CN115011630B - 番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性及培育耐旱番茄中的应用 - Google Patents

番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性及培育耐旱番茄中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于耐旱番茄的培育领域,具体涉及番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性及培育耐旱番茄中的应用。番茄SlGID1L2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;调控SlGID1L2基因过表达,提高番茄耐旱性。本发明首次验证了SlGID1L2基因在干旱响应调控方面的功能,对于抗旱番茄品种选育具有重要作用。

Description

番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性及培育耐旱番茄中的 应用
技术领域
本发明属于耐旱番茄的培育领域,具体涉及番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性及培育耐旱番茄中的应用。
背景技术
番茄(Solanum lycopersicum)是全球最重要的蔬菜作物之一。干旱是植物生长发育的重要制约因素。轻度干旱胁迫使植物气孔关闭、CO2吸收减少、光合作用降低、细胞壁弹性改变,随着干旱强度增加,进一步引起有毒代谢物产生和渗透胁迫加剧以致植物死亡。受到干旱胁迫后植物的水分状况发生变化,进而影响植物的生长,主要包括4个方面:营养物质吸收、光合作用、呼吸作用和氧化还原状态。
植物受到干旱胁迫后水分供应量减少,导致蒸腾速率降低,进而降低植物对营养物质的利用率、摄取量、转运和代谢,最终导致总营养吸收降低。研究表明,植物受到干旱胁迫后的光合作用降低,是作物减产的主要原因之一。一方面,植物受到干旱胁迫后,为了防止蒸腾导致的水分流失,气孔逐渐关闭,引起CO2吸收减少,随后净光合作用下降。另一方面,干旱胁迫后非气孔因素限制植物光合作用,当植物受到干旱胁后能量物质ATP和二磷酸核酮糖RuBP的含量降低,随着干旱胁迫程度增加,二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶RuBisCO羧化效率大大下降,严重影响植物光合作用。呼吸作用是植物的重要代谢过程,通过呼吸消耗碳水化合物产生CO2和H2O,为植物生长发育提供能量。然而干旱胁迫条件下交替呼吸增强,由于交替呼吸途径不需经过质子的跨膜转运因而只产生少量ATP,从而影响植物的生长和代谢过程。植物受到干旱胁迫后,活性氧清除机制受损,活性氧在植物体内积累,产生毒害作用。活性氧引起脂质过氧化,导致膜损伤、蛋白质降解和酶失活,引起氧化损伤并影响细胞的正常功能。
传统育种在耐旱性研究方面成功率极低,成本极高,周期漫长。由于育种过程的每一代都需要对耐旱性进行鉴定,需要特殊的设施或环境条件,而而且每个世代都不能用单株进行抗性鉴定,需要一个群体进行鉴定,所以周期比一般性状的常规育种周期长至少一倍。
创建番茄耐旱新材料,培育耐旱新品种,对保障番茄稳产和增产具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性方面的应用,进而可以提高番茄耐旱性。
本发明的第二个目的是提供番茄SlGID1L2基因在培育耐旱番茄中的应用。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是:
番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性方面的应用,番茄SlGID1L2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;调控SlGID1L2基因过表达,提高番茄耐旱性。
本发明首次验证了SlGID1L2基因在干旱响应调控方面的功能,对于抗旱番茄品种选育具有重要作用。
优选地,番茄的品种为Ailsa Craig。
番茄SlGID1L2基因在培育耐旱番茄中的应用,番茄SlGID1L2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;构建番茄SlGID1L2基因过表达的转基因番茄植株,提高番茄耐旱性。
实验证实,SlGID1L2基因过表达植株与对照相比,对照植株萎蔫程度加重。表明SlGID1L2基因参与番茄抗旱应答调控,具有抗旱调节功能。
优选地,通过农杆菌介导法构建所述转基因番茄植株。
进一步优选地,所述农杆菌介导法包括构建番茄SlGID1L2基因过表达的重组载体,利用所述重组载体转化农杆菌,所述重组载体的初始载体为pHellsgate8。
优选地,番茄的品种为Ailsa Craig。
附图说明
图1为SlGID1L2基因的组织表达谱;
图2为SlGID1L2基因在干旱胁迫后的表达情况;
图3为SlGID1L2基因在转基因番茄植株中表达量;
图4为SlGID1L2基因过表达植株与对照植株的耐旱性表现;
图5为SlGID1L2基因过表达植株与对照植株的番茄气孔数量对比;
