CN116420680A

CN116420680A - Igf1r基因人源化非人动物及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN116420680A
Application number: CN202310474470.0A
Authority: CN
Inventors: 赵磊; 周小飞; 沈志远
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-04-28
Filing date: 2023-04-28
Publication date: 2023-07-14
Also published as: WO2023208202A1

Abstract

本发明提供了一种IGF1R基因人源化的非人动物的构建方法，利用同源重组的方法将编码人或人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该非人动物体内能正常表达人或人源化IGF1R蛋白，可以作为人IGF1R信号机理研究、肿瘤及免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种人源化IGF1R基因、一种人源化IGF1R蛋白、一种IGF1R基因的靶向载体，以及上述非人动物及其在生物医药领域的应用。

Description

IGF1R基因人源化非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种IGF1R基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

IGF1R(Insulin-1ike Growth Factor 1Receptor)，中文名为***1受体，属于酪氨酸激酶受体超家族，在人体组织细胞广泛表达，是一种异四聚体跨膜蛋白，由2个α亚基和2个β亚基构成，α亚基与配体***IGF-1、IGF-2或胰岛素结合后，可催化受体自身磷酸化位点(Tyr1131、Tyr1135、Tyr1136)磷酸化，引起蛋白激酶级联反应，促进细胞增殖与分化、抑制凋亡以及发挥促进组织器官生长发育等生物学功能。

研究表明，IGF1R活性增强可促进肿瘤细胞增殖、迁移和浸润，与肿瘤药物耐药、预后不良及生存期短相关，已在多种血液瘤和实体肿瘤(甲状腺癌、乳腺癌、***癌、肺癌等)中检测到其高表达，成为肿瘤治疗潜在靶点。IGF1R不仅仅在肿瘤治疗领域受到广泛关注，在免疫疾病治疗领域也是潜在的重要新靶点。2020年1月FDA批准了Teprotumumab-trbw(简称Teprotumumab，商品名TEPEZZA^TM)，一种靶向IGF1R的全人单克隆抗体拮抗剂，用于治疗甲状腺相关性眼病(TAO)，是FDA批准的第一种也是唯一一种治疗甲状腺相关性眼病的药物。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。

鉴于IGF1R在肿瘤以及甲状腺相关性眼病治疗领域的潜在应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发IGF1R相关信号通路的非人动物模型。

发明内容

本申请通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的***，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。

此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

本发明的第一方面，提供了一种人源化IGF1R蛋白，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白至少100个到至少1367个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、905、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或1367个连续氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的胞外区至少100个到至少905个，例如100、200、300、400、500、600、700、800、876、877、878、879、880、900或905个连续氨基酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白跨膜区的全部或部分。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的跨膜区至少5个到至少24个，例如5、10、15、20、21、22、23或24个连续氨基酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：2的31-959位或58-959位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的31-959位或58-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的胞质区的全部或部分。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白胞质区至少50个到至少410个，例如50、100、150、200、250、300、350、400、407、408、409或410个连续氨基酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的胞外区至少10个到至多50个，例如10、15、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

更优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的信号肽的全部或部分。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的信号肽至少10个到至少30个，例如10、15、20、25、28、29或30个连续氨基酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：1的1-30位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的1-30位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的信号肽和胞质区的全部或部分，优选包含SEQ ID NO：1的1-30位和961-1369位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的1-30位和961-1369位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的全部或部分和非人动物IGF1R蛋白的全部或部分，更优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的胞外区和/或跨膜区的全部或部分，和，非人动物IGF1R蛋白的信号肽、胞外区和/或胞质区的全部或部分。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白中人IGF1R蛋白和非人动物IGF1R蛋白直接连接，或者，通过接头连接，所述的接头可以是任意接头，只要保证发挥完整人源化IGF1R蛋白的功能即可。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含信号肽、跨膜区、胞外区和胞质区，其中，信号肽和胞质区来源于非人动物IGF1R蛋白，跨膜区来源于人IGF1R蛋白，胞外区来源于人IGF1R蛋白的部分(优选为SEQ ID NO：2的58-935位所示氨基酸序列)和非人动物IGF1R蛋白的部分(优选为SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列)。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R基因的全部或部分编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括人IGF1R基因1号至21号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括人IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括人IGF1R基因2号外显子的全部或部分至14号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，更进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，人IGF1R基因2号外显子的部分包含人IGF1R基因2号外显子至少100bp到至少546bp，例如100、200、300、400、467、468、469、470、471、500或546bp连续核苷酸序列，人IGF1R基因14号外显子的部分包含人IGF1R基因14号外显子至少20bp到至少103bp，例如20、30、40、50、60、70、80、90、93、94、95、96、97、100、101、102或103bp连续核苷酸序列。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的氨基酸序列；或者，所述的人源化IGF1R蛋白包含NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括非人动物IGF1R基因的全部或部分编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括非人动物IGF1R基因1号至21号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括非人动物IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分编码的氨基酸序列，更优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括非人动物IGF1R基因14号外显子的全部或部分至21号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，更进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至少5bp到至少103bp，例如5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或103bp连续核苷酸序列，非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因21号外显子至少100bp到至少7648bp，例如100、380、381、382、383、384、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、7600或7648bp连续核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R基因的全部或部分编码的氨基酸序列和非人动物IGF1R基因的全部或部分编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分编码的氨基酸序列，和，非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：7和8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7和8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7和8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7和8所示核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列编码的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列编码的氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列编码的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列编码的氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包含人或人源化IGF1R胞外区。优选还包括人或人源化IGF1R跨膜区。进一步优选还包含人或人源化IGF1R信号肽和/或胞质区。优选的，所述的人源化IGF1R胞外区包括人IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少100个到至少905个，例如100、200、300、400、500、600、700、800、876、877、878、879、880、900或905个连续氨基酸的人IGF1R蛋白的胞外区；进一步优选包含878个连续氨基酸的人IGF1R蛋白的胞外区；更优选包含SEQ ID NO：2的58-935位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的58-935位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R胞外区还包括非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分，优选包含至少10个到至多50个，例如10、15、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸的非人动物IGF1R蛋白的胞外区。进一步优选包含27个连续氨基酸的非人动物IGF1R蛋白的胞外区，更优选包含SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R胞外区包括878个连续氨基酸的人IGF1R蛋白的胞外区，以及，27个连续氨基酸的非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区；优选包含SEQ ID NO：2的58-935位所示氨基酸序列和SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列；其中，人IGF1R蛋白的胞外区的部分(SEQ ID NO：2的58-935位)和非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区的部分(SEQ ID NO：1的31-57位)直接连接或通过接头连接，所述的接头优选为肽接头。

