CN115807010B - 忍冬叶片腺毛发育基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了忍冬叶片腺毛发育基因及其应用，属于基因工程技术领域。本发明提供的LjMYB16基因，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因能够调控忍冬多细胞腺毛发育，增加忍冬表面腺毛密度，继而增加次生代谢产物的含量，从而对药用作物种质资源创新提供支撑，为后续代谢工程提供基因资源。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及忍冬叶片腺毛发育基因及其应用。
背景技术
忍冬为富含腺毛的植物，是中国传统的中药材，应用广泛。其花称为金银花，枝条称为忍冬藤，在治疗感冒、头痛、发烧和皮疹方面具有良好的疗效(Wang et al,2020；Shanget al,2011)，对流感病毒亦具有良好的抑制效果，在新冠及非典时期都发挥了重要的作用。忍冬的主要活性成分为绿原酸和木樨草苷，而腺毛中检测到了这两种成分的存在(段慧芳.热毒宁注射液原料药金银花的生产质量标准研究[D].南京中医药大学,2020.)，这说明，腺毛的数量与忍冬的药用品质有着一定的关系。
近年来随着腺毛及其分泌物质研究的深入，关于腺毛发育的分子机制研究也获得了一些进展。主要围绕番茄、黄花蒿等植物腺毛的起始和形态发生进行。研究表明，番茄和黄花蒿中调控腺毛起始的基因大都归属于R2R3-MYB和HD-ZIP IV这两个亚家族(Chalvinet al.2009)。SlMX1作为R2R3-MYB家族的一员，在番茄中过表达SlMX1会使腺毛的密度增加(Ewas et al.2016)。SlWo可以调控番茄I型腺毛的密度，SlWo表达被抑制之后，I型腺毛的密度明显减少，而SlWo的过量表达则显著增加了I型腺毛的密度，在烟草中过量表达SlWo时，也会显著增加烟草叶片表面腺毛的密度(Yang,Li et al.2011)。在黄花蒿中，过表达AaHD1或AaHD8可以显著提高腺毛的密度(Yan et al.2016)。过量表达AaMYB1亦可以提高腺毛密度，且GC-MS实验结果表明青蒿素的含量也显著提高(Soetaert S et al.)，过表达或敲除AaMIXTA1，分别导致转基因黄花蒿植株叶片腺毛数量和青蒿素含量的增加或减少(Shiet al.2018)。这些研究结果均说明可以通过提高腺毛的密度来提高药用成分的含量。
本发明以忍冬茎叶为实验材料，对其腺毛MYB家族中可能的调控基因进行研究分析，旨在挖掘忍冬叶片腺毛发育基因，以及为腺毛发育的分子调控机制研究提供进一步的依据，为忍冬药学质量的提高奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调控忍冬多细胞腺毛发育的基因，将其转化到忍冬植株体内，以此增加忍冬表面腺毛密度，继而增加次生代谢产物的含量，从而对药用作物种质资源创新提供支撑，为后续代谢工程提供基因资源。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种忍冬叶片腺毛发育基因LjMYB16，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因被证明能够调控忍冬多细胞腺毛发育，增加忍冬表面腺毛密度。
本发明提供了扩增上述LjMYB16基因的引物组，其核酸序列如SEQ ID NO:2和SEQIDNO:3所示。
本发明提供了上述LjMYB16基因在调控忍冬腺毛发育中的应用。
本发明还提供了含有上述LjMYB16基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。
一种提高忍冬表面腺毛密度的方法，是将上述LjMYB16基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化至忍冬体内，并最终通过LjMYB16基因的过表达，调控忍冬腺毛发育，提高忍冬表面腺毛密度。通过该方法可最终获得表面腺毛密度大于野生型的转基因忍冬。
上述重组表达载体，除了包含有LjMYB16基因外，还包含有如下克隆载体，但不局限于如下载体：双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体；例如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等；
上述重组表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能；
