CN114990128A

CN114990128A - Cd20基因人源化非人动物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN114990128A
Application number: CN202210681774.XA
Authority: CN
Inventors: 赵磊; 刘畅; 李冲
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2022-09-02
Also published as: WO2022262808A1

Abstract

本发明提供了一种人源化CD20基因、人源化CD20蛋白、一种CD20基因的靶向载体、一种CD20基因人源化的非人动物及其构建方法和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人CD20蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CD20蛋白，可以作为人CD20信号机理研究、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

CD20基因人源化非人动物的构建方法及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CD20基因改造非人动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

CD20(Cluster of Differentiation 20)是一种四次跨膜磷蛋白，位于B淋巴细胞表面。B淋巴细胞是由骨髓内多能干细胞分化而成，其发育经过祖B细胞(Pro-B)，前B细胞(Pre-B)，不成熟B细胞(Immature B)以及成熟B细胞(Mature B)几个阶段。成熟B细胞被释放至淋巴组织，可继续分化为浆细胞(Plasma Cell)。CD20作为B细胞的表面抗原，出现在前B细胞到成熟B细胞阶段，但是CD20并不表达在造血干细胞，祖B细胞以及成熟的浆细胞上。在人体中，CD20表面抗原是由MS4A1(membrane -spanning 4-domains,subfamily A,member 1)基因编码的。除在正常B细胞中表达外，CD20还在B细胞来源的淋巴瘤、白血病等的肿瘤细胞表达，以及和涉及免疫疾病和炎症疾病的B细胞中表达，所以CD20抗原成为淋巴癌、白血病和某些自体免疫等疾病治疗的理想靶点。由于原始的正常B细胞不受抗CD20单抗的作用，在抗CD20单抗杀伤了大部分即使所有表达CD20分子的淋巴瘤细胞及正常B细胞后，仍能够重建B细胞群，因此抗CD20单克隆抗体也越来越多的应用到B细胞相关疾病的治疗中。

美罗华(Rituximab)是首个成功的人鼠嵌合型抗CD20单克隆抗体，也是全球第一个上市的抗肿瘤单抗，用于治疗复发或者难治的惰性淋巴瘤；奥法木单抗(Ofatumumab)是第二代抗CD20人源化单抗，具有新的CD20结合表位，与CD20亲和力更强，在杀伤靶细胞方面比rituximab更有效；

Obinutuzumab为第三代人源化单抗，具有工程化改造的Fc区，以增加其与FcγRIIIa受体的结合亲和力。其结合Fc受体的能力是美罗华的50倍，比美罗华在表达CD20的NHL细胞系中引起的抗体依赖性细胞介导细胞毒作用效应强10～100倍。而且由于具有修饰过的铰链区，其在一些NHL细胞系和恶化初期的B细胞中可以诱导更强的细胞凋亡作用。自从美罗华上市，研究人员开始CD20单克隆抗体的研究，构建出更多的抗CD20抗体。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的***，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，人和小鼠CD20蛋白的一致性为73％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。

鉴于CD20复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发CD20相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种人源化CD20基因，所述的人源化CD20基因包含人CD20基因的部分。

优选的，所述的人CD20基因的部分包含人CD20基因编码区的全部或部分。

优选的，所述的人CD20基因的部分包含编码人CD20蛋白的全部或部分跨膜区、胞质区和/或胞外区的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化CD20基因包含编码人CD20蛋白的全部或部分跨膜区和/或胞外区的核苷酸序列。更进一步优选的，所述的人源化CD20基因还包含编码人CD20蛋白的全部或部分胞质区的核苷酸序列。

优选的，所述的人CD20基因的部分包含编码SEQ ID NO：2第1-297位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-297位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-297位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQID NO：2第1-297位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的人CD20基因的部分包含人CD20基因的1号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化CD20基因包含人CD20基因的1号至7号外显子中的连续两个以上外显子的组合的核苷酸序列的全部或部分。更优选的，所述的人源化CD20基因包含人CD20基因的2号至7号外显子全部或部分，更进一步优选的，所述的人CD20基因的2号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列至少包含人CD20基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和/或7号外显子的部分核苷酸序列。更优选的所述人源化CD20基因还包括人CD20基因的2-3号、3-4号、4-5号、5-6号和/或6-7号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、159、160、170、175bp的核苷酸序列，优选的，所述的2号外显子的部分至少包含编码区，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、110、130、150、170、200、210、215、216、217、218、219、220、250、300、500、1000、1500、2000、2500、2503bp的核苷酸序列，所述的7号外显子的部分至少包含编码区。

在一个具体实施方式中，所述的人CD20基因的部分包含至少从人CD20基因2号外显子编码区的第一个核苷酸开始至下游的长度为100-6094bp的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的人CD20基因的部分包含至少从人CD20基因2号外显子起始密码子开始至7号外显子终止密码子为止。

在一个具体实施方式中，所述的人CD20基因的部分为编码SEQ ID NO：2第1-297位氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD20基因包含的人CD20基因的部分核苷酸序列包含下列组中的一种：

(A)为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD20基因还包括非人动物CD20基因的部分。

优选的，所述的非人动物CD20基因的部分至少包含非人动物CD20基因的5’UTR和/3’UTR。

在一个具体实施方式中，所述的非人动物CD20基因的部分至少还包含非人动物CD20基因1号外显子的全部或部分。

在一个具体实施方式中，所述的非人动物CD20基因的部分至少还包含非人动物CD20基因2号外显子的非编码区和/或7号外显子的非编码区。

在一个具体实施方式中，所述的非人动物CD20基因的部分至少包含编码非人动物CD20蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物CD20基因的部分包括非人动物CD20基因的非编码区。

在一个具体实施方式中，所述的非人动物CD20基因还包含2号外显子的部分和/或7号外显子的全部或部分；更进一步优选的，至少还包含非人动物CD20基因2号外显子和/或7号外显子的非编码区。

优选的，所述的人源化CD20基因包括非人动物CD20基因1号外显子的全部、2号外显子的部分和7号外显子的部分。

在一个具体实施方式中，所述的人源化CD20基因的核苷酸序列还包含与SEQ IDNO：6和/或SEQ ID NO：7具有至少60％、70％、80％、90％或至少95％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD20基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：

A)为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

D)与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD20基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

优选的，所述的特异性诱导物选自四环素***(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬***(Tamoxifen System)。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种人或人源化CD20蛋白，所述的人或人源化CD20蛋白包含人CD20蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人或人源化CD20蛋白由非人动物的细胞表达。

优选的，所述的人源化CD20蛋白包含人CD20蛋白的胞外区的全部或部分。

在一个具体实施方式中，所述的人源化CD20蛋白包含人CD20基因3号外显子编码的胞外区和/或5号外显子编码的胞外区。

在一个具体实施方式中，所述的人源化CD20蛋白包含如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的79-83位序列和/或144-188位序列。

优选的，所述的人源化CD20蛋白还包含人CD20蛋白的跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

在一个具体实施方式中，所述的人源化CD20蛋白包含的人CD20蛋白的跨膜区的部分是指由人CD20基因3号外显子、4号外显子、5号外显子和/或6号外显子编码的跨膜区。

在一个具体实施方式中，所述的人源化CD20蛋白包含的人CD20蛋白的胞质区的部分是指由人CD20基因2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子和/或7号外显子编码的胞质区。

