CN111705084B

CN111705084B - 一种稳定表达荧光素酶及人cd20敲除鼠cd20的小鼠b细胞淋巴瘤细胞系构建方法

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Publication number: CN111705084B
Application number: CN202010828247.8A
Authority: CN
Inventors: 赵静; 琚存祥; 于薇薇; 鞠超
Original assignee: Gempharmatech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-12-08
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN111705084A

Abstract

本发明涉及稳定表达荧光素酶及人源CD20的小鼠B细胞淋巴瘤A20‑hCD20(Tg)‑mCD20(KO)‑Luciferase细胞系构建方法。该细胞系利用电转将带有Luciferase荧光素酶及人CD20基因的转基因质粒和鼠CD20基因敲除的sgRNA共转A20细胞系，得到稳定表达人CD20及荧光素酶同时敲除细胞系自身鼠源CD20基因的A20细胞系。通过转基因质粒上Neo抗性元件进行筛选，获得能稳定传代的单克隆，实现了荧光素酶及人CD20基因稳定表达，鼠CD20基因敲除。本发明的细胞株为CD20为靶点的药物的小鼠体内药效评估提供了可测量及可视化的模型。

Description

一种稳定表达荧光素酶及人CD20敲除鼠CD20的小鼠B细胞淋巴瘤细胞系构建方法

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及小鼠B细胞淋巴瘤A20细胞系的构建，尤其基于基因编辑技术的稳定表达荧光素酶及人CD20敲除鼠CD20的小鼠B细胞淋巴瘤A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系的构建方法。

背景技术

淋巴瘤是发生于淋巴***的全球最常见的十大恶性肿瘤之一，其在中国发病率也呈现逐年上升的态势，位居恶性肿瘤发病率前十位，死亡率高居前列。目前临床中淋巴瘤具有分类复杂、异质性高的特点，主要分为非霍奇金性淋巴瘤（弥漫性B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性淋巴瘤）及霍奇金性淋巴瘤，不同类型淋巴瘤的临床治疗策略均不相同，其中CD20作为表达在恶性B淋巴细胞表面的跨膜蛋白，参与B细胞的激活及分化。由于CD20在抗体结合后没有内化或下调，同时并不表达在前体B细胞和产生抗体的浆细胞中，不会影响正常B细胞的功能，因此成为目前临床治疗B细胞非霍奇金性淋巴瘤的理想靶点。

靶向CD20的单克隆抗体利妥昔单抗是第一个批准用于临床B细胞非霍奇金性淋巴瘤治疗的人鼠嵌合抗体，单独使用或与化疗联用开创了淋巴瘤免疫治疗的新模式。其主要通过抗体依赖性细胞毒作用ADCC和补体依赖性细胞毒作用CDC等通过NK细胞及补体途径发挥杀伤肿瘤的作用。与此同时，二代靶向CD20抗体如ofatumumab、ocrelizumab、veltuzumab等多数处于临床研究及前期研发阶段，其更高水平人源化结构（~90-100%）降低了一代抗体免疫原性较高引起的毒副作用，在淋巴瘤临床治疗中拥有广泛的应用前景。基于CD3和CD20的双特异性抗体也是CD20靶点研发的又一重要方向，目前已在临床评估中的mosunetuzumab和CD20-TCB在复发及难治的B细胞非霍奇金淋巴瘤治疗中表型出良好的疗效，同时还能增加CAR-T疗法的临床患者响应。这类基于CD3-CD20的双特异性抗体作为纽带一方面可以识别表达在T细胞表面的CD3分子，同时识别表达在B细胞淋巴瘤细胞表面的CD20抗原分子，激发T细胞对CD20阳性淋巴瘤细胞的特异性杀伤作用。