使用上述LjMYB16基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)、组成型启动子；或组织特异表达启动子，如种子特异表达的启动子；或诱导型启动子；它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；
此外，使用上述LjMYB16基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；
上述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的；翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等选择性标记基因)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。如果从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。
携带有本发明LjMYB16基因的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
上述农杆菌可选自根癌农杆菌(例如GV3101、LBA4404以及EHA105)、发根农杆菌等。
本发明的有益效果为：
本发明提供的LjMYB16基因，能够调控忍冬多细胞腺毛发育，增加忍冬表面腺毛密度，继而增加次生代谢产物的含量，从而对药用作物种质资源创新提供支撑，为后续代谢工程提供基因资源。
附图说明
图1为忍冬叶中腺毛发育相关基因的相对表达量，从左至右依次为第一对叶、第二对叶、第三对叶、第四对叶；
图2为忍冬茎中腺毛发育相关基因的相对表达量，从左至右依次为第一对茎、第二对茎、第三对茎；
图3为忍冬花中腺毛发育相关基因的相对表达量，从左至右依次为小幼蕾期、幼蕾期、三青期、大白期、银期；
图4为转基因烟草叶片在培养基上的生长状况；其中，A图为在分化诱导培养基上生长25d左右的烟草叶片；B图为在芽增殖培养基上生长25d左右的烟草叶片；C图为接种到生根培养基上的抗性芽；D图为接种到生根培养基上生长25d的抗性芽；
图5为转基因烟草的qRT-PCR分析结果；
图6为转基因烟草叶片表型观察结果；其中，A图为Super1300空载体过表达的转基因烟草，B图为Super1300-LjMYB16过表达的转基因烟草；
图7为转基因烟草叶片腺毛密度结果；
图8为qRT-PCR分析基因沉默后忍冬嫩叶基因相对表达水平；
图9为VIGS沉默相关基因后忍冬叶片的表型观察；其中，A图为未进行基因沉默的表型，B图为进行了基因沉默后的表型；
图10为VIGS沉默处理后忍冬叶片表面的腺毛密度。
具体实施方式
本发明所用试验材料，如下：
大肠杆菌DH5α由青岛农业大学植物发育与遗传实验室保存；根癌农杆菌菌株EHA105购自北京天恩泽基因科技有限公司；转基因的受体材料为烟草野生型品种，由青岛农业大学植物发育与遗传研究室实验室提供。
本发明所使用的其它术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
腺毛发育基因的初步鉴定，如下：
1、调控忍冬多细胞腺毛发育的相关基因的克隆
以忍冬的基因组DNA为模板，采用引物P1、P2扩增调控忍冬多细胞腺毛发育的相关基因，将其命名为LjMYB16。
LjMYB16基因序列：
5'-ATGGGGAGATCTCCATGCTGTGACAAAGTGGGCTTAAAGAAAGGGCCATGGACC CCTGAAGAAGATCACAAACTCTTAGCCTACATCGAAGAACACGGCCATGGCAGCTGGCGCGCCTTGCCCTCTAGAGCTGGTCTTCAAAGATGTGGAAAGAGTTGTAGACTGAGGTGGACTAATTACCTTAGACCTGATATTAAGAGAGGAAAGTTTAGTTTGCAAGAAGAACAAACCATCATTCAACTCCATGCTCTCTTAGGCAACAGGTGGTCGGCTATAGCCACTCACTTGCCCAAAAGAACAGACAATGAGATCAAGAACTACTGGAATACGCATCTTAAAAAAAGACTGGCCAAAATGGGGATTGACCCTCTTACCCACAAGCCCAAAAACGATGCTATCTTGTCATCGAGCAACGATGGTCAATCCAAGAATTCAGCAAACCTTAGCCACATGGCTCAGTGGGAAAGTGCCCGCCTCGAAGCCGAAGCAAGGTTGGTTAGGCAATCAAAGCTACGCGGTGGTTCAAATCCGCTCCCCCACCAGCTCGGCTCGCCAGAGTTTGCGCCCCCACTATGCCTCGACATACTAAAATCTTGGAATGGTTCGTGGAGTAATCCACCTGAAGCTAGGGGTAGAGGTGGTGGTCCGGTGGCACTGATTGGTGTTGACCTAGAGTCACCCACCTCTACCCTTAGCTACTCAGACAATGGGCCGCCAATCACTGCCACCAGGATGGGAGAAAGCTCCACGAATTTTATTGACTTCGTTAGCAATTCAGGTTCGTGCGAAGATGGGATGATGAAAGAAGAAGGTGAAGGAGATTGGAAGGGACTTGAAAAATACAATGACGAGCATGTTCCTAGTGGGAATTTTGTCGAGACGTTCACAGACCTTTTACTAAATAAATCTGGTGACCGGAGTTTCTCTGAGGATGGTGGAGAATCAGATGTTGGTGACGGCAGTGGACCCAGTATTGGCGGCGGCGGTGGTGATTACTACGAAGATAACAAGAATTACTGGAATAGCATTCTTAATTTGGTGAGTTCTTCACCTTCTGATTCGCCCGTGTTCTAA-3'(SEQ ID NO:1)
引物P1、P2的序列如下：
P1:5'-ATACACCAAATCGACTCTAGAATGGGGAGATCTCCATGCTGT-3'(SEQ ID NO:2)
P2:5'-GCCCTTGCTCACCATGGTACCTTAGAACACGGGCGAATCAGA-3'(SEQ ID
NO:3)
2、LjMYB16基因在忍冬不同部位的表达情况
分析基因表达量分别选择了茎、叶、花三个组织的不同时期：
从忍冬枝条顶端开始，分别取第一对叶、第二对叶、第三对叶和第四对叶，液氮速冻，-80℃保存。取忍冬枝条，从顶端向下分别取茎第一节、茎第二节、茎第三节，液氮速冻，-80℃保存。分别取北花一号、九丰一号小幼蕾期(0.1cm)、幼蕾期(0.5cm)、三青期(1.0cm)、大白期(3cm)、银期(5cm)花蕾，液氮速冻，-80℃保存。
RNA的提取均按照Accurate Biotechnology(Hunan)Co.,Ltd说明书进行。抽提后的总RNA用DNaseI处理，并进行纯化。
样品在ABI 7500FAST型荧光定量PCR仪上进行反应。20μL反应体系包括：10μL2×SybrGreen qPCR Master Mix，20μmol/L正反向引物各0.25μL，20ng反转录产物。扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。
LjMYB16基因定量PCR引物为：
正向引物：5'-AGAGTCACCCACCTCTACCC-3'(SEQ ID NO:4)
反向引物：5'-TTCGCACGAACCTGAATTGC-3'(SEQ ID NO:5)
内标基因Actin的正反向引物序列为：
正向引物：5'-CCCTAAAGCCAACAGAGAGAAG-3'(SEQ ID NO:6)
反向引物：5'-CGACCACTAGCATACAGAGAAAG-3'(SEQ ID NO:7)
表达结果如图1～图3所示：
LjMYB16基因相对表达量随着叶片的成熟而下降，与不同节的叶上腺毛数量的变化总体趋势相一致，如图1所示；LjMYB16基因相对表达量随着茎的成熟呈现先增加后减少的趋势，与不同节的茎上腺毛数量的变化总体趋势相一致，如图2所示；LjMYB16基因相对表达量随着花蕾的成熟在北花一号(BH)中呈现先增加后减少的趋势，在九丰一号(JF)中呈现递减趋势，如图3所示；初步表明，该基因与叶上腺毛发育呈正相关，因此极可能为腺毛发育的正调控基因。
实施例2
烟草转化试验，如下：
1、LjMYB16基因植物表达载体的构建
以忍冬叶片的基因组DNA为模板，以上述引物P1、P2为上下游引物进行扩增。在扩增时分别在上下游引物中加入KpnI和Xbal酶切位点。
回收PCR产物，并在T4 DNA连接酶作用下与克隆载体GFP(购自TaKaRa)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得抗氨苄青霉素的菌落。提取重组质粒，用KpnI和XbaI进行双酶切，回收含LjMYB16基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体Super1300的对应酶切位点中，获得该基因的植物表达载体Super1300-LjMYB16。
2、表达载体转化烟草
将41.67g MS固体溶于1000mL蒸馏水中，与吐温水、培养瓶、滤纸、牙签等一同放于115℃高压灭菌锅中灭菌15min。将混有900μL灭菌吐温水和100μL次氯酸钠的溶液放在无菌环境下，并加入放有本生烟种子的离心管中，在37℃振荡箱中，设置转速为200rpm，振荡1h；用灭过菌的吐温水将烟草种子冲洗2min，并进行6次冲洗；之后用灭过菌的蒸馏水将洗好的烟草种子洗到滤纸上，待其吹干后将烟草种子点在MS培养瓶中，每瓶点种3～4个，4℃冰箱暗处理3d，然后放入光照培养箱培养15d左右，待长出两片真叶后开始剪叶。