在一个具体实施方式中，所述的人源化CD20蛋白包含人CD20基因的1号至7号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CD20蛋白包含人CD20基因的1号至7号外显子中的连续两个以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，所述的人源化CD20蛋白包含人CD20基因的2号外显子的部分，3号至6号外显子的全部以及7号外显子的部分编码的氨基酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的人CD20蛋白的部分与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少90％的同一性或与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列一致。

优选的，所述的人源化CD20蛋白包含至少包含人CD20蛋白的胞外区的全部或部分，进一步的，至少包含人CD20蛋白跨膜区的全部或部分，更进一步的，还包含人CD20蛋白胞质区的全部或部分。

所述的人或人源化CD20蛋白能够被靶向CD20的人或人源化抗体识别和/或结合。

在一个具体实施方式中，所述人或人源化CD20蛋白中来源于人CD20蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。

在一个具体实施方式中，所述的人或人源化CD20蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：

a)为SEQ ID NO：2氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：2氨基酸序列同一性至少为60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

d)与SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CD20蛋白是由如上所述的人源化CD20基因编码的。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含人或人源化CD20基因的全部或部分。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含人或人源化CD20基因编码区的全部或部分。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含编码人或人源化CD20蛋白的核苷酸序列的全部或部分。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含编码人CD20蛋白的全部或部分跨膜区、胞质区和/或胞外区的核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化CD20基因包含编码人CD20蛋白的全部或部分跨膜区和/或胞外区的核苷酸序列。更进一步优选的，所述的人源化CD20基因还包含编码人CD20蛋白的全部或部分胞质区的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的供体核苷酸序列包含编码与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少90％的同一性或与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列一致的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的供体核苷酸序列包含人CD20基因的1号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的人源化CD20基因包含人CD20基因的1号至7号外显子中的连续两个以上外显子的组合的核苷酸序列的全部或部分。更优选的，包含2号至7号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人CD20基因的2号至7号外显子的全部或部分核苷酸序列至少包含人CD20基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和/或7号外显子的部分核苷酸序列。更优选的所述人源化CD20基因还包括人CD20基因的2-3号、3-4号、4-5号、5-6号和/或6-7号内含子。其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、159、160、170、175bp的核苷酸序列，优选的，所述的2号外显子的部分至少包含编码区，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、110、130、150、170、200、210、215、216、217、218、219、220、250、300、500、1000、1500、2000、2500、2503bp的核苷酸序列，优选的，所述的人7号外显子的部分至少包含编码区。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含人CD20基因的2号至7号外显子的全部或部分，优选为至少包含从人CD20基因的2号外显子编码区的第一个核苷酸起至下游的长度为100-6094bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物CD20基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000085.7至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：22至少具有90％同源性，或者如SEQID NO：3或SEQ ID NO：22所示。

在一个具体实施方式中，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CD20基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000085.7至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：23至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：23所示。

在一个具体实施方式中，所述的待改变的转换区位于非人动物CD20基因座。进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CD20基因1号至7号外显子上。优选地，位于非人动物CD20基因的2号至7号外显子上，优选的，还包含2号外显子的上游侧翼序列。

优选的，所述的靶向载体还包含非人动物CD20基因5’UTR。

优选的，所述的靶向载体还包含非人动物CD20基因3’UTR。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组***。进一步优选的，所述特异性重组***为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组***)。所述的特异性重组***为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

本发明的第四方面，提供了一种表达如上所述的CD20基因人源化的非人动物细胞，所述的细胞表达如上所述的人或人源化CD20蛋白，所述的细胞包含如上所述的人源化CD20基因。

优选的，所述的细胞选自非人动物原代细胞或细胞系，或选自非人动物的胚胎干细胞、生殖细胞或体细胞，或选自非人动物髓系的原代细胞或细胞系。

本发明的第五方面，提供了一种上述细胞在构建CD20基因人源化非人动物、CD20基因或蛋白功能的相关研究、以及在CD20相关药物制备中的应用。

本发明的第六方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物CD20基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CD20基因上的靶序列上是唯一的。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CD20基因的2号外显子和/或7号外显子序列上。

进一步优选的，所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：24所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：25所示。

本发明的第七方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。

优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。进一步优选为sgRNA序列的5’端加上TAGG，其互补链加上AAAC获得的。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子可以为SEQ ID NO：24和SEQ IDNO：27，SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：30，或者，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31。

本发明的第八方面，提供了一种包含上述sgRNA或者上述DNA分子的sgRNA载体。

本发明的第九方面，提供了一种sgRNA载体的制备方法，其包括：

(i)提供上述sgRNA，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述的sgRNA靶向CD20基因，同时所述sgRNA在待改变的CD20基因上的靶序列上是唯一的，所述的sgRNA的靶位点位于CD20基因的2号外显子和/或7号外显子上；

(ii)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

(iii)将步骤(i)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(ii)所述的pT7-sgRNA载体的双链；

(iv)将步骤(iii)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

优选的，所述的步骤(ii)中所述T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ IDNO：32所示。

本发明的第十方面，提供了一种包含上述靶向载体、上述sgRNA、DNA分子或sgRNA载体的细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞包含上述的靶向载体和sgRNA。

本发明的第十一方面，提供了上述靶向载体、上述sgRNA、DNA分子或sgRNA载体、上述制备方法获得的sgRNA载体或者包含上述靶向载体或上述sgRNA的细胞在CD20基因修饰中的应用。优选的，所述的应用包括但不限于敲除、***或替换。

本发明的第十二方面，提供了一种CD20基因人源化非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CD20蛋白。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化CD20基因。

优选的，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物CD20基因座上，以形成人或人源化CD20基因。

优选的，所述的人源化CD20蛋白为如上所述的蛋白。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD20蛋白的核苷酸序列的全部或部分；

B)编码人CD20蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列；

C)人或人源化CD20基因的全部或部分；或，

D)人CD20基因的1号外显子至7号外显子的全部或部分，优选包含2号至7号外显子的全部或部分，优选人CD20基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和/或7号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、90、100、110、130、150、155、156、157、158、159、160、170、175bp的核苷酸序列，优选的，所述的2号外显子的部分至少包含编码区，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、110、130、150、170、200、210、215、216、217、218、219、220、250、300、500、1000、1500、2000、2500、2503bp的核苷酸序列，所述的7号外显子的部分至少包含编码区，优选为至少包含从人CD20基因的2号外显子编码区的第一个核苷酸起至下游长度为100-6094bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的供体核苷酸序列包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

优选的，所述的CD20基因人源化非人动物中的人或人源化CD20基因对于内源被替换基因的基因座是纯合或杂合的。

优选的，所述的人源化CD20基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件为启动子。

优选的，所述的构建方法包括用所述的供体核苷酸序列***或替换到非人动物CD20基因座上。

在一个具体实施方式中，用包含上述人CD20基因的部分的供体核苷酸序列导入到非人动物CD20基因座上的相应区域，以形成人源化CD20基因。

进一步优选的，导入的供体核苷酸序列被内源的调控元件调控。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CD20蛋白的全部或部分核苷酸序列导入到非人动物CD20基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CD20蛋白的cDNA序列导入到非人动物CD20基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含如上所述的人源化CD20基因的核苷酸序列导入到非人动物CD20基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码如上所述的人源化CD20蛋白的核苷酸序列导入到非人动物CD20基因座上。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于***、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。