图6为SlGID1L2基因过表达植株与对照植株的根系发育情况对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施过程进行详细说明。
实施例1番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性方面的应用
番茄SlGID1L2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示,该基因所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
1.1 SlGID1L2基因的组织表达谱
提取栽培种AC番茄根(RT)、茎(ST)、幼叶(YL)、成熟叶(ML)花(FL)、幼果(IM)、绿熟果(GM)、破色果(BR)、黄熟果(YR)和红熟果(RR)的RNA,反转录为cDNA,进行番茄各个组织相对表达量检测。
引物设计用Primer 3.0在线软件。参数设置:产物长度80bp~200bp,GC含量40%~60%,Tm值60℃~62℃,引物长度18bp~23bp。qRT-PCR反应按照试剂盒SYBR SelectMaster Mix(Applied Biosystems,Mardrid,CA,USA)进行,所使用的仪器为Bio-RadLaboratories;利用SYBR Green I荧光染料法对基因的相对表达差异进行分析,选用番茄的EF1a基因作为内参基因,每个样品设置3个试验重复,反应体系为
Figure BDA0003723583190000031
Green PCRMaster Mix 5μl,forward Primer 0.5μl Reverse Primer 0.5μl,cDNA 4μl。qRT-PCR反应程序为:预变性95℃5min;变性95℃20s;退火60℃30s,42次循环;融合曲线95℃10s,65℃1min;冷却40℃1s。
扩增SlGID1L2的qRT-PCR引物:
Fw:5’-GCCCTAGTCTTGGGATCAGC-3’(SEQ ID NO:3);
Rev:5’-ACCCATTGAAGAGCAGTCCA-3’(SEQ ID NO:4)。
扩增EF1a的qRT-PCR引物:
Fw:5’-TGCTGTTCTCATTATTGACTCCAC-3’(SEQ ID NO:5);
Rev:5’-CTTCCTTCACGATTTCATCATACC-3’(SEQ ID NO:6)
结果如图1所示。由图1可知,SlGID1L2基因在根中表达量最高,其次在花和破色期果实中,在幼果期表达量最低,推测SlGID1L2影响了根的发育。
1.2 SlGID1L2基因在干旱胁迫后的表达情况
番茄栽培种M82植株干旱处理后,分别在0h、1d、2d、3d、4d和5d取生长点,送生物公司进行转录组测序(数据来源于NCBI https://www.ncbi.nlm.nih.gov)及分析。
结果如图2所示。显示SlGID1L2在干旱胁迫后表达量先上升后下降。
1.3 SlGID1L2基因启动子顺式元件分析
利用PlantCARE网站对SlGID1L2基因ATG上游2kb的启动子序列进行顺式元件分析,结果如表1所示,按照其功能进行分类主要分为4类:胁迫响应、激素响应、光响应、组织特异性表达顺式元件。我们推测SlGID1L2基因可能参与植物胁迫响应调控。
表1 SlGID1L2基因启动子顺式元件分析
Figure BDA0003723583190000032
Figure BDA0003723583190000041
实施例2番茄SlGID1L2基因在在培育耐旱番茄中的应用
本实施例番茄SlGID1L2基因在在培育耐旱番茄中的应用,具体过程说明如下:
(1)番茄SlGID1L2基因的克隆
1.1材料
以番茄栽培种Ailsa Craig为试材。将番茄种子播于光照培养室,进行普通栽培管理,取4周大的植株成熟叶片于液氮中速冻,存于-80℃冰箱保存,备用。
1.2总RNA提取与cDNA合成
1.2.1总RNA的提取
RNA提取用TRIZOL法。取样品100mg,液态N2中磨碎,加入1ml TRIZOL迅速颠倒混匀,抽提几分钟后,加200μl氯仿,充分抽提15s,室温下放置3min,12000rpm 2℃~8℃离心10min,吸取上清液200μl转移到1.5ml干净的RNAase-free离心管,加入400μl冰冷的异丙醇,颠倒混匀,-20℃冰箱放置20min,12000rpm 2℃~8℃离心10min,小心吸弃上清,得胶体状RNA,加1ml 75%乙醇,涡旋混匀,室温放置10min后,5000rpm 2℃~8℃离心5min,弃上清,使胶状体风干(注意不要过于干燥,否则RNA难于溶解),加20μl~30μl Diethylpyrocarbonate(DEPC)水溶解。
1%琼脂糖电泳检测RNA质量。电泳槽用10%NaOH溶液浸泡6-7h,制胶浓度1%,加适量溴粉蓝,上样1μl,130V电压(电压不可太低),跑胶约10min。紫外照胶仪照胶。
1.2.2 cDNA第一链的合成
以1ug番茄叶片RNA为模板,反转录用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(康为世纪)。首先去除DNA,体系包括3μl RNA,1μl 10×buffer,1μl DNAase I,1μl DEPC水;37℃30min。加入1μl EDTA,65℃10min终止酶的反应。以此为模板进行下一步反应,体系如下表2所示。