将培养瓶中的烟草叶片剪成6mm×6mm大小放在MS固体培养基上，培养1d。将-80℃保存的重组质粒Super1300-LjMYB16农杆菌和Super1300空载体农杆菌这两种类型的农杆菌扩摇，分别按1:15的比例将菌液加入50mL灭菌离心管中二次活化菌液至OD600为0.4-0.6。4000rpm离心5min后倒掉上清液，用等体积的MS+(100μM)AS液体培养基重悬至OD600为0.4-0.6备用。
将预配养的烟草放在加有侵染液的三角瓶中，侵染5～10min。将侵染好的叶片外植体接种在共培养固体培养基上，28℃倒置暗培养2～3d，直至叶片边缘出现白色的透明菌落。将共培养的外植体放入加有无菌水的三角瓶中，冲洗2～3次，放在吸水纸上吸去多余水分，平铺在烟草分化培养基上，每隔15d继代一次。外植体转化出抗性芽后，转入芽增殖培养基中继续培养。待抗性芽长到大约3～5cm时，剪下抗性芽并***生根培养基中培养。待生根完全后，取出小苗并洗去根上多余的培养基，移栽到土中，覆上保鲜膜，待1周后去掉保鲜膜。从分化诱导到抗性芽的获得，如图4所示。
3、转基因烟草的鉴定
将同时得到的Super1300空载体和Super1300-LjMYB16过表达植株(共三个生物学重复，即三个转基因株系)每盆各取100mg叶片提取DNA。DNA的提取方法参考Rapid PlantGenomic DNA Isolation Kit基因组提取试剂盒(生工生物)。将得到的转基因烟草的DNA各取1μL作为模板，用Super1300F/R为引物进行PCR扩增，扩增方法同菌落PCR鉴定方法相同。
引物序列如下所示：
F：5'-ACGACTTTTGAATAGATACGCTGAC-3'(SEQ ID NO:8)
R：5'-CCTTGAAGAAGATGGTGCG-3'(SEQ ID NO:9)
4、超表达Super1300-LjMYB16基因烟草的表达量分析
取鉴定条带正确的转基因烟草，以Super1300空载体烟草为对照，利用荧光定量PCR技术分析转LjMYB16基因烟草与Super1300空载体烟草的表达差异，以Actin F/R为内参，鉴定出基因表达量升高的转基因株系。
表达量分析结果如图5所示：
与空白对照相比，超表达基因的烟草叶片中LjMYB16基因的表达水平均有不同程度的大幅升高。
5、超表达LjMYB16基因烟草的表型观察
将Super1300空载体和Super1300-LjMYB16过表达的转基因烟草置于22℃、16h/8h光周期环境下生长，待T1代成熟后收取种子进行T2代培养，并对烟草叶片表型进行观察并统计腺毛分布和密度。
转基因烟草叶片表型观察如图6和图7所示：
转化有空载体的叶片叶缘处腺毛分布较稀疏(图6A)，而转基因烟草表面腺毛密度出现了较为明显的上升(图6B)，其上表面的腺毛密度为转化有空载体烟草的2.66倍(图7)。
实施例3
忍冬基因沉默试验，如下：
1、TRV2-LjMYB16载体的构建
根据网站[SGN-VIGS(solgenomics.net)]分析LjMYB16基因序列，设计相应的VIGS特异型片段，获得LjMYB16基因的特征序列，长度为300bp，如下所示：
5'-TCTTAAAAAAAGACTGGCCAAAATGGGGATTGACCCTCTTACCCACAAGCCCAAAAACGATGCTATCTTGTCATCGAGCAACGATGGTCAATCCAAGAATTCAGCAAACCTTAGCCACATGGCTCAGTGGGAAAGTGCCCGCCTCGAAGCCGAAGCAAGGTTGGTTAGGCAATCAAAGCTACGCGGTGGTTCAAATCCGCTCCCCCACCAGCTCGGCTCGCCAGAGTTTGCGCCCCCACTATGCCTCGACATACTAAAATCTTGGAATGGTTCGTGGAGTAATCCACCTGAAGCTAGGGG-3'(SEQ ID NO:10)
根据上述特征序列设计引物TRV2-LjMYB16 F/R，如下所示：
P3：5'-GTGAGTAAGGTTACCGAATTCTCTTAAAAAAAGACTGGCCAAAATG-3'(SEQ ID NO:11)
P4：5'-TCCCCATGGAGGCCTTCTAGACCCCTAGCTTCAGGTGGATTACT-3'(SEQ ID NO:12)
按照SteadyPure Plant RNA Extraction Kit说明书所示步骤，提取忍冬嫩叶RNA，于-80℃中保存RNA。
按照Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR试剂盒说明书所示步骤进行反转录，采用Prime STAR Max Premix高保真酶进行PCR扩增，反应体系如下：
按照Gel DNA Extraction试剂盒(Vazyme)说明书所示步骤进行胶回收。