所述的导入为替换或***，具体地，所述的导入非人动物CD20基因座为替换非人动物相应区域，优选为替换非人动物基因组中编码内源CD20蛋白全部或部分的核苷酸序列，进一步优选的，编码SEQ ID NO：1的核苷酸序列被替换。

优选的，非人动物CD20基因的2号外显子至7号外显子全部或部分被替换，进一步优选的，非人动物CD20基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和7号外显子的部分被替换。

优选的，所述的***为首先破坏非人动物内源CD20基因的编码框，随后进行***操作。或者所述的***步骤即可给内源CD20基因造成移码突变又可以实现***人源序列的步骤。

优选的，所述的编码所述人源化CD20蛋白的核苷酸序列被替换到非人动物CD20基因座上的相应位置。

优选的，使用基因编辑技术进行所述非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用CRISPR/Cas9技术进行所述非人动物的构建，包括设计、合成靶向非人动物内源CD20基因的sgRNA、构建携带全部或部分人CD20基因的靶向载体，将所述的sgRNA和靶向载体导入非人动物细胞，筛选带有人CD20基因的细胞。

优选的，所述的构建方法包括修饰非人动物CD20基因的编码框，将包含上述的外源核苷酸序列***非人动物CD20基因内源调控元件之后，其中，所述的修饰非人动物CD20基因的编码框可以采用敲除非人动物CD20基因的功能区或者采用***一段序列，使得非人动物CD20蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能，进一步优选的，所述的修饰非人动物CD20基因的编码框可以为敲除非人动物CD20基因的外显子2至外显子7的全部或部分核苷酸序列。

优选的，使用所述的靶向载体进行非人动物的构建。

优选的，所述的构建方法包括使用本发明所述的靶向载体和/或sgRNA进行非人动物的构建。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向CD20基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CD20基因人源化的非人动物。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的胚胎干细胞中，短暂培养后导入事先分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至受体母鼠的输卵管中，允许其发育，鉴定筛选获得CD20基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将CD20基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为PD-1、PD-L1、TIGIT、TNFA、41BB、41BBL、CTLA4、CD47、SIRPA、OX40、TIM3和CD226中的至少一种基因。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的PD-1、PD-L1、TIGIT、TNFA、41BB、41BBL、CTLA4、CD47、SIRPA、OX40、TIM3和CD226蛋白中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化CD20基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。

本发明的第十三方面，提供了上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第十四方面，提供了一种内源CD20基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失内源CD20基因的全部或部分核苷酸序列。

在一个具体实施方式中，所述的非人动物缺失内源CD20基因的2号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失1号至7号外显子中的连续两个以上外显子的组合的核苷酸序列的全部或部分。更进一步优选的，缺失2至7号外显子的全部或部分核苷酸序列。优选的，所述的非人动物缺失CD20基因的2号、3号、4号、5号、6号外显子和/或7号外显子的编码区。优选的，所述的非人动物还缺失CD20基因的2-3号内含子、3-4号内含子、4-5号内含子、5-6号内含子和/或6-7号内含子。在一个具体实施方式中，缺失的部分是从2号外显子的起始密码子开始到7号外显子终止密码子结束的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物缺失编码内源CD20蛋白胞质区、跨膜区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的非人动物缺失编码内源CD20蛋白胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物缺失编码内源CD20蛋白胞外区的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物用如上所述的sgRNA进行构建。

本发明的第十五方面，提供了一种CD20基因敲除的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括使用sgRNA进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物CD20基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CD20基因上的靶序列上是唯一的。

本发明的第十六方面，提供了一种人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化CD20蛋白。

优选的，所述的非人动物内源CD20蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CD20蛋白选自如上所述的人源化CD20蛋白。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人CD20基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含如上所上述的人源化CD20基因。

优选的，编码所述人或CD20蛋白的核苷酸序列或者所述的人或人源化CD20基因的核苷酸序列可操作的连接至至少非人动物一条染色体中内源性CD20基因座处的内源调控元件。

优选的，所述的非人动物是使用基因编辑技术构建的，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在一个具体实施方式中，所述的非人动物是使用所述的靶向载体和/或靶向非人动物CD20基因的sgRNA构建的。

在一个具体实施方式中，所述的非人动物是用如上所述的构建方法构建的。

优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、TNFA、41BB、41BBL、CTLA4、CD47、SIRPA、OX40、TIM3或CD226中的至少一种。

优选的，所述CD20基因和所述其他基因对于内源被替换基因的基因座为纯合或杂合。

本发明的第十七方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

I)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；

II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、TIGIT、TNFA、41BB、41BBL、CTLA4、CD47、SIRPA、OX40、TIM3或CD226人源化的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因对于内源被替换基因的基因座均可以是纯合或杂合的。

本发明的第十八方面，提供了一种上述构建方法获得的CD20基因人源化的非人动物、或者多基因修饰的非人动物或其子代。

本发明的第十九方面，提供了一种动物模型，所述动物模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第二十方面，提供了一种动物模型的制备方法，所述的制备方法包括构建上述的CD20基因人源化的非人动物、内源CD20基因缺失的非人动物或者多基因修饰的非人动物或其子代的步骤。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型，更优选的，所述荷瘤动物模型的制备方法还包括植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第二十一方面，提供了上述的CD20基因人源化的非人动物、内源CD20基因缺失的非人动物、多基因修饰的非人动物或其子代、或者上述的构建方法获得的CD20基因人源化的非人动物、内源CD20基因缺失的非人动物、多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第二十二方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。

优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物包括可以发育成动物个体和不能发育成动物个体的细胞或细胞系或原代细胞培养物。

本发明的第二十三方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。

优选的，所述的组织或器官或其培养物包括可以发育成动物个体和不能发育成动物个体的组织或器官或其培养物。

本发明的第二十四方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤动物模型。

本发明的第二十五方面，提供了一种CD20基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化CD20蛋白。

优选的，所述的人源化CD20蛋白为本发明第一方面所述的人源化CD20蛋白。

优选的，所述细胞中内源CD20蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人CD20基因的全部或部分。进一步优选的，所述的细胞包含如上所述的人源化CD20基因。

优选的，所述的细胞包括可以发育成动物个体和不能发育成动物个体的细胞。

本发明的第二十六方面，提供了一种表达上述的人源化CD20蛋白的构建体。优选的，所述的构建体包含人源化CD20基因。

本发明的第二十七方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第二十八方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

优选的，所述的组织包括可以发育成动物个体和不能发育成动物个体的组织。

本发明的第二十九方面，提供了来源于上述的人源化CD20蛋白、上述的人源化CD20基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织的应用，所述的应用包含：

(A)涉及人类细胞的与CD20相关的免疫过程的产品开发中的应用；

(B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与CD20相关的模型***中的应用；

(C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与CD20相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

(D)在体内研究人CD20信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

(E)研究CD20基因功能，研究针对人CD20靶位点的药物、药效，研究与CD20相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

优选的，所述应用为非疾病的治疗和诊断目的。

本发明的第三十方面，提供了一种人CD20特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述人CD20特异性调节剂的筛选方法包括治疗方法和非治疗方法。

在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十一方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法包括治疗方法和非治疗方法。