目前已有的临床前动物肿瘤建模模型无法满足既拥有健全的免疫***，又能直接评价CD20人源抗体通过作用于人源CD20蛋白的抗肿瘤作用。我们通过构建稳定表达人CD20敲除鼠CD20基因修饰的A20细胞模型，结合BALB/c野生型小鼠及BALB/c人源化hCD3E小鼠可用于靶向CD20抗体及CD3-CD20双特异性抗体的药物研发。此外，通过在稳定表达人CD20敲除鼠CD20基因修饰的A20细胞中过表达荧光素酶，可以借助活体成像***观察肿瘤细胞在动物体内的生长转移情况，为药物的抗肿瘤效果评估提供了可视化的模型。因此，构建基于稳定表达荧光素酶及人CD20敲除鼠源CD20的小鼠B细胞淋巴瘤A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase的A20细胞系结合人源化小鼠可以弥补国内外靶向CD20及CD3-CD20双特异性抗体药物临床前评价模型的缺失。

发明内容

为解决现有技术中临床前动物肿瘤模型的不足，本申请提供了一种构建稳定表达人源CD20和荧光素酶，敲除鼠源CD20基因修饰的A20细胞模型，该细胞模型结合BALB/c野生型小鼠及BALB/c人源化hCD3E小鼠可用于靶向CD20抗体及CD3-CD20双特异性抗体的药物药效的评价，同时可以借助活体成像***观察肿瘤细胞在动物体内的生长转移情况，为以CD20为靶点的药物的小鼠体内药效评估提供了皮下可测量及体内转移可视化的模型。

为解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定表达荧光素酶及人源CD20敲除鼠源CD20的小鼠B细胞淋巴瘤A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系的制备方法，其特征在于：利用电转将带有Luciferase荧光素酶以及人源CD20基因的转基因质粒和鼠源CD20基因敲除的sgRNA共转A20细胞，得到稳定表达人源CD20及荧光素酶同时敲除细胞系自身鼠源CD20基因的A20细胞系。

进一步地，本发明A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系的制备方法，还包括细胞系鉴定步骤；更进一步地，所述细胞系鉴定步骤包括Luciferase荧光素酶活性鉴定和/或mRNA检测。

优选地，本发明A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系的制备方法，在所述转基因质粒中加入Neo元件，用于细胞药筛。

在一个实施方式中，本发明A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系的制备方法，具体包括如下步骤：

1）构建稳定表达Luciferase荧光素酶以及人源CD20的转基因质粒；

2）构建sgRNA用于鼠源CD20的敲除：在A20细胞的CD20基因的exon1的5’端和exon7的3’端设计sgRNA；

3）A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系构建：将步骤1）获得的转基因质粒及步骤2）获得的sgRNA共转A20细胞系；

4）A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系鉴定筛选。

进一步地，步骤1）中，选取人源CD20基因CDS序列（SEQ ID NO：1）及 Luciferase基因（SEQ ID NO：2）构建转基因质粒。

进一步地，步骤1）中，通过HindIII+ASC1酶切、高保真酶PCR扩增、sLIC连接、质粒PCR鉴定和Not1线性化酶切鉴定构建筛选稳定表达Luciferase荧光素酶以及人源CD20的转基因质粒。

优选地，步骤1）中，高保真酶PCR扩增引物为：

GTAAAACGACGGCCAGTGCCTAGGTCCCTCGAGGGGATCCACGAATTCCTGCAGCCTAATGTGTGGGCGTGGGGACCCCTAAGTATAGT（GPT000292-3-pro-F, SEQ ID NO：3）；

GGTGGCGGCCGGAGTTCAGTGGGTGCAGT

（GPT000292-3-pro-R, SEQ ID NO：4）；

ACTGAACTCCGGCCGCCACCATGACAACACCCAGAAATTC（GPT000292-3-CD20-F, SEQ IDNO：5）；

GCAGCCTGCACCTGAGGAGTTCACAATTTGGACTTTCCGC（GPT000292-3-CD20-R, SEQ IDNO：6）。

优选地，步骤1）中，质粒PCR鉴定引物为：

GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGA（M13F，SEQ ID NO：7）；

GGTGCATAGATCCCTGCTGG（GPT000292-3-seqR1，SEQ ID NO：8）；

CGAAGGTTGTGGATCTGGAT（GPT000292-3-seqF1，SEQ ID NO：9）；

ATGTTGCCAAACTCTAAACC（GPT000292-3-seqR2，SEQ ID NO：10）。

在具体的实施方式中，步骤2）中，包括合成sgRNA上下游引物、退火形成双链并与Bsa I酶切的pUC57kan-T7-delG载体连接转化、PCR鉴定、PCR阳性的单克隆进一步测序、以测序正确的克隆为模板PCR扩增sgRNA转录的DNA产物、并以DNA产物为模板转录sgRNA。

