CN107422050B - 一种同时检测小儿地锦止泻颗粒中五种成分含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时检测小儿地锦止泻颗粒中五种成分含量的方法，所述五种成分为没食子酸、黄芩苷、葛根素、和厚朴酚、厚朴酚，该方法包括将待测样品用水超声提取，提取液用非极性有机溶剂萃取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤。本发明能同时检测出小儿地锦止泻颗粒中五种物质的含量，所采用的色谱条件分离效果好，出峰时间短，检测结果重现性好，准确度高，采用该方法使小儿地锦止泻颗粒的质量更加可控。

Description

一种同时检测小儿地锦止泻颗粒中五种成分含量的方法
技术领域
本发明涉及小儿地锦止泻颗粒的含量测定方法，属于药物分析领域。
背景技术
CN 102145131 A公开了一种治疗腹泻的中药，它由地锦草、黄芩、葛根、厚朴、茯苓、麦芽六味中药材制成，该中药源自《伤寒论》中的葛根芩莲汤，用于治疗小儿腹泻，目前已经获得国家食品药品监督管理局颁发的新药临床研究批件，属于六类中药新药。
目前对该中药的质量控制主要是通过检测没食子酸的含量，没有对其它成分进行检测，难以严格地控制产品质量。申请人在研究中发现，小儿地锦止泻颗粒中除了含有没食子酸，还含有黄芩苷、葛根素、和厚朴酚、厚朴酚等多种成分，这些成分中很多是药效活性成分，如果能严格控制这些成分的含量，将有利于提高产品质量，进而提高药效。
所述五种成分的化学结构式如下：
Figure BDA0001284901650000011
发明内容
本发明的目的是针对小儿地锦止泻颗粒含量测定指标单一的缺陷，提供一种同时检测没食子酸、葛根素、黄芩苷、和厚朴酚、厚朴酚五种成分含量的方法。
该方法包括将待测样品用水超声提取，提取液用非极性有机溶剂萃取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为250～280nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为0.1～0.5％磷酸水溶液和含0.1～1％环己烷的甲醇溶液的混合液，采用梯度洗脱，柱温为25～35℃，理论板数按没食子酸峰计不低于5000。
所述小儿地锦止泻颗粒记载于CN 102145131 A的专利文献中，它由以下重量份数的中药材制成：
地锦草 20-50份 黄芩 6-18份 葛根 6-18份
厚朴 5-12份 茯苓 5-12份 麦芽 5-12份。
优选地，所述非极性有机溶剂为氯仿。
优选地，所述紫外检测器的设定检测波长为260nm。
优选地，所述流动相为0.1％磷酸水溶液和含0.1％环己烷的甲醇溶液的混合液。
优选地，所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中磷酸水溶液的体积比分别为：0～5min，磷酸水溶液90％；5～15min，磷酸水溶液90～82％；15～30min，磷酸水溶液82～68％；30～37min，磷酸水溶液68～59％；37～50min，磷酸水溶液59～20％；50～62min，磷酸水溶液20％。
优选地，所述柱温为28℃。
本发明的有益效果是：采用本发明提供的方法能同时检测出小儿地锦止泻颗粒中五种物质的含量，检测效率高，速度快，费用低，所采用的色谱条件分离效果好，出峰时间短，检测结果重现性好，准确度高。采用该方法使小儿地锦止泻颗粒的质量更加可控。
附图说明
图1是样品制备方法考察中采用70％乙醇提取得到的高效液相色谱图。
图2是样品制备方法考察中采用水提氯仿萃取得到的高效液相色谱图。
图3是采用250nm检测波长得到的高效液相色谱图。
图4是采用260nm检测波长得到的高效液相色谱图。
图5是采用271nm检测波长得到的高效液相色谱图。
图6是流动相A为0.5％磷酸水溶液、B为甲醇得到的高效液相色谱图。
图7是流动相A为0.1％磷酸水溶液、B为甲醇得到的高效液相色谱图。
图8是流动相A为0.1％磷酸水溶液、B为甲醇(含0.1％环己烷)得到的高效液相色谱图。
图9是流动相A为0.1％磷酸水溶液、B为甲醇(含1％环己烷)得到的高效液相色谱图。
图10是实施例4中流动相梯度洗脱条件为(1)时得到的高效液相色谱图。
图11是实施例4中流动相梯度洗脱条件为(2)时得到的高效液相色谱图。
图12是实施例4中流动相梯度洗脱条件为(3)时得到的高效液相色谱图。
图13是28℃柱温的高效液相色谱图。
图14是35℃柱温的高效液相色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细地说明。各实施例中的试验对象小儿地锦止泻颗粒均按CN 102145131 A中的实施例1制备，由健民药业集团股份有限公司提供。
实施例1样品制备方法的选择
样品溶液制备方法：1.取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约1.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入70％(重量浓度)乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用70％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10ml于25ml量瓶中，用甲醇定容，即得。