在一个具体实施方式中，该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十二方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备人CD20特异性调节剂中的用途。

本发明的第三十三方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物模型在制备***、炎症或自身免疫疾病的药物中的用途。

优选的，以上所有方面所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、***癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。

本发明所述的CD20基因人源化的非人动物，其体内可以正常表达人或人源化CD20蛋白，可用于针对人CD20靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究CD20蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化CD20蛋白”，包含来源于人CD20蛋白的部分和非人CD20蛋白的部分。其中，所述的“人CD20蛋白”同人CD20蛋白的全部，即其氨基酸序列与人CD20蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CD20蛋白的部分”，为连续或间隔的5-297个氨基酸序列与人CD20蛋白的氨基酸序列一致。优选为连续或间隔5、10、20、30、40、47、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、255、260、270、280、290或297个氨基酸序列与人CD20蛋白的氨基酸序列一致。

本发明所述的“人CD20蛋白的跨膜区的全部”、“人CD20蛋白的胞质区的全部”或“人CD20蛋白的胞外区的全部”，代表其氨基酸序列分别与人CD20蛋白的跨膜区、胞质区或胞外区的全长氨基酸序列一致。

本发明所述的“人源化CD20基因”，包含来源于人CD20基因的部分和非人CD20基因的部分。其中，所述的“人CD20基因”同“人CD20基因的全部”，即其核苷酸序列与人CD20基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人CD20基因的部分”为连续或间隔的20-14906bp(优选为20-6094bp、20-3293bp或20-894bp)个核苷酸序列与人CD20核苷酸序列一致或与人CD20核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体；“部分”为整体中的局部，或者整体中的个体。例如“1号外显子至7号外显子的全部或部分”，“1号外显子至7号外显子的全部”为整体，即1号外显子至7号外显子的全部核苷酸序列；“1号外显子至7号外显子的部分”为整体的局部或整体的个体，即2号外显子至7号外显子中的一个或两个以上连续或间隔的核苷酸序列。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至7号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子的核苷酸序列。

本发明所述的“连续两个以上外显子”是指例如外显子2、3连续，外显子3、4连续，外显子4、5连续，外显子5、6连续，外显子6、7连续，外显子2、3、4连续，外显子3、4、5连续，外显子4、5、6连续，外显子5、6、7连续，也包括外显子2、3、4、5连续，外显子3、4、5、6连续，外显子4、5、6、7连续，外显子5、6、7连续，也包括外显子2、3、4、5、6连续，外显子3、4、5、6、7连续，外显子4、5、6、7连续，外显子2、3、4、5、6、7连续，外显子3、4、5、6、7连续，外显子2、3、4、5、6、7连续。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人CD20基因的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-175bp个，优选10-159个核苷酸序列与人CD20基因的2号外显子核苷酸序列一致。例如人CD20基因的7号外显子的部分，包含连续或间隔的5-2503bp个，优选10-219bp个核苷酸序列与人CD20基因的7号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人CD20基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括从2号外显子编码区的第一个核苷酸序列开始至2号外显子的最后一个核苷酸为止。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化CD20基因”中包含的“7号外显子的部分”至少包括从7号外显子的第一个核苷酸序列开始到编码区编码最后一个氨基酸为止的核苷酸序列。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如，在一个具体实施方式中，所述的“CD20基因座”表示CD20基因1号至7号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的CD20基因座可以是CD20基因2号至7号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdc^scidIL-2rγ^null背景的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

图1为小鼠CD20基因座和人CD20基因座对比示意图(非按比例)；

图2为小鼠CD20基因人源化改造示意图(非按比例)；

图3为CD20基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图4为CD20基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图5为CD20基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，PC为阳性对照，M为Maker；

图6为CD20基因打靶策略及靶向载体设计示意图；

图7为F1代小鼠的Southern blot检测结果；

图8为C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CD20基因人源化纯合子小鼠(H/H)RT-PCR检测结果，其中，H₂O为水对照，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

ScaI、NcoI、EcoRV酶购自NEB，货号分别为R3122S、R3193S、R3195S；

C57BL/6小鼠、Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD45 购自Biolegend，货号103138；

FITC anti-Mouse CD19 购自Biolegend，货号115506；

V450 Rat Anti- mouse CD11b购自Biolegend，货号8232657；

APC anti-mouse CD20 Antibody购自Biolegend，货号152107；

PE anti-human CD20 Antibody购自Biolegend，货号302305；

Purified anti-mouse CD16/32购自Biolegend，货号101302。

实施例1 CD20基因人源化小鼠

小鼠CD20基因(NCBI Gene ID：12482，Primary source：MGI:88321，UniProt：P19437，位于19号染色体NC_000085.7的第11227043至112435137位，基于转录本NM_007641.6及其编码蛋白NP_031667.1 (SEQ ID NO：1))和人CD20基因(NCBI Gene ID：931，Primary source：HGNC:7315，UniProt ID：A0A024R507，位于11号染色体NC_000011.10的第60455847至60470752位，基于转录本NM_021950.4及其编码蛋白NP_068769.2(SEQ ID NO：2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CD20基因座引入编码人CD20蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CD20蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠CD20基因调节元件的控制下，用人CD20基因组编码区替换小鼠CD20基因组编码区，或用包含人CD20基因的2号外显子部分序列至7号外显子部分序列约6.1kb替换小鼠2号外显子的部分序列至7号外显子的部分序列约7.2kb，得到人源化CD20基因座示意图如图2所示，实现对小鼠CD20基因的人源化改造。

设计如图3所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠CD20基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CD20序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ IDNO：3)与NCBI登录号为NC_000085.7的第11236186至11240359位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000085.7的第11227043至11229028位核苷酸序列相同。A片段上人CD20片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000011.10的第60462375至60468468 位核苷酸序列相同；人CD20序列上游与小鼠的连接设计为：5’-CTTATTTTCAGGCGTTTGAAAA

ATGACAACACCCAGAAATTCAGTAAA-3’(SEQ ID NO：6)，其中序列

中“A”是小鼠最后一个核苷酸，序列“ATGA”中第一个“A”是人第一个核苷酸。人CD20序列下游与小鼠的连接设计为5’-AAAATGACAGCTCTCC

ACTCTTTTCTTTTCT-3’(SEQ ID NO：7)，其中序列

中的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列“ACTC”中的“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组***Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与人基因的连接设计为5’-CAGAGTTATATTCACTAA

GTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAG-3’(SEQ ID NO：8)，其中序列

中“C”是人的最后一个核苷酸，序列“GTCG”的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与人基因的连接设计为5’-AGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCACTAGTTCTAGAGCGGCCGCGTTAA

AAATCAGAACGAAAATCTAAACTCCTCTATTACTG-3’(SEQ ID NO：9)，其中序列

中“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“AAAT”中第一个“A”是人的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CD20的mRNA序列如SEQ ID NO：10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

鉴于人CD20具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆，再进行Southern Blot(分别用NcoI、ScaI、或EcoRV酶消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，Southern检测为阳性的克隆，进一步测序验证为阳性的且无随机***的克隆进行下一步实验。

表1：具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段	重组序列片段
				NcoI	5’Probe	8.0kb	6.4kb
ScaI	3’Probe	9.2kb	12kb
				EcoRV	Neo Probe	—	12kb

