进行薄层色谱鉴别；（3）活性成分皂苷含量3.0mg/粒。

实施例2

龙加通络胶囊的含量测定方法：

（1）对照品溶液的制备：精密称取薯蓣皂苷对照品5.15mg，置5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；

（2）供试品溶液的制备龙加通络胶囊内容物研细，取约0.5g，精密称定0.5012g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理（功率120W，频率40KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用；

（3）测定：分别精密吸取步骤（1）得到的对照品溶液10ul、20ul，步骤（2）提取的供试品溶液8ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量。

色谱条件:反相高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器检测，流动相乙腈与水的体积比为55:45，色谱柱为Diamonsil C18（1）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1．0 ml·Min-1，设置温度为90℃，气体流速设置为2.4L/min，柱温为35℃，理论板数以薯蓣皂苷峰计算应不低于4000；每粒龙加通络胶囊含穿山龙按薯蓣皂苷（C₂₇H₄₂O₃）计不得少于3mg。

实施例3

龙加通络胶囊的含量测定方法：

（1）对照品溶液的制备：精密称取薯蓣皂苷对照品5.08mg，置5ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取2ml置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，备用；

（2）供试品溶液的制备龙加通络胶囊内容物研细，取约0.5g，精密称定0.5112g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，超声处理（功率120W，频率40KHz）30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用；

（3）测定：分别精密吸取步骤（1）得到的对照品溶液10ul、20ul，步骤（2）提取的供试品溶液15ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量。

色谱条件:反相高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器检测，流动相乙腈与水的体积比为53:47，色谱柱为Diamonsil C18（1）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1．0 ml·Min-1，设置温度为90℃，气体流速设置为2.4L/min，柱温为35℃，理论板数以薯蓣皂苷峰计算应不低于4000；每粒龙加通络胶囊含穿山龙按薯蓣皂苷（C₂₇H₄₂O₃）计不得少于3mg。

Claims

1.一种龙加通络胶囊中薯蓣皂苷含量的测定方法，其特征在于它是采用高效液相色谱一蒸发光散射测定方法，测定胶囊中薯蓣皂苷的含量,按如下的步骤进行：

（2）供试品溶液的制备: 龙加通络胶囊内容物研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，备用；

（3）测定：分别精密吸取步骤（1）得到的对照品溶液10ul、20ul，步骤（2）提取的供试品溶液7～20ul，注入液相色谱仪，测定，用外标两点法对数方程计算含量；

色谱条件:反相高效液相色谱仪－蒸发光散射检测器检测，流动相乙腈与水的体积比为53-58:45，色谱柱为Diamonsil C18（1）（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速为1．0 ml·Min-1，设置温度为90℃，气体流速设置为2.4L/min，柱温为35℃，理论板数以薯蓣皂苷峰计算应不低于4000；每粒龙加通络胶囊含穿山龙按薯蓣皂苷（C₂₇H₄₂O₃）计不得少于3mg。

2.权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于所述的超声处理指的是：功率120W，频率40KHz，30分钟。