进一步地，步骤2）中，sgRNA的上下游引物选自：

GPT000292-3-CD20-5S1：

ATAGTAGGCTCTGCTGGGAA（GPT000292-3-CD20-5S1-F，SEQ ID NO：11）；

AAACTTCCCAGCAGAGCCTA（GPT000292-3-CD20-5S1-R，SEQ ID NO：12）；

GPT000292-3-CD20-5S2：

ATAGGAGCAGGTTGCATGGCG（GPT000292-3-CD20-5S2-F，SEQ ID NO：13）；

AAACCGCCATGCAACCTGCTC（GPT000292-3-CD20-5S2-R，SEQ ID NO：14）；

GPT000292-3-CD20-3S1：

ATAGGAGCGATCTCATTTTCCAC（GPT000292-3-CD20-3S1-F，SEQ ID NO：15）；

AAACGTGGAAAATGAGATCGCTC（GPT000292-3-CD20-3S1-R，SEQ ID NO：16）；

GPT000292-3-CD20-3S2：

ATAGGCAAGGATTCCTGCTCTT（GPT000292-3-CD20-3S2-F，SEQ ID NO：17）；

AAACAAGAGCAGGAATCCTTGC（GPT000292-3-CD20-3S2-R，SEQ ID NO：18）。

进一步地，步骤2）中，PCR鉴定和测序引物序列为： TTGTACTGAGAGTGCACCATATG（pUC57-T7-F，SEQ ID NO：19）；

进一步地，步骤2）中，在以测序正确的克隆为模板PCR扩增sgRNA转录的DNA产物中，PCR扩增引物为TCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG（sgRNA-universal-PCR-F，SEQ ID NO：20）；AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTC（sgRNA-universal-PCR-R，SEQ ID NO：21）。

进一步地，步骤3）中，还包括Neo抗性G418压力筛选以及单克隆挑选。

优选地，Neo抗性G418压力筛选的工作浓度为300-500 μg/mL，更优选400 μg/mL。

在一个实施方式中，步骤4）A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系鉴定包括荧光素酶活性鉴定以及mRNA检测。

在具体的实施方式中，步骤4）mRNA检测中，鉴定表达人CD20及荧光素酶的引物序列为：

5’connector：

F1: CTGTCACCTGATGTCTATCAGCG（hCD20-tF1，SEQ ID NO：22）；

R1: GCCCATTCATAATCTGGACAGC（GPT000292-1-hCD20-tR1，SEQ ID NO：23）。

3’connector：

F2: AAGAGATCGTGGATTACGTCGC（GPT000292-3-luciferase-tF1，SEQ ID NO：24）；

R2：CTTTGTTCATGGCAGCCAGC（Rabbit-PloyA-TR，SEQ ID NO：25）。

内参：

CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT（42，SEQ ID NO：26）；

GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC（43，SEQ ID NO：27）。

在具体的实施方式中，步骤4）mRNA检测中，鉴定敲除鼠源CD20基因引物序列为：

KO：

F1：ATGTGCCCTTGCCTGAGATAG（GPT000292-3-mCD20-KO-tF1，SEQ ID NO：28）；

R1：GCGTTTCTGCCAGTGTAAGACTC（GPT000292-3-mCD20-KO-tR1，SEQ ID NO：29）。

WT：

F2：CGAGACATACAGCCACTTTCTCAG（GPT000292-3-mCD20-wt-tF1，SEQ ID NO：30）；

R2：ATGCAACCCAAGCATCTGGAC（GPT000292-3-mCD20-wt-tR1，SEQ ID NO：31）。

在一个优选的实施方式中，步骤4）mRNA检测中，测序引物序列为ATGTGCCCTTGCCTGAGATAG（SEQ ID NO：32）。

本发明还提供了采用本发明方法制备得到的能够稳定表达荧光素酶及人源CD20并敲除鼠源CD20的小鼠B细胞淋巴瘤A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系。