2.取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约1.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10ml，用氯仿萃取三次，每次20ml，弃去氯仿层，水层转移至25ml量瓶中，并用甲醇定容，即得。
仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、M8301AA色谱工作站)
流动相：0.1％(重量)磷酸水溶液为流动相A：含0.1％(重量)环己烷的甲醇溶液为流动相B
梯度洗脱条件：
Figure BDA0001284901650000041
柱温：28℃；检测波长：260nm；进样量：10ul
结果：如图1和图2所示，经水提氯仿萃取，与70％乙醇提取相比，能明显减少杂质，如46min，47min处，且7min处目标峰更好，故优选水提氯仿萃取。
实施例2波长的选择
样品溶液制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约1.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10ml，用氯仿提取三次，每次20ml，弃去氯仿层，水层转移至25ml量瓶中，并用甲醇定容，即得。
检测波长：250nm、260nm、271nm
其它条件与实施例1相同。
结果：从图3﹑图4﹑图5可看出，波长为250nm时，基线漂移明显；波长为260nm时，除42min处目标峰外，其它各物质色谱峰响应较271nm大(等吸收线图中，260nm比271nm各物质色谱峰颜色更深，表示吸收更强)，所显示的各物质色谱峰比271nm下色谱峰多2个，故260nm是最合适检测波长。
实施例3流动相的选择
(1)A为0.5％磷酸水溶液：B为甲醇
(2)A为0.1％磷酸水溶液：B为甲醇
(3)A为0.1％磷酸水溶液：B为甲醇(含0.1％环己烷)
(4)A为0.1％磷酸水溶液：B为甲醇(含1％环己烷)
检测波长：260nm
其它条件与实施例1相同。
结果：由图6～9可看出，图6中26min处色谱峰分离效果不好，未完全分开；图7中29min和43min处未完全分开。图9则流动相完全不合适，无法分开各物质。图8，以0.1％磷酸溶液﹑甲醇(含0.1％环己烷)为流动相，峰型和分离度最好。
实施例4流动相梯度洗脱条件选择
流动相：0.1％磷酸水溶液为流动相A：甲醇(含0.1％环己烷)为流动相B
柱温：28℃；检测波长：260nm；进样量：10ul
梯度洗脱条件：
Figure BDA0001284901650000051
Figure BDA0001284901650000061
(2)
Figure BDA0001284901650000062
(3)
Figure BDA0001284901650000063
结果：如图10～12所示，图11中，出峰时间过快，7min﹑15min﹑29min处目标峰均未完全分离；图12中26min处峰型不好，不能判断是否完全分离，图10较好，故梯度洗脱条件选择(1)。
实施例5柱温的选择
流动相：0.1％磷酸水溶液为流动相A：甲醇(含0.1％环己烷)为流动相B
柱温：28℃﹑35℃
其它条件与实施例1相同。
结果：如图13﹑14所示，柱温35℃时，出峰时间有一定的缩短，在42min处，分离效果变差；且与图13相比，柱温提高，杂峰变多，如54min处，故优选28℃。
实施例6方法验证
1.五种物质的定位与***适应性试验
(1)试验方法
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，混匀，取适量，研细，取约1.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10ml，用氯仿提取三次，每次20ml，弃去氯仿层，水层转移至25ml量瓶中，并用甲醇定容，即得。
仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、M8301AA色谱工作站)
流动相：0.1％磷酸水溶液为流动相A：甲醇(含0.1％环己烷)为流动相B；
梯度洗脱条件：
Figure BDA0001284901650000071
柱温：28℃
检测波长：260nm
进样量：10ul
(2)计算方法：
Figure BDA0001284901650000081
Ci对为各特定物质对照品溶液的浓度(mg/ml)
Ai对为各特定物质对照品溶液的峰面积
Ai样为各特定物质峰面积
W样为样品称样量(g)
(3)分析方法验证
对照品溶液的配制：分别精密称取没食子酸、葛根素、黄芩苷、和厚朴酚、厚朴酚的标准品适量，配成每1ml分别含没食子酸、葛根素、黄芩苷、和厚朴酚、厚朴酚各15ug、60ug、40ug、13ug、20ug的混合溶液。
供试品溶液的配制及测定方法：按上述实施案例中确立的样品制备方法及液相色谱条件进样测定。
测定结果见表1。
表1五种物质的定位与***适应性试验结果表
物质名称 对应的峰 保留时间 相对保留时间 分离度
没食子酸 1峰 7.377 - 5.89
葛根素 3峰 28.967 0.18 1.87
黄芩苷 9峰 42.365 0.31 1.26
和厚朴酚 18峰 51.867 0.42 3.72
厚朴酚 19峰 53.344 0.53 2.91