表2 cDNA第一链的合成体系
Figure BDA0003723583190000051
1.3番茄SlGID1L2基因的克隆
以番茄Ailsa Craig的cDNA为模板,扩增基因SlGID1L2(基因ID:Solyc04g005230)的编码序列,在SGN数据库(https://solgenomics.net/)中下载该基因的cDNA序列,利用Primer 5.0设计引物。正向引物:5'-TCATTGTGAGCTAGGGTT-3'(SEQ ID NO:7)反向引物:5'-GACTCACTTGCTTTGGAT-3'(SEQ ID NO:8)设计好的引物前面加上同源重组接头,正向引物前加5'-CATTTGGAGAGGACACGCTCGAG-3'(SEQ ID NO:9),反向引物前加5'-TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGA-3'(SEQ ID NO:10),以番茄(Alisa Craig)叶片cDNA为模板,利用KOD Plus高保真DNA聚合酶通过PCR扩增,获得番茄SlGID1L2基因全长。
PCR扩增反应体系:1U/ul KOD Plus(TOYOBO)0.5ul,10XBuffer for KOD Plus2.5ul,2mM dNTPs 2.5ul,25mM MgSO4 1.5ul,10uM正、反向引物各0.75ul,模板50ng,灭菌蒸馏水补足至总体积25ul。PCR扩增程序:94℃2min,94℃15sec,55℃30sec,68℃1min,共35个循环,68℃5min。
(2)超量表达载体构建及遗传转化
2.1载体构建
用XbaⅠ和XhoⅠ限制性内切酶对pHellsgate8超量载体进行双酶切反应,将酶切载体与目的基因进行酶连反应,37℃,反应30min。将酶连产物加入DH5α感受态中,冰置30min后,在金属浴上42℃热激45s,转至冰上静止3min。向离心管中添加600μL不含抗生素的LB培养;37℃摇床复壮45min,用无菌涂布棒将100-200μL菌液均匀涂布于LB固体培养基上(LB+100mg/L Spec),在37℃培养箱进行培养12-18h,即可观察到白色的独立单菌落。
挑取单菌落于500ul LB液体培养基中(LB+100mg/L Spec)培养8h后,进行PCR阳性检测。将阳性单克隆菌液送上海生工公司测序。序列比对结果正确,载体构建成功,将载体命名为SlGID1L2-pHellsgate8,菌液保存备用。
2.2农杆菌转化
将构建好的过表达载体SlGID1L2-pHellsgate8转化农杆菌。将电转杯清洗干净备用,将30ul农杆菌感受态细胞之于冰上融化,加入1ul构建好的重组质粒SlGID1L2-pHellsgate8,轻弹混匀,转移至电转杯的底部。将电转杯放在电转仪的座上,点击,迅速加入0.6ml不含抗生素的LB液体培养基至电转杯中,轻柔吸打悬浮细胞。将细胞吸出至1.5ml灭菌离心管中,28℃培养36-48h。
PCR鉴定筛选阳性菌,PCR鉴定所用的引物为:
正向引物:5'-ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3'(SEQ ID NO:11);
反向引物:5'-GACTCACTTGCTTTGGAT-3'(SEQ ID NO:8)。
结果获得了约1200bp的目的片段的阳性农杆菌克隆。
2.3番茄遗传转化
将构建好的载体,用农杆菌介导法转入番茄。种子消毒后播于1/2MS固体培养基上,于光照培养室培养,培养条件16h光照/8h黑暗,恒温26℃。
将含有目的载体的阳性农杆菌接种于含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基(Kan:100ug/mL;Rif:50ug/mL)中,28℃振荡培养过夜至OD600=1.5。3000rpm室温离心5min,收集菌体。用0.2MS液体培养基悬浮菌体。以1周大的番茄子叶为外植体,黑暗条件下侵染2min,倒掉菌液,用滤纸吸干残留的菌液,将叶片放到预培养基上暗培养2天后转入筛选培养基培养,10天-20天后诱导形成愈伤组织。转入再分化培养基上诱导形成不定芽,当不定芽长超过1cm,即可切下于生根培养基中培养。当转基因苗长至适宜大小,进行移栽、定植。
(3)转基因番茄植株的阳性及表达量检测
以转基因番茄植株嫩叶DNA为模板,扩增SlGID1L2基因目的片段,扩增引物如SEQID NO:11和SEQ ID NO:8所示,获得T0代转基因阳性植株。
鉴定出20颗阳性植株,进一步对转基因株系中SlGID1L2基因的表达情况进行检测。qRT-PCR反应按照试剂盒SYBR Select Master Mix(Applied Biosystems,Mardrid,CA,USA)进行,所使用的仪器为Bio-Rad Laboratories;利用SYBR Green I荧光染料法对基因的相对表达差异进行分析,选用番茄的EF1a基因作为内参基因,每个样品设置3个试验重复,反应体系为
Figure BDA0003723583190000061
Green PCR Master Mix 5μl,forward Primer 0.5μl ReversePrimer 0.5μl,cDNA 4μl。qRT-PCR反应程序为:预变性95℃5min;变性95℃20s;退火60℃30s,42次循环;融合曲线95℃10s,65℃1min;冷却40℃1s。