本发明还提供了一种评估靶向CD20或CD3-CD20双特异性抗体药物药效的方法，其特征在于，采用本发明方法构建的A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase A20细胞评价所述药物的药效。

本发明还提供了一种筛选靶向CD20或CD3-CD20双特异性抗体药物的方法，其特征在于，采用本发明方法构建的A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase A20细胞对药物进行筛选。

本发明相对于现有技术的有益效果：

1）现有技术中用于临床前的动物肿瘤模型无法满足既拥有健全的免疫***，又能直接评价CD20人源抗体通过作用于人源CD20蛋白的抗肿瘤作用，而采用本发明方法构建的小鼠细胞模型：能够稳定表达人源CD20，同时敲除鼠源CD20基因；

2）本发明的方法确定了适合的质粒PCR扩增引物和鉴定引物，获得优异的特异性，可高效的筛选和鉴定质粒；以及构建了合适的用于敲除鼠源CD20的sgRNA，提高了鼠源CD20的敲除率；

3）采用本发明方法构建的稳定表达人源CD20敲除鼠源CD20基因修饰的A20细胞模型，结合BALB/c野生型小鼠及BALB/c人源化hCD3E小鼠可用于靶向CD20抗体及CD3-CD20双特异性抗体的药物的药效评估；

4）通过在稳定表达人源CD20敲除鼠源CD20基因修饰的A20细胞中过表达荧光素酶，可以借助活体成像***观察肿瘤细胞在动物体内的生长转移情况，为药物的抗肿瘤效果评估提供了可视化的模型。

附图说明：

图1 稳定表达荧光素酶及人源CD20质粒构建策略

图2 GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG质粒图谱

图3 GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG质粒鉴定跑胶图

图4 GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG质粒酶切鉴定跑胶图

图5 鼠源CD20敲除策略

图6 A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞荧光成像图

图7 A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞单克隆电泳图

具体实施方式

以下通过实施例方式对本发明的技术方案进一步说明。

实施例1 构建稳定表达荧光素酶及人源CD20转基因质粒

选取人源CD20基因CDS序列（SEQ ID NO：1）及Luciferase基因（SEQ ID NO：2）按图1所示策略构建转基因载体GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG，质粒图谱如图2所示。

具体操作步骤如下：

（1）用HindIII+ASC1酶切V42#（5170bp/1831bp），回收5170bp的片段；

（2）高保真酶PCR扩增GPT000292-3-pro, GPT000292-3-CD20片段，对应模板见表1

表1 扩增引物表

（3）GPT000292-3-pro,GPT000292-3-CD20与HindIII+ASC1酶切的V42#进行sLIC连接，按照表2所示引物对质粒进行鉴定，质粒鉴定跑胶图如图3所示。鉴定成功的载体命名为GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG；

表2 GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG质粒鉴定引物

（4）Not1线性化酶切质粒GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG，回收8297bp片段用于电转，GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG酶切鉴定方案如表3所示，跑胶图如图4所示。

表3 GPT000292-3-dsDNA-hCD20-TG质粒酶切鉴定方案

实施例2 构建sgRNA用于鼠源CD20的敲除

为防止人源CD20和小鼠细胞系的CD20有同源区域，sgRNA的设计需要避开基因的外显子，同时考虑提高敲除效率，sgRNA将donor切割，本发明在exon1的5’端和exon7的3’端设计sgRNA，筛选发生移码突变的细胞克隆，鼠源CD20敲除策略如图5所示。