其中，PCR测定包括下述引物：

PCR-F1：5’-TGGAGGAAGCCTCAAGTGTCTCA-3’(SEQ ID NO:11)

PCR-R1：5’-CCTATACCGCATCAGCTTCTGTCA-3’(SEQ ID NO:12)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F：5’-ACTGTGCAGAAAAGGCAACAGGCTA-3’(SEQ ID NO：13)，

5’Probe-R：5’-TCCTGGGACCTACTCTCTCCTTGTG-3’(SEQ ID NO：14)；

3’探针(3’Probe)：

3’Probe-F：5’-TTTACATGGCATGCCCACAATGGTT-3’(SEQ ID NO：15)，

3’Probe-R：5’-ATTCCACCTTCACTGAGTTCCCTCC-3’(SEQ ID NO：16)；

Neo探针(NeoProbe)：

NeoProbe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：17)，

NeoProbe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：18)；

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图4)后，再通过互相交配即可得到CD20基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图5，其中，编号为F1-01、F1-02和F1-03三只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机***的CD20基因人源化小鼠。

表2：引物名称及具体序列

此外，还可以使用CRISPR/Cas***进行基因编辑，设计如图6所示的打靶策略示意图，图6中显示了靶向载体上含有小鼠CD20上游和下游的同源臂序列，以及人CD20片段核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：22)与NCBI登录号为NC_000085.7的第11236186至11237594位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：23)与NCBI登录号为NC_000085.7的第11227619至11229028位核苷酸序列相同。靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的载体质粒用于后续实验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成sgRNA1-sgRNA14的共14个sgRNA序列。利用UCA试剂盒检测sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，选择活性最高得sgRNA-3和sgRNA-10，其靶位点序列如下：

sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：24)：5’-TGGAGCAGGTTGCATGGCGAGGG-3’

sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：25)：5’-GGAGCGATCTCATTTTCCACTGG-3’

在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(序列见表3)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-CD20-3和pT7-CD20-10。

表3 sgRNA-3及sgRNA-10序列列表

sgRNA-3序列
		SEQ ID NO：24	上游：5’-TGGAGCAGGTTGCATGGCGAGGG-3’
SEQ ID NO：26(正向寡核苷酸)	上游：5’-TAGG TGGAGCAGGTTGCATGGCGAGGG-3’
		SEQ ID NO：27	下游：5’-CCCTCGCCATGCAACCTGCTCCA-3’
SEQ ID NO：28(反向寡核苷酸)	下游：5’-AAAC CCCTCGCCATGCAACCTGCTCCA-3’
		sgRNA-10序列
SEQ ID NO：25	上游：5’-GGAGCGATCTCATTTTCCACTGG-3’
		SEQ ID NO：29(正向寡核苷酸)	上游：5’-TAGG GGAGCGATCTCATTTTCCACTGG-3’
SEQ ID NO：30	下游：5’-CCAGTGGAAAATGAGATCGCTCC-3’
		SEQ ID NO：31(反向寡核苷酸)	下游：5’-AAAC CCAGTGGAAAATGAGATCGCTCC-3’

随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-CD20-3和pT7-CD20-10进行后续实验。

pT7-sgRNA质粒来源：

pT7-sgRNA载体的质粒骨架来源Takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：32)：

gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc

取C57BL/6小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-CD20-3和pT7-CD20-10质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9 mRNA，靶向载体质粒注射至小鼠受精***质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(founder鼠，即F0代)。改造后的人源化小鼠CD20的mRNA序列如SEQ ID NO：10所示，表达的蛋白序列如SEQ IDNO：2所示。

可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，PCR分析包括下述引物：WT-F(SEQ ID NO：19)与WT-R(SEQ ID NO：20)，以及WT-F((SEQ ID NO：19)与Mut-R(SEQ ID NO：21)。将F0鉴定为阳性的CD20人源化小鼠与C57BL/6小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southernblot检测，确认是否存在随机***。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用NcoI酶或AseI酶消化基因组，转膜，杂交。

5’探针(5’Probe)合成引物：

5’Probe-F(SEQ ID NO：33)：5’-ACTGTGCAGAAAAGGCAACAGGCTA-3’

5’Probe-R(SEQ ID NO：34)：5’-TCCTGGGACCTACTCTCTCCTTGTG-3’

3’探针(3’Probe)合成引物：

3’Probe-F(SEQ ID NO：35)：5’-TTTACATGGCATGCCCACAATGGTT-3’

3’Probe-R(SEQ ID NO：36)：5’-ATTCCACCTTCACTGAGTTCCCTCC-3’

Southern blot检测结果见图7。结果表明，4只小鼠中3只小鼠无随机***，这3只小鼠的编号1EA61-0001、1EA61-0009和1EA61-0010。证实这3只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机***。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机***的CD20人源化基因工程小鼠。

进一步通过RT-PCR检测小鼠体内CD20 mRNA的表达情况。具体来说，分别取9周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和本实施例获得的CD20基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏组织，按照Trizol试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测(引物见表4)，检测结果(如图8所示)显示：在C57BL/6野生型小鼠(+/+)体内仅检测到鼠CD20 mRNA，未检测到人CD20mRNA；仅在CD20基因人源化纯合子小鼠(H/H)体内仅检测到人CD20 mRNA。

表4 RT-PCR引物名称及具体序列

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人或人源化CD20蛋白的表达情况，例如流式细胞术等。具体来说，分别取9周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和10周龄雌性CD20基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏组织，分别用抗鼠CD20抗体APC anti-mouseCD20 Antibody(mCD20-APC),抗人CD20抗体PE anti-human CD20 Antibody(hCD20-PE)、鼠白细胞识别抗体Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD45、抗鼠CD19抗体FITC anti-Mouse CD19(mCD19-BV605)、抗鼠CD16/32抗体Purified anti-mouse CD16/32等识别染色后进行流式检测，结果表明，C57BL/6小鼠脾脏中B细胞(特征为mCD45+mCD19+)有48.1％mCD20阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+mCD20+),有0.17％hCD20阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+hCD20+)。CD20纯合子小鼠脾脏中B细胞有0.11％mCD20阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+mCD20+)，有57.4％hCD20阳性细胞(特征为mCD45+mCD19+hCD20+)。说明C57BL/6小鼠脾脏细胞不表达人CD20蛋白，CD20人源化小鼠脾脏细胞能够成功表达人CD20蛋白。

实施例2双重人源化或多重双人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的CD20小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、TIGIT、TNFA、41BB、41BBL、CTLA4、CD47、SIRPA、OX40、TIM3或CD226等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化CD20小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CD20与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CD20小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化CD20与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CD20和其它基因调节剂的体内药效验证等。

实施例3药效验证

利用本方法制得的CD20人源化小鼠可以用于评估靶向人CD20的药物的药效。例如，取CD20人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(或小鼠淋巴瘤细胞EL4)，待肿瘤体积生长到约100mm³后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人CD20的药物，对照组注射等体积的生理盐水或PBS。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估药物的体内安全性和体内药效。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> CD20基因人源化非人动物的构建方法及应用

<130> 1

<150> CN202110668664.5

<151> 2021-06-16

<160> 42

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 291

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

Met Ser Gly Pro Phe Pro Ala Glu Pro Thr Lys Gly Pro Leu Ala Met

1 5 10 15

Gln Pro Ala Pro Lys Val Asn Leu Lys Arg Thr Ser Ser Leu Val Gly

20 25 30

Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu Ser Lys Ala Leu Gly Ala Val