扩增SlGID1L2的qRT-PCR引物:
Fw:5’-GCCCTAGTCTTGGGATCAGC-3’(SEQ ID NO:3);
Rev:5’-ACCCATTGAAGAGCAGTCCA-3’(SEQ ID NO:4)。
扩增EF1a的qRT-PCR引物:
Fw:5’-TGCTGTTCTCATTATTGACTCCAC-3’(SEQ ID NO:5);
Rev:5’-CTTCCTTCACGATTTCATCATACC-3’(SEQ ID NO:6)。
qRT-PCR反应结束后,进行数据的处理及分析。
结果如图3所示。结果显示与对照相比,转基因株系OE1,OE2,OE9中SlGID1L2的表达量显著上调,说明SlGID1L2超量表达***构建成功。
(4)SlGID1L2超量表达植株耐旱性提高
对番茄SlGID1L2-OE基因过表达株系和野生型番茄Ailsa Craig进行干旱胁迫处理实验。种植在人工气候室25℃、16h光照/8h黑暗条件下光照培养5周苗龄,两个材料各挑取长势一致30棵材料,分为两组(对照组和干旱处理组),一组(15棵SlGID1L2-OE株系和15棵Ailsa Craig)作为对照正常浇水,另外一组进行干旱处理,一周后观察其表型并进行拍照记录,在干旱处理的第11天复水,结果如图4所示。
实验结果表明:SlGID1L2基因过表达植株与对照相比,对照植株萎蔫程度加重。在干旱处理的第6天,对照组番茄开始萎蔫,而转基因植株仍然坚挺;转基因植株在干旱处理的第8天出现叶片萎蔫。复水后,对照组植株出现死亡以及叶片大面积病变坏死的情况,而转基因植株完全恢复,仅有小面积叶片枯萎干死。这表明SlGID1L2基因参与番茄抗旱应答调控,具有抗旱调节功能。
(5)SlGID1L2-OE过表达和野生番茄气孔数量、根系发育情况
水分可以通过气孔的蒸腾作用流失,气孔的开度也会直接影响水分流失。所以我们比较了转基因与对照番茄第三片叶片的气孔密度和气孔孔径。通过显微镜观察SlGID1L2-OE过表达和野生番茄(均对应图4复水后),结果如图5所示。
结果显示,转基因株系单位面积的气孔数量为49个左右,对照组为40.5个左右,这表明正常处理下,对照与SlGID1L2-OE过表达番茄植株单位面积气孔数量无明显差异。
统计SlGID1L2-OE过表达和野生番茄(均对应图4复水后)的根系发育情况,结果如图6所示。
结果显示,在根系扫描仪下我们可以观察到,三颗对照组的根部发育弱于转基因植株。我们对扫描后的数据分析后发现与对照相比,SlGID1L2-OE过表达植株根系的总根长、根系总体积、根尖数、总表面积升高,即干旱胁迫下,SlGID1L2促进了番茄根的发育。
以上结果表明,SlGID1L2基因过表达能显著提高番茄抗旱性,可制备抗旱番茄材料。
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<221> SlGID1L2基因
<400> 1
atggctagtg aagacaatga aattgtttct gatttctatc cccattttcg aatctataaa 60
aatggacgcg ttgaacgttt ttatcattta caaaattgtt tttacgttcc accaacacat 120
gaaccagatt ctgacacagg tgtctcctct aaagatgttg caatcaactc tcatgtttca 180
gctaggctct ttttaccaaa tgttacaatt aacacaaata aaaaactccc aattattgta 240
ttttaccatg gtggagccct agtcttggga tcagcattct tcaacaaggt ttatcgtttc 300
cttaatcttc ttgtgtctga atcaaactca atagccgtag ctgttgatta caggttaacc 360
ccagaacatg atgtgtctac tgtgtatgaa gattgttgga ctgctcttca atgggttgct 420
agtagccaag attcatggct aacaagtcat ggtgattttg gtaaggtgtt tttgttggga 480
gaaagtgccg gagccaatat tgctttcaac atgataatca gagcagacag agaaaaatta 540
aatggtgatg tgaaaataaa tggtttaatt cttgcttgtc cttatttctt gatcccacat 600
gaaaatattg atgtggagaa tttgcttgct tacaaggcat ggagagagat tatttgtcca 660
aacttagaat ccccttttga ttgtccaatg attaatccac tttgtaaaac aagtcctaac 720
ttatcaaagc tagtatgttc aaaattattt gtgtgtttgg ctgagaaaga tgaattgatt 780
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<212> PRT
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<221> SlGID1L2蛋白
<400> 2