根据CRISPR Cas9技术，分别在鼠源CD20 exon1的5’端和exon7的3’端分别设计了2条sgRNA。具体步骤如下：

（1）分别合成sgRNA上下游引物，引物纯化方式为PAGE，引物序列如表4；

表4 sgRNA构建引物表

（2）sgRNA上下游引物分别稀释至100 μmol/μL，以1:1的配比混匀，95℃反应5min，室温自行缓慢退火；（3）退火形成的双链与Bsa I 酶切的 pUC57kan-T7-delG 载体连接2h，转化，涂布Kan+平板；

（4）挑取单克隆，进行PCR鉴定，PCR鉴定方案见表5；

表5 sgRNA PCR鉴定方案

（5）PCR阳性的单克隆进一步测序确认，测序引物为pUC57-T7-F；

（6）以测序正确的克隆为模板，用表6引物PCR扩增sgRNA转录的DNA产物；

表6 sgRNA 转录模板PCR制备

（7）参照转录试剂盒说明书，以sgRNA转录的DNA产物为模板，转录sgRNA并进一步纯化。

实施例3 . A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系构建及鉴定

1、A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系构建

（1）G418抗性筛选最佳工作浓度确定

A20 细胞培养条件为含有10%胎牛血清的1640培养基，37℃，5% CO₂；取对数生长期的A20细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/mL，1×10⁵个细胞每孔接种到24孔板中培养过夜，Neo抗性G418倍比稀释得到0-800 μg/mL 9个梯度加入 24孔板中进行抗性压力筛选，每种浓度设置1个复孔。后续观察A20细胞的生长情况，在5-7天内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为筛选转染A20细胞的最佳工作浓度400 μg/mL。

（2）A20细胞转染

取对数生长期的A20细胞，转染前1天将细胞接种于10-cm dish，24 h内待细胞融合度达到60%-80% 即可转染；转染按照LONZA电转仪（Ⅰ/Ⅱ/2b）仪器使用说明书进行操作，将带有Luciferase荧光素酶及人源CD20基因的转基因质粒和鼠源CD20基因敲除的sgRNA转染入A20细胞；转染后置于细胞培养箱中继续培养；

（3）A20转染细胞抗性压力筛选及单克隆挑选

质粒及sgRNA转染后48 h，选取相同的传代密度未转染的A20细胞作为对照，加入Neo抗性G418，定期换液；待未转染的A20细胞全部死亡后，即筛选得到转染成功的A20细胞。将通过抗性筛选的A20细胞重悬为单细胞悬液，通过有限稀释的方法在96孔中获得单一克隆细胞，继续扩增培养即获得稳定表达荧光素酶及人源CD20的小鼠B细胞淋巴瘤A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO) -Luciferase细胞系。

2、A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞系鉴定

（1）荧光素酶活性鉴定：

A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞浓度分别为 5.0×10⁶/mL，每孔1 mL加入24孔白板中，每组设2个复孔；每孔加10 μL 0.15 mg/mL的荧光素底物，37℃孵育7min，荧光照度计测荧光值；比较各克隆的荧光强度，并分析荧光强度与细胞数之间的相关性。G418抗性对A20细胞株的最佳工作浓度为400 μg/mL。细胞克隆标记如表7，检测荧光强度，结果如表8以及图7所示。根据荧光强度挑选2E12，E11，F8，G8，2H7细胞单克隆。

表7 A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞单克隆铺板情况

表8 A20-hCD20(Tg)-mCD20(KO)-Luciferase细胞荧光成像读值

（2）通过mRNA检测进一步筛选单克隆细胞中稳定表达人源CD20及荧光素酶，同时敲除鼠源CD20基因的克隆，具体鉴定引物信息如表9、表10所示；测序引物信息为ATGTGCCCTTGCCTGAGATAG（SEQ ID NO：32）。