35 40 45

Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile Thr Leu Gly Gly Leu Leu Met

50 55 60

Ile Pro Thr Gly Val Phe Ala Pro Ile Cys Leu Ser Val Trp Tyr Pro

65 70 75 80

Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala

85 90 95

Ala Ala Glu Lys Thr Ser Arg Lys Ser Leu Val Lys Ala Lys Val Ile

100 105 110

Met Ser Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile Ser Gly Ile Ile Leu Ser

115 120 125

Ile Met Asp Ile Leu Asn Met Thr Leu Ser His Phe Leu Lys Met Arg

130 135 140

Arg Leu Glu Leu Ile Gln Thr Ser Lys Pro Tyr Val Asp Ile Tyr Asp

145 150 155 160

Cys Glu Pro Ser Asn Ser Ser Glu Lys Asn Ser Pro Ser Thr Gln Tyr

165 170 175

Cys Asn Ser Ile Gln Ser Val Phe Leu Gly Ile Leu Ser Ala Met Leu

180 185 190

Ile Ser Ala Phe Phe Gln Lys Leu Val Thr Ala Gly Ile Val Glu Asn

195 200 205

Glu Trp Lys Arg Met Cys Thr Arg Ser Lys Ser Asn Val Val Leu Leu

210 215 220

Ser Ala Gly Glu Lys Asn Glu Gln Thr Ile Lys Met Lys Glu Glu Ile

225 230 235 240

Ile Glu Leu Ser Gly Val Ser Ser Gln Pro Lys Asn Glu Glu Glu Ile

245 250 255

Glu Ile Ile Pro Val Gln Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Glu Ile Asn

260 265 270

Phe Pro Ala Pro Pro Gln Glu Gln Glu Ser Leu Pro Val Glu Asn Glu

275 280 285

Ile Ala Pro

290

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Thr Thr Pro Arg Asn Ser Val Asn Gly Thr Phe Pro Ala Glu Pro

1 5 10 15

Met Lys Gly Pro Ile Ala Met Gln Ser Gly Pro Lys Pro Leu Phe Arg

20 25 30

Arg Met Ser Ser Leu Val Gly Pro Thr Gln Ser Phe Phe Met Arg Glu

35 40 45

Ser Lys Thr Leu Gly Ala Val Gln Ile Met Asn Gly Leu Phe His Ile

50 55 60

Ala Leu Gly Gly Leu Leu Met Ile Pro Ala Gly Ile Tyr Ala Pro Ile

65 70 75 80

Cys Val Thr Val Trp Tyr Pro Leu Trp Gly Gly Ile Met Tyr Ile Ile

85 90 95

Ser Gly Ser Leu Leu Ala Ala Thr Glu Lys Asn Ser Arg Lys Cys Leu

100 105 110

Val Lys Gly Lys Met Ile Met Asn Ser Leu Ser Leu Phe Ala Ala Ile

115 120 125

Ser Gly Met Ile Leu Ser Ile Met Asp Ile Leu Asn Ile Lys Ile Ser

130 135 140

His Phe Leu Lys Met Glu Ser Leu Asn Phe Ile Arg Ala His Thr Pro

145 150 155 160

Tyr Ile Asn Ile Tyr Asn Cys Glu Pro Ala Asn Pro Ser Glu Lys Asn

165 170 175

Ser Pro Ser Thr Gln Tyr Cys Tyr Ser Ile Gln Ser Leu Phe Leu Gly

180 185 190

Ile Leu Ser Val Met Leu Ile Phe Ala Phe Phe Gln Glu Leu Val Ile

195 200 205

Ala Gly Ile Val Glu Asn Glu Trp Lys Arg Thr Cys Ser Arg Pro Lys

210 215 220

Ser Asn Ile Val Leu Leu Ser Ala Glu Glu Lys Lys Glu Gln Thr Ile

225 230 235 240

Glu Ile Lys Glu Glu Val Val Gly Leu Thr Glu Thr Ser Ser Gln Pro

245 250 255

Lys Asn Glu Glu Asp Ile Glu Ile Ile Pro Ile Gln Glu Glu Glu Glu

260 265 270

Glu Glu Thr Glu Thr Asn Phe Pro Glu Pro Pro Gln Asp Gln Glu Ser

275 280 285

Ser Pro Ile Glu Asn Asp Ser Ser Pro

290 295

<210> 3

<211> 4174

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tagaagtcaa aggggtttgt gggtttgtgg gagctgcagt gggtgataag atggaacggt 60

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<210> 4

<211> 4623

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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aaaatagtat caaagagaga aaattattct cccagagtta tattcactaa aggcaaatca 5580

gaacgaaaat ctaaactcct ctattactgc aatgttcttt tcccaatacc acgtggtcat 5640

tccaggcact gtggtcaatg tctgctgccc ttgaagattt attcagactt gagttttaat 5700

aaatgacttg ataaggatat aagcacctgc aaaaaaattt tggcatttaa aggcatataa 5760

taaatgacat aagtagcata aaaaccagga ggtatttgat aaatgtttgt ggagattgtt 5820

gacaaaggtg tcagtggtaa aagtaaagaa tggtttgttt aattttctgt tttagaacat 5880

agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt gaaataaaag aagaagtggt 5940

tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa gacattgaaa ttattccaat 6000

ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca gaacctcccc aagatcagga 6060

atcctcacca atagaaaatg acagctctcc ttaa 6094

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cttattttca ggcgtttgaa aactcaatga caacacccag aaattcagta aa 52

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aaaatgacag ctctccttaa actcttttct tttct 35

<210> 8

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagagttata ttcactaaag gcgtcgacgg tatcgataag cttgatatcg aattccgaag 60

ttcctattct ctagaaag 78

<210> 9

<211> 102

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agtataggaa cttcatcagt caggtacata atggtggatc cactagttct agagcggccg 60