采用QuickCut限制性核酸内切酶(TaKaRa，大连)酶切pBI121载体，酶切体系如下：
| 反应组分 | 体积(μL) |
| 质粒 | 7 |
| 10×Buffer | 1 |
| EcoR I | 1 |
| Xba I | 1 |
在37℃下反应15min后，于-20℃保存。
根据同源重组酶说明书计算重组连接反应体系中所需加入的目的片段和酶切载体的量，配制体系如下：
| 反应组分 | 体积(μL) |
| 2×ClonExpress Mix | 5 |
| 线性化载体 | a |
| ***目的基因片段 | b |
| ddH2O | Up to 10 |
在50℃下反应30min，置于4℃暂存。
按照DH5α大肠杆菌感受态细胞(唯地生物)说明书进行大肠杆菌的转化步骤。
参照FastPure Plasmid Mini Kit(Vazyme，南京)说明书所示步骤提取重组质粒，农杆菌EHA105感受态的转化按照上海唯地生物科技有限公司说明书所示，扩摇后进行PCR检测，将条带正确的菌液于28℃、180rpm过夜扩摇后保菌，于-80℃保存。
2、侵染
每10mL LB培养基中加入10μL 50mg/L Kan、10μL 25mg/L Rif。在100mL三角瓶中加入20mL左右LB液体培养基分别加入含有空TRV1质粒、空TRV2质粒、TRV2-LjMYB16重组质粒的三种农杆菌，置于摇床中28℃，200rpm，扩摇过夜。将上述第一次扩摇的菌液以体积1:35的比例，稀释到重新配制的LB液体培养基，每100mL LB液体培养基加入1mL 1M MES(终浓度10mM)、40μL乙酰丁香酮(终浓度20mM)、100μL 100mg/mL Kan、100μL 100mg/mL Rif，在500mL锥形瓶中二次扩摇至OD600＝0.6～0.8。在常温下，5000rpm离心10min，弃去上清。使用现配的侵染液重悬离心后剩余的沉淀，调整OD600在1～2范围内。分别将对照组(TRV1/TRV2)、实验组(TRV1/TRV2-LjMYB16)与P19保护菌按1:1:2的比例混合，暗处静置4-6h。取长势相同的3个忍冬植株，用真空泵对嫩叶进行抽吸侵染，抽吸侵染时让整个枝条浸没在菌液中，由1个大气压抽到0.7个大气压，大约需要3～4min，维持5min，缓慢放气，重复两次。侵染处理完毕后，室温下黑暗处理7～14d。
3、表型观察及qRT-PCR鉴定
qRT-PCR分析：提取VIGS沉默LjMYB16基因后正常培养14d后的嫩叶总RNA，并反转录第一链cDNA，设计qRT-PCR的引物，qRT-PCR鉴定实验组的LjMYB16基因表达量，每个部分的体系配比、反应条件参照Green Pro Taq HS PremixⅡ*1(AG，湖南)，如下所示：
表达量分析结果如图8所示：经VIGS沉默后，三个转基因株系(即三个生物学重复)忍冬嫩叶中的LjMYB16基因的表达水平均有不同程度的降低，这说明，VIGS沉默LjMYB1基因的效率较高。
表型观察：测量LjMYB16基因沉默后忍冬叶片表面腺毛的密度及其分布情况。VIGS沉默相关基因忍冬叶片的表型观察结果如图9和图10所示：未经基因沉默的叶片主脉基部腺毛较为密集(图9A)；而经过LjMYB16基因沉默以后，忍冬叶片腺毛的发育发生了变化，忍冬叶片下表面的腺毛密度出现了较为明显的下降(图9B)，其上表面的腺毛密度仅为对照的6.16倍，下表面的腺毛密度仅为对照的3倍(图10)。该结果与上述基因表达量的结果相一致，从而进一步说明该基因为忍冬腺毛发育的正调控基因。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (4)
1.LjMYB16基因在调控忍冬腺毛密度中的应用；所述应用具体为，通过LjMYB16基因沉默使忍冬表面腺毛密度下降；
所述LjMYB16基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种提高烟草表面腺毛密度的方法，其特征在于，是将权利要求1中所述的LjMYB16基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化至烟草体内，并最终通过LjMYB16基因的过表达，调控烟草腺毛发育，提高烟草表面腺毛密度。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述转化方式选自如下生物学方法中的一种：Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导或农杆菌介导。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述农杆菌选自根癌农杆菌或发根农杆菌。
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