表9 鉴定表达人源CD20及荧光素酶的引物序列

表10 鉴定敲除鼠自身CD20基因引物序列

经PCR和测序确认，2F10，E12，F10，3F10，3G8，H7，3E12，E10，2G9，2G8，2E12，G11，3E11，G10，G9，D12，2E11，G8，E11，H10，F8为阳性，其余为阴性。检测mCD20 KO结果显示2F10，3F10，3E12，3E11，G10，E11克隆KO成功，其余为阴性。细胞单克隆鉴定电泳结果如图7所示，可以确定2F10，3F10，3E12，3E11，G10，E11克隆可用于后续实验。综合荧光成像结果E11克隆可用于后续CD20及CD3-CD20双特异性抗体的体内药效评价。

从上述鉴定来看，本发明成功构建了能够稳定表达荧光素酶以及人源CD20基因敲除鼠源CD20基因的A20细胞模型，其可结合BALB/c野生型小鼠及BALB/c人源化hCD3E小鼠可用于靶向CD20抗体及CD3-CD20双特异性抗体的药物研发，同时能够作为皮下可测量及体内转移可视化的模型。

此外，本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所公开的技术方案，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容，本领域技术人员能够在说明书公开的实施方式基础上直接获得的等同技术方案也在本发明之内。

序列表

<110> 江苏集萃药康生物科技有限公司

<120> 一种稳定表达荧光素酶及人CD20敲除鼠CD20的小鼠B细胞淋巴瘤细胞系构建方法

<141> 2020-08-02

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 891

<212> DNA

<213> 人(human)

<400> 1

atgacaacac ccagaaattc agtaaatggg actttcccgg cagagccaat gaaaggccct 60

attgctatgc aatctggtcc aaaaccactc ttcaggagga tgtcttcact ggtgggcccc 120

acgcaaagct tcttcatgag ggaatctaag actttggggg ctgtccagat tatgaatggg 180

ctcttccaca ttgccctggg gggtcttctg atgatcccag cagggatcta tgcacccatc 240

tgtgtgactg tgtggtaccc tctctgggga ggcattatgt atattatttc cggatcactc 300

ctggcagcaa cggagaaaaa ctccaggaag tgtttggtca aaggaaaaat gataatgaat 360

tcattgagcc tctttgctgc catttctgga atgattcttt caatcatgga catacttaat 420

attaaaattt cccatttttt aaaaatggag agtctgaatt ttattagagc tcacacacca 480

tatattaaca tatacaactg tgaaccagct aatccctctg agaaaaactc cccatctacc 540

caatactgtt acagcataca atctctgttc ttgggcattt tgtcagtgat gctgatcttt 600

gccttcttcc aggaacttgt aatagctggc atcgttgaga atgaatggaa aagaacgtgc 660

tccagaccca aatctaacat agttctcctg tcagcagaag aaaaaaaaga acagactatt 720

gaaataaaag aagaagtggt tgggctaact gaaacatctt cccaaccaaa gaatgaagaa 780

gacattgaaa ttattccaat ccaagaagag gaagaagaag aaacagagac gaactttcca 840

gaacctcccc aagatcagga atcctcacca atagaaaatg acagctctcc t 891

<210> 2

<211> 1650

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagacgcca aaaacataaa gaaaggcccg gcgccattct atcctctaga ggatggaacc 60