cgttaacaaa tcagaacgaa aatctaaact cctctattac tg 102

<210> 10

<211> 3002

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

actcatcttc aagtacttga gatagaagag gccaactgat ctcagctgtg agtggctaat 60

ttggccctta agccttggag ccttggagcc ttggagaccc aggcgtttga aaactcaatg 120

acaacaccca gaaattcagt aaatgggact ttcccggcag agccaatgaa aggccctatt 180

gctatgcaat ctggtccaaa accactcttc aggaggatgt cttcactggt gggccccacg 240

caaagcttct tcatgaggga atctaagact ttgggggctg tccagattat gaatgggctc 300

ttccacattg ccctgggggg tcttctgatg atcccagcag ggatctatgc acccatctgt 360

gtgactgtgt ggtaccctct ctggggaggc attatgtata ttatttccgg atcactcctg 420

gcagcaacgg agaaaaactc caggaagtgt ttggtcaaag gaaaaatgat aatgaattca 480

ttgagcctct ttgctgccat ttctggaatg attctttcaa tcatggacat acttaatatt 540

aaaatttccc attttttaaa aatggagagt ctgaatttta ttagagctca cacaccatat 600

attaacatat acaactgtga accagctaat ccctctgaga aaaactcccc atctacccaa 660

tactgttaca gcatacaatc tctgttcttg ggcattttgt cagtgatgct gatctttgcc 720

ttcttccagg aacttgtaat agctggcatc gttgagaatg aatggaaaag aacgtgctcc 780

agacccaaat ctaacatagt tctcctgtca gcagaagaaa aaaaagaaca gactattgaa 840

ataaaagaag aagtggttgg gctaactgaa acatcttccc aaccaaagaa tgaagaagac 900

attgaaatta ttccaatcca agaagaggaa gaagaagaaa cagagacgaa ctttccagaa 960

cctccccaag atcaggaatc ctcaccaata gaaaatgaca gctctcctta aactcttttc 1020

ttttctaagc attattgttt agagagcttc caagacacat agttaccctc atctcttgtg 1080

gccttccaca atctattctc catattttca cagcttaact ttgcatagag aagccacatc 1140

tagctctcct tcacatttga agaatgcagt gattataaaa gattgtcttt tgccttgctt 1200

agggagtctt acactggcag aaacgctgaa gaatccaatt ctcattcacc ttttccttgg 1260

atgtgtgtct cagtagtggt aatggttttt ccgcatttcc tccatcagca gttacagcag 1320

agggaaaaga cacatgactg ttctgttcat ctctgaactc tctgactcct tcttcatgtt 1380

tggtggagtc ccttttgcat gattgtctta aagaatatga gagaaattgt ttaatgagaa 1440

ttgttttaat aatgagagaa aatgagacac ctatatgcct gtggggaagg cacaaaatat 1500

ggcatgttct tcaagcttct gtgtcccact tgggaagctg tgaaaggcct agtcctaagt 1560

ctgtctctgt acaaaaagca tagcttacac ataagcaagt ttcatgtctt aactttgccc 1620

atctccagtt tcttggcttc tggtcacatc gtttatgtat ttgtattctt tagtcaagag 1680

aaaaaagaat ggtgagacag aaatgtaatg ggttcccaga tctcaaatcc taagcaacag 1740

ctgtgctttg agattctttc caaatggcag agtagtttat ttggtctttc atgattcaca 1800

gaaaaaaaac aaaaaaacaa aaaacaaaaa acctatcact attttgtaat ttagttgaat 1860

gtaagaagca agccaagata ttcaataata gttgtgggga cttgagtcaa acccagctct 1920

tcaaattcta gaaatgtttg aaataaccaa attatctatg cccatatgcc tgtataagct 1980

atatcaaagt atatactttg tgagcaatgt gctgaatcac aaaagagtca gaattggatt 2040

tgacaccata tgaataaaga cacccagaat cttacatcat ttggaaaact agtcgtgaca 2100

ttaatatgca attagctgga aagttataag atgcaccaca aacacatctt atatgcacta 2160

taaattacca cacaaagatc atgcttaaaa acaacacagt taaaatccta aatctcaggc 2220

caccatactt tcccacccct gttcctgagc agggatgcta gcacctgacc tagaaacact 2280

gttagcctaa aaagatctca ccatagccta tcattcagat accatgacaa gtctgcttct 2340

aggcattatg ggtatatgaa cagcttaagt ttcactcctt ggaatatttc tattttatta 2400

gaggctaccg gtgggagtta tttcctgtta ttacaaagaa actggaagta gcaccttttc 2460

cctgtgtggt cttcaaaaca agctctaagt aaataaaact ttgtgtcagt gcctgcaatg 2520

gatactccac cttggatgtt tctttcttct ccataacatc aaacaatggg atgcttctgc 2580

cacataatac taacctgtgt ttgaatagtg gcacatccag tcatattgag ctattcctac 2640

ctatctgaca catgctccca aggagtttac tcatccagta ggtctttact aagttctgcc 2700

cacttacaag ccacagcacg attctccata tccattcttc tccatagaag gtaccctaag 2760

ctaaagaaga taccgctatg cctggagagg atggggaggt gggaggagga gtgtcaagct 2820

gaaaagtttt aaatgcagta ttcaatttga aaagtttccc ctctctgaaa ttcatttcct 2880

taatgatttt acattagtca tcgtcagatt ctcaaataat tagtctttac caatttctca 2940

tgactaggag ataattttag tgtctattta aaaagaataa aagttcttgt gagcctcaaa 3000

aa 3002

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tggaggaagc ctcaagtgtc tca 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cctataccgc atcagcttct gtca 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

actgtgcaga aaaggcaaca ggcta 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcctgggacc tactctctcc ttgtg 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tttacatggc atgcccacaa tggtt 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

attccacctt cactgagttc cctcc 25

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gaagtggaca tgactcagtg gcacc 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aacctgcctg tagaaggcag actga 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aggtgacata agatcaccca gaggt 25

<210> 22

<211> 1409

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tctatgcagg agatagtaat gcccgatttc tttcactatc tctcttacaa tactagaagt 60