2.线性
在定量限浓度至不高于150％指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，由相关系数R2证实良好的线性关系，要求该线性回归系数R2的数值应不小于0.990，结果见表2。
表2五种物质的标准曲线、相关系数及校正因子
物质名称 标准曲线 相关系数 校正因子
没食子酸 Y＝3.0261x-0.7541 R<sup>2</sup>＝0.9992 0.91
葛根素 Y＝3.8704x+0.0891 R<sup>2</sup>＝0.9986 0.78
黄芩苷 Y＝4.5051x-2.7588 R<sup>2</sup>＝0.9996 0.96
和厚朴酚 Y＝6.7253x-3.8956 R<sup>2</sup>＝0.9981 1.00
厚朴酚 Y＝5.8965x-4.0967 R<sup>2</sup>＝0.9987 0.95
3.重复性
配制6个相同浓度的样品溶液并进行测试，每个溶液进样1针，要求6次含量测定结果的相对标准差应不大于2.0％，结果见表3。
表3五种物质含量测定的重复性试验结果
样品 没食子酸 葛根素 黄芩苷 和厚朴酚 厚朴酚
RSD 1.32％ 1.21％ 1.98％ 1.83％ 1.47％
结果表明：各成分的RSD值在要求范围内，表明检测方法的重复性结果良好。
4.准确度
通过加入已知量的各组分，再测定加样样品中已知组分的测定结果和理论值的比值，从而计算出回收率，以百分率％表达，要求回收率在95.0％-105.0％之间，结果见表4。
表4五种物质的回收率测定结果
样品 没食子酸 葛根素 黄芩苷 和厚朴酚 厚朴酚
平均回收率 98.51％ 99.42％ 97.72％ 99.01％ 100.24％
结果表明：该方法测定各物质的准确度良好。
实施例7样品测定
(1)供试品溶液的制备：取装量差异项下的小儿地锦止泻颗粒，混匀，取适量，研细，取约1.5g，精密称定，置50ml具塞锥形瓶中，精密加入50ml水，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率33kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用水补足减失的重量，摇匀，滤过，精密取续滤液10ml，用氯仿提取三次，每次20ml，弃去氯仿层，水层转移至25ml量瓶中，并用甲醇定容，即得。
(2)对照品溶液的制备：分别精密称取没食子酸、葛根素、黄芩苷、和厚朴酚、厚朴酚的标准品适量，配成每1ml分别含没食子酸、葛根素、黄芩苷、和厚朴酚、厚朴酚各15ug、60ug、40ug、13ug、20ug的混合溶液。
(3)色谱条件与***适应性：仪器：Agilent1260型高效液相色谱仪系列(美国安捷伦科技公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器、M8301AA色谱工作站)
流动相：0.1％磷酸水溶液(A)：甲醇(含0.1％环己烷)(B)
梯度洗脱条件：
Figure BDA0001284901650000101
柱温：28℃
检测波长：260nm
进样量：10ul
(4)测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，测定。
(5)计算公式：见实施例6中(2)。
(6)结果：所测得的各物质的含量见表5。
表5 6批样品中五种物质的含量
批次 没食子酸 葛根素 黄芩苷 厚朴酚 和厚朴酚
160701 0.253％ 0.421％ 0.884％ 0.017％ 0.008％
160301 0.255％ 0.402％ 0.871％ 0.016％ 0.007％
150902 0.262％ 0.413％ 0.910％ 0.013％ 0.004％
150901 0.266％ 0.444％ 0.908％ 0.010％ 0.006％
150601 0.255％ 0.462％ 0.895％ 0.013％ 0.005％
150201 0.267％ 0.453％ 0.878％ 0.009％ 0.006％

Claims (2)

1.一种同时检测小儿地锦止泻颗粒中五种成分含量的方法，所述小儿地锦止泻颗粒由以下重量份数的中药材制成：
Figure FDA0002360544970000011
其特征在于：所述五种成分为没食子酸、黄芩苷、葛根素、和厚朴酚、厚朴酚，该方法包括将待测样品用水超声提取，提取液用氯仿萃取后上高效液相色谱仪进行检测的步骤，所述高效液相色谱仪含有紫外检测器，所述紫外检测器的设定检测波长为260nm，所述高效液相色谱仪的色谱柱为C18色谱柱，流动相为0.1％磷酸水溶液和含0.1％环己烷的甲醇溶液的混合液，采用梯度洗脱，柱温为25～35℃，理论板数按没食子酸峰计不低于5000，
所述梯度洗脱中，各时间段及流动相中0.1％磷酸水溶液的体积比分别为：0～5min，0.1％磷酸水溶液90％；5～15min，0.1％磷酸水溶液90→82％；15～30min，0.1％磷酸水溶液82→68％；30～37min，0.1％磷酸水溶液68→59％；37～50min，0.1％磷酸水溶液59→20％；50～62min，0.1％磷酸水溶液20％。
2.如权利要求1所述同时检测小儿地锦止泻颗粒中五种成分含量的方法，其特征在于：所述柱温为28℃。
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