gctggagagc aactgcataa ggctatgaag agatacgccc tggttcctgg aacaattgct 120

tttacagatg cacatatcga ggtgaacatc acgtacgcgg aatacttcga aatgtccgtt 180

cggttggcag aagctatgaa acgatatggg ctgaatacaa atcacagaat cgtcgtatgc 240

agtgaaaact ctcttcaatt ctttatgccg gtgttgggcg cgttatttat cggagttgca 300

gttgcgcccg cgaacgacat ttataatgaa cgtgaattgc tcaacagtat gaacatttcg 360

cagcctaccg tagtgtttgt ttccaaaaag gggttgcaaa aaattttgaa cgtgcaaaaa 420

aaattaccaa taatccagaa aattattatc atggattcta aaacggatta ccagggattt 480

cagtcgatgt acacgttcgt cacatctcat ctacctcccg gttttaatga atacgatttt 540

gtaccagagt cctttgatcg tgacaaaaca attgcactga taatgaattc ctctggatct 600

actgggttac ctaagggtgt ggcccttccg catagaactg cctgcgtcag attctcgcat 660

gccagagatc ctatttttgg caatcaaatc attccggata ctgcgatttt aagtgttgtt 720

ccattccatc acggttttgg aatgtttact acactcggat atttgatatg tggatttcga 780

gtcgtcttaa tgtatagatt tgaagaagag ctgtttttac gatcccttca ggattacaaa 840

attcaaagtg cgttgctagt accaacccta ttttcattct tcgccaaaag cactctgatt 900

gacaaatacg atttatctaa tttacacgaa attgcttctg ggggcgcacc tctttcgaaa 960

gaagtcgggg aagcggttgc aaaacgcttc catcttccag ggatacgaca aggatatggg 1020

ctcactgaga ctacatcagc tattctgatt acacccgagg gggatgataa accgggcgcg 1080

gtcggtaaag ttgttccatt ttttgaagcg aaggttgtgg atctggatac cgggaaaacg 1140

ctgggcgtta atcagagagg cgaattatgt gtcagaggac ctatgattat gtccggttat 1200

gtaaacaatc cggaagcgac caacgccttg attgacaagg atggatggct acattctgga 1260

gacatagctt actgggacga agacgaacac ttcttcatag ttgaccgctt gaagtcttta 1320

attaaataca aaggatatca ggtggccccc gctgaattgg aatcgatatt gttacaacac 1380

cccaacatct tcgacgcggg cgtggcaggt cttcccgacg atgacgccgg tgaacttccc 1440

gccgccgttg ttgttttgga gcacggaaag acgatgacgg aaaaagagat cgtggattac 1500

gtcgccagtc aagtaacaac cgcgaaaaag ttgcgcggag gagttgtgtt tgtggacgaa 1560

gtaccgaaag gtcttaccgg aaaactcgac gcaagaaaaa tcagagagat cctcataaag 1620

gccaagaagg gcggaaagtc caaattgtga 1650

<210> 3

<211> 89

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtaaaacgac ggccagtgcc taggtccctc gaggggatcc acgaattcct gcagcctaat 60

gtgtgggcgt ggggacccct aagtatagt 89

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggcggcc ggagttcagt gggtgcagt 29

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

actgaactcc ggccgccacc atgacaacac ccagaaattc 40

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcagcctgca cctgaggagt tcacaatttg gactttccgc 40

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccagggttt tcccagtcac ga 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtgcataga tccctgctgg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgaaggttgt ggatctggat 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgttgccaa actctaaacc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atagtaggct ctgctgggaa 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aaacttccca gcagagccta 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ataggagcag gttgcatggc g 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaaccgccat gcaacctgct c 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ataggagcga tctcattttc cac 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

aaacgtggaa aatgagatcg ctc 23

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ataggcaagg attcctgctc tt 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aaacaagagc aggaatcctt gc 22

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ttgtactgag agtgcaccat atg 23

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctcgcgcgt ttcggtgatg acgg 24

<210> 21

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

aaaaaaagca ccgactcggt gccacttttt c 31

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctgtcacctg atgtctatca gcg 23

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gcccattcat aatctggaca gc 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

aagagatcgt ggattacgtc gc 22

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctttgttcat ggcagccagc 20

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ctaggccaca gaattgaaag atct 24

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtaggtggaa attctagcat catcc 25

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

atgtgccctt gcctgagata g 21

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gcgtttctgc cagtgtaaga ctc 23

<210> 30

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgagacatac agccactttc tcag 24

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atgcaaccca agcatctgga c 21

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

atgtgccctt gcctgagata g 21

Claims

1.一种稳定表达荧光素酶及人源CD20敲除鼠源CD20的小鼠B细胞淋巴瘤A20-hCD20 Tg-mCD20 KO -Luciferase细胞系的制备方法，包括如下步骤：