aattctgaat gtcactgaat aggcaacatt cttactgaat tccaagccca gggttggctc 120

aaggactacc gagggcattg gtgaaagcca gaaagcaaag ttcgattttg cttaggtatt 180

tggcaaatca ttgcttggag gcacctataa taaaacaaca ctgaaaggaa gcacacagat 240

ccattcacaa ggacaaaatt ggagcatacg tgctatggaa tgccacactt ccaggagact 300

aagtttccgt gaaactcttc gcctcaggac tgcatccagg cttttggcct gtcatgcgtg 360

tcactactga agtggatgta gcacaacatc atttgtttct gtcaagagag aactgcaata 420

aactcgcata taaggtaatt taccacagtc atgactgaaa tgaggtaact agcacaggat 480

gtgttgaggc agggcgcata cacagggcgc ataggttgag ggtttacaga aggcctctgc 540

ggatagctgg ggtttaagct acacctgggt gaaaaaaaac ccacaccaac atgaaccgtc 600

atcatcaacc tcctgtacca cgttgtgaga caaggattct tactattttc agtctagagc 660

tgaagaatct gaggcccagg taacttggcc aacacctcag agtaattaga attactgttt 720

aaaaccagac agtctgactc acaggctgtg attgtacatg tgatatcaga gaatattctt 780

gaagtgacct gcacaacgtc agagtcagag ggagagagag gtctagacca tccctcctga 840

atttcaggac agtcctagcc ataatcaaga atgacatgtc tgggctacta cactgtcctt 900

ctgaacatat gaacaagcca ataaaaatat gctttggaat attaaatcat aagaacatcc 960

aaggagggac cagctagaca aatgcataga gcagagatga agcgcggtgg tattttctta 1020

gcattcacaa agagagtcca agccccacca gagaaaaact gcatatggac ataaatttat 1080

ggtatggcta tgttctaaga gtatagctca ctggtaaact aattgactac attgtgattt 1140

cttgaacatt agcatgtgtc caaacatgat tatcatccta gctcagattc ctgggcccat 1200

gtgcccttgc ctgagatagc ccctccagat cctttcctat accacggtag tagaccttgc 1260

cttacatctg aagttactag gaagtggaca tgactcagtg gcaccatcaa gggactacta 1320

agagaagtat tagatggtgc cagaaggtaa agattgccaa agactctgat ctcacctcac 1380

tgtcttattt tcaggcgttt gaaaactca 1409

<210> 23

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

actcttttct tttctaagca ttattgttta gagagcttcc aagacacata gttaccctca 60

tctcttgtgg ccttccacaa tctattctcc atattttcac agcttaactt tgcatagaga 120

agccacatct agctctcctt cacatttgaa gaatgcagtg attataaaag attgtctttt 180

gccttgctta gggagtctta cactggcaga aacgctgaag aatccaattc tcattcacct 240

tttccttgga tgtgtgtctc agtagtggta atggtttttc cgcatttcct ccatcagcag 300

ttacagcaga gggaaaagac acatgactgt tctgttcatc tctgaactct ctgactcctt 360

cttcatgttt ggtggagtcc cttttgcatg attgtcttaa agaatatgag agaaattgtt 420

taatgagaat tgttttaata atgagagaaa atgagacacc tatatgcctg tggggaaggc 480

acaaaatatg gcatgttctt caagcttctg tgtcccactt gggaagctgt gaaaggccta 540

gtcctaagtc tgtctctgta caaaaagcat agcttacaca taagcaagtt tcatgtctta 600

actttgccca tctccagttt cttggcttct ggtcacatcg tttatgtatt tgtattcttt 660

agtcaagaga aaaaagaatg gtgagacaga aatgtaatgg gttcccagat ctcaaatcct 720

aagcaacagc tgtgctttga gattctttcc aaatggcaga gtagtttatt tggtctttca 780

tgattcacag aaaaaaaaca aaaaaacaaa aaacaaaaaa cctatcacta ttttgtaatt 840

tagttgaatg taagaagcaa gccaagatat tcaataatag ttgtggggac ttgagtcaaa 900

cccagctctt caaattctag aaatgtttga aataaccaaa ttatctatgc ccatatgcct 960

gtataagcta tatcaaagta tatactttgt gagcaatgtg ctgaatcaca aaagagtcag 1020

aattggattt gacaccatat gaataaagac acccagaatc ttacatcatt tggaaaacta 1080

gtcgtgacat taatatgcaa ttagctggaa agttataaga tgcaccacaa acacatctta 1140

tatgcactat aaattaccac acaaagatca tgcttaaaaa caacacagtt aaaatcctaa 1200

atctcaggcc accatacttt cccacccctg ttcctgagca gggatgctag cacctgacct 1260

agaaacactg ttagcctaaa aagatctcac catagcctat cattcagata ccatgacaag 1320

tctgcttcta ggcattatgg gtatatgaac agcttaagtt tcactccttg gaatatttct 1380

attttattag aggctaccgg tgggagttat 1410

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tggagcaggt tgcatggcga ggg 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggagcgatct cattttccac tgg 23

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

taggtggagc aggttgcatg gcgaggg 27

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccctcgccat gcaacctgct cca 23

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaacccctcg ccatgcaacc tgctcca 27

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

taggggagcg atctcatttt ccactgg 27

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccagtggaaa atgagatcgc tcc 23

<210> 31

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aaacccagtg gaaaatgaga tcgctcc 27

<210> 32

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttaaaggat cc 132

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

actgtgcaga aaaggcaaca ggcta 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tcctgggacc tactctctcc ttgtg 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tttacatggc atgcccacaa tggtt 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

attccacctt cactgagttc cctcc 25

<210> 37

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

actcctggca gcaacggaga a 21

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tgggtctgga gcacgttctt tt 22

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gtcccctcgc catgcaacct 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gcatcgccga cagaatgccc 20

<210> 41

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tcaccatctt ccaggagcga ga 22

<210> 42

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gaaggccatg ccagtgagct t 21

Claims

1.一种人源化CD20基因，其特征在于，所述的人源化CD20基因包含人CD20基因的部分。

2.根据权利要求1所述的人源化CD20基因，其特征在于，所述的人CD20基因的部分包含人CD20基因的1号至7号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化CD20基因包含人CD20基因的2号至7号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人CD20基因的2号至7号外显子的全部或部分至少包含人CD20基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和/或7号外显子的部分核苷酸序列，其中2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人源化CD20基因，其特征在于，所述的人CD20基因的部分包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化CD20基因，其特征在于，所述的人源化CD20基因中还包括非人动物CD20基因的部分，优选的，所述的非人动物CD20基因的部分包含非人动物CD20基因的1号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的非人动物CD20基因的部分还包含2号外显子的部分和/或7号外显子的部分。

5.根据权利要求1-4任一所述的人源化CD20基因，其特征在于，所述的人源化CD20基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；

B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，

E)SEQ ID NO：6和/或7所示的核苷酸序列。

6.一种人源化CD20蛋白，其特征在于，所述的蛋白由权利要求1-5任一所述的人源化CD20基因编码。

7.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD20蛋白的核苷酸序列的全部或部分；

B)编码人CD20蛋白的胞外区、跨膜区和/或胞质区的的全部或部分核苷酸序列；

C)人或人源化CD20基因；或，

D)人CD20基因的1号外显子至7号外显子的全部或部分，优选包含2号至7号外显子的全部或部分，进一步优选人CD20基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和/或7号外显子的部分，其中2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，7号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

8.根据权利要求7所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000085.7的序列至少具有90％的同源性，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示或如SEQ ID NO：22所示，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000085.7的序列至少具有90％的同源性；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ IDNO：4所示或如SEQ ID NO：23所示。

9.一种CD20基因人源化非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CD20蛋白。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CD20蛋白为权利要求6所述的人源化CD20蛋白。

11.根据权利要求9或10所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含权利要求1-5任一所述的人源化CD20基因。

12.根据权利要求9-11任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物CD20基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化CD20蛋白的核苷酸序列的全部或部分；

C)人或人源化CD20基因；或，

13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的供体核苷酸序列在非人动物中中通过内源调控元件进行调控。

14.根据权利要求12-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或***，任选地，所述的导入非人动物CD20基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物CD20基因的2号外显子的部分、3号至6号外显子的全部和/或7号外显子的部分被替换。

15.根据权利要求9-14任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求7-8任一所述的靶向载体进行非人动物的构建。

16.根据权利要求9-15任一所述的构建方法，其特征在于，进一步包括所述的人源化非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、TNFA、41BB、41BBL、CTLA4、CD47、SIRPA、OX40、TIM3和CD226中的至少一种。

17.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官表达权利要求6所述的人源化CD20蛋白，所述的细胞、组织或器官包含权利要求1-5任一所述的人源化CD20基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求9-16任一所述的构建方法获得的非人动物。

18.一种荷瘤后的瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织表达权利要求6所述的人源化CD20蛋白，所述的瘤组织包含权利要求1-5任一所述的人源化CD20基因，或者，所述的瘤组织来源于权利要求9-16任一所述的构建方法获得的非人动物。

19.一种权利要求1-5任一所述的人源化CD20基因、权利要求6所述的人源化CD20蛋白、权利要求9-16任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求17所述的细胞、组织或器官或权利要求18所述的瘤组织的应用，其特征在于，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与CD20相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与CD20相关的模型***中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与CD20相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人CD20信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究CD20基因功能，研究针对人CD20靶位点的药物、药效，研究与CD20相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

20.根据权利要求4-5任一所述的人源化CD20基因、权利要求6所述的人源化CD20蛋白、权利要求9-16任一所述的构建方法、权利要求17所述的细胞、组织或器官、权利要求18所述的瘤组织或权利要求19所述的应用，其特征在于，所述非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。