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Glu Ser Ala Gly Ala Asn Ile Ala Phe Asn Met Ile Ile Arg Ala Asp
165 170 175
Arg Glu Lys Leu Asn Gly Asp Val Lys Ile Asn Gly Leu Ile Leu Ala
180 185 190
Cys Pro Tyr Phe Leu Ile Pro His Glu Asn Ile Asp Val Glu Asn Leu
195 200 205
Leu Ala Tyr Lys Ala Trp Arg Glu Ile Ile Cys Pro Asn Leu Glu Ser
210 215 220
Pro Phe Asp Cys Pro Met Ile Asn Pro Leu Cys Lys Thr Ser Pro Asn
225 230 235 240
Leu Ser Lys Leu Val Cys Ser Lys Leu Phe Val Cys Leu Ala Glu Lys
245 250 255
Asp Glu Leu Ile Pro Val Glu Met Leu Met Gln Phe Val Asp Ser Val
260 265 270
Lys Lys Ser Gly Trp Asn Gly Gln Phe Val Leu His Val Val Glu Gly
275 280 285
Glu Gly His Cys Phe Leu Ile Asp Asn Leu Glu Thr Glu Lys Ala Arg
290 295 300
Asp Ser Ile Lys Arg Phe Ala Ser Phe Ile Gln Ser Lys
305 310 315
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 扩增SlGID1L2的qRT-PCR引物Fw
<400> 3
gccctagtct tgggatcagc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 扩增SlGID1L2的qRT-PCR引物Rev
<400> 4
acccattgaa gagcagtcca 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 扩增EF1a的qRT-PCR引物Fw
<400> 5
tgctgttctc attattgact ccac 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 扩增EF1a的qRT-PCR引物Rev
<400> 6
cttccttcac gatttcatca tacc 24
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SlGID1L2基因克隆正向引物
<400> 7
tcattgtgag ctagggtt 18
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> SlGID1L2基因克隆反向引物
<400> 8
gactcacttg ctttggat 18
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 正向引物同源重组接头
<400> 9
catttggaga ggacacgctc gag 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 反向引物同源重组接头
<400> 10
tctcattaaa gcaggactct aga 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> 阳性农杆菌鉴定正向引物
<400> 11
acgcacaatc ccactatcct tc 22

Claims (6)

1.番茄SlGID1L2基因在调控番茄耐旱性方面的应用,其特征在于,番茄SlGID1L2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;调控SlGID1L2基因过表达,提高番茄耐旱性。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,番茄的品种为Ailsa Craig。
3.番茄SlGID1L2基因在培育耐旱番茄中的应用,其特征在于,番茄SlGID1L2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;构建番茄SlGID1L2基因过表达的转基因番茄植株,提高番茄耐旱性。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,通过农杆菌介导法构建所述转基因番茄植株。
5.如权利要求4所述的应用,其特征在于,所述农杆菌介导法包括构建番茄SlGID1L2基因过表达的重组载体,利用所述重组载体转化农杆菌,所述重组载体的初始载体为pHellsgate8。
6.如权利要求3~5中任一项所述的应用,其特征在于,番茄的品种为Ailsa Craig。
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