3）A20-hCD20 Tg -mCD20 KO -Luciferase细胞系构建：将步骤1）获得的转基因质粒及步骤2）获得的sgRNA共转A20细胞系；

4）A20-hCD20 Tg -mCD20 KO -Luciferase细胞系鉴定筛选；

其中，

步骤1）中，选取人源CD20基因CDS序列：SEQ ID NO：1及Luciferase基因：SEQ ID NO：2构建所述转基因质粒；所述转基因质粒中加入Neo元件，用于细胞药筛；

步骤2）具体过程为：

a、分别合成sgRNA上下游引物，引物纯化方式为PAGE，引物序列为：

5’端为：GPT000292-3-CD20-5S1和GPT000292-3-CD20-5S2；其中GPT000292-3-CD20-5S1的引物对由GPT000292-3-CD20-5S1-F：SEQ ID NO：11，和GPT000292-3-CD20-5S1-R：SEQID NO：12组成；GPT000292-3-CD20-5S2的引物对由GPT000292-3-CD20-5S2-F：SEQ ID NO：13，和GPT000292-3-CD20-5S2-R：SEQ ID NO：14组成；

3’端为：GPT000292-3-CD20-3S1和GPT000292-3-CD20-3S2；其中GPT000292-3-CD20-3S1引物对由GPT000292-3-CD20-3S1-F：SEQ ID NO：15，和GPT000292-3-CD20-3S1-R：SEQID NO：16组成；GPT000292-3-CD20-3S2引物对由GPT000292-3-CD20-3S2-F：SEQ ID NO：17，GPT000292-3-CD20-3S2-R：SEQ ID NO：18组成；

b、sgRNA上下游引物分别稀释至100 μmol/μL，以1:1的配比混匀，95℃反应5min，室温自行缓慢退火；

c、退火形成的双链与Bsa I酶切的pUC57kan-T7-delG 载体连接2 h，转化，涂布Kan+平板；

d、挑取单克隆，进行PCR鉴定，PCR鉴定方案为：

；

e、PCR阳性的单克隆进一步测序确认，测序引物为pUC57-T7-F；

f、以测序正确的克隆为模板，用如下引物PCR扩增sgRNA转录的DNA产物；

；

g、参照转录试剂盒说明书，以sgRNA转录的DNA产物为模板，转录sgRNA并进一步纯化；

步骤1）中，通过HindIII+ASC1酶切、高保真酶PCR扩增、sLIC连接、质粒PCR鉴定和Not1线性化酶切鉴定构建筛选稳定表达Luciferase荧光素酶以及人源CD20的转基因质粒；其中，高保真酶PCR扩增引物为GPT000292-3-pro-F：SEQ ID NO：3，GPT000292-3-pro-R：SEQID NO：4；以及GPT000292-3-CD20-F：SEQ ID NO：5，GPT000292-3-CD20-R：SEQ ID NO：6。

2.权利要求1所述的细胞系的制备方法，其特征在于，所述细胞系鉴定步骤包括Luciferase荧光素酶活性鉴定和mRNA检测。

3.权利要求1或2任一项所述的细胞系的制备方法，其特征在于，步骤3）中，还包括将共转后的A20细胞进行Neo抗性G418压力筛选以及单克隆挑选；所述Neo抗性G418压力筛选的工作浓度为400 μg/mL。

4.权利要求2所述的细胞系的制备方法，其特征在于，步骤4）mRNA检测中，鉴定表达人源CD20及荧光素酶的引物序列为：

5’端：hCD20-tF1：SEQ ID NO：22，GPT000292-1-hCD20-tR1：SEQ ID NO：23;

3’端：GPT000292-3-luciferase-tF1：SEQ ID NO：24，Rabbit-PloyA-TR：SEQ ID NO：25。

5.权利要求2所述的细胞系的制备方法，其特征在于，步骤4）mRNA检测中，鉴定敲除鼠源CD20基因引物序列为：GPT000292-3-mCD20-KO-tF1：SEQ ID NO：28，GPT000292-3-mCD20-KO-tR1：SEQ ID NO：29。