优选的，所述的人源化IGF1R跨膜区包括人IGF1R蛋白的跨膜区的全部或部分，优选包含至少5个到至少24个，例如5、10、15、20、21、22、23或24个连续氨基酸的人IGF1R蛋白的跨膜区，进一步优选包含24个连续氨基酸的人IGF1R蛋白的跨膜区，更优选包含SEQ IDNO：2的936-959位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R信号肽包括人IGF1R蛋白的信号肽的全部或部分，优选包含至少5个到至少30个，例如5、10、15、20、25或30个连续氨基酸的人IGF1R蛋白的信号肽，进一步优选包含SEQ ID NO：2的1-30位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的1-30位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R胞质区包括人IGF1R蛋白的胞质区的全部或部分，优选包含至少50个到至少408个，例如50、100、150、200、250、300、350、400或408个连续氨基酸的人IGF1R蛋白的胞质区，进一步优选包含SEQ ID NO：2的960-1367位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的960-1367位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含下列组中的任一种：

1)人或人源化IGF1R信号肽、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区、非人动物内源IGF1R蛋白的跨膜区、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区；

2)非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、非人动物内源IGF1R蛋白的跨膜区、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区；

3)非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区；

4)非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区、非人动物内源IGF1R蛋白的跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区；

5)人或人源化IGF1R信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、非人动物内源IGF1R蛋白的跨膜区、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区；

6)非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区；

7)非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区；

8)人或人源化IGF1R信号肽、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区；

9)人或人源化IGF1R信号肽、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区、非人动物内源IGF1R蛋白的跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区；

10)非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、非人动物内源IGF1R蛋白的跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区；

11)人或人源化IGF1R信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、非人动物内源IGF1R蛋白的跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区；

12)人或人源化IGF1R信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区；

13)非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区；

14)人或人源化IGF1R信号肽、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区；

15)人或人源化IGF1R信号肽、人或人源化IGF1R胞外区、人或人源化IGF1R跨膜区、人或人源化IGF1R胞质区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包括非人动物内源IGF1R蛋白的信号肽(优选为SEQ ID NO：1的1-30位)、非人动物内源IGF1R蛋白的胞外区(优选为SEQ ID NO：1的31-57位)、人IGF1R蛋白的胞外区(优选为SEQ ID NO：2的58-935位)、人IGF1R蛋白的跨膜区(优选为SEQ ID NO：2的936-959位)、非人动物内源IGF1R蛋白的胞质区(优选为SEQ ID NO：1的961-1369位)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包括将非人动物内源IGF1R蛋白SEQ ID NO：1的58-213位氨基酸序列替换为人IGF1R蛋白或人鼠嵌合IGF1R蛋白的氨基酸序列以获得的人源化IGF1R蛋白，优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括将人IGF1R蛋白SEQ ID NO：2的58-959位氨基酸序列，和，非人动物IGF1R蛋白SEQ ID NO：1的961-1369位氨基酸序列替换非人动物IGF1R蛋白SEQ ID NO：1的58-213位氨基酸序列以获得的人源化IGF1R蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白包括在非人动物内源IGF1R蛋白(SEQ ID NO：1)的57-58位之间***人IGF1R蛋白或人鼠嵌合IGF1R蛋白的氨基酸序列获得的人源化IGF1R蛋白，优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包括用人IGF1R蛋白(SEQID NO：2)的第58-959位氨基酸序列，和，非人动物IGF1R蛋白(SEQ ID NO：1)的第961-1369位氨基酸序列***到非人动物IGF1R蛋白(SEQ ID NO：1)的57-58位氨基酸序列获得的人源化IGF1R蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，

D)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种人源化IGF1R基因，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的部分。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码人IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码人IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码人IGF1R蛋白至少100个到至少1367个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或1367个连续氨基酸序列的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码人IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码人IGF1R蛋白的胞外区至少100个到至少905个，例如100、200、300、400、500、600、700、800、876、877、878、879、880、900或905个连续氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因还包含编码人IGF1R蛋白的跨膜区的全部或部分的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码人IGF1R蛋白的跨膜区至少5个到至少24个，例如5、10、15、20、21、22、23或24个连续氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：2的31-959位或58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2的31-959位或58-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因还包含编码非人动物IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因还包含编码非人动物IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码非人动物IGF1R蛋白的胞质区的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码非人动物IGF1R蛋白的胞质区至少50个到至少410个，例如50、100、150、200、250、300、350、400、407、408、409或410个连续氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码非人动物IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含编码非人动物IGF1R蛋白胞外区至少10个到至多50个，例如10、15、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

再优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码非人动物IGF1R蛋白信号肽的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码非人动物IGF1R蛋白信号肽至少10个到至少30个，优选为10、15、20、25、28、29或30个连续氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：1的1-30位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的1-30位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含编码非人动物IGF1R蛋白的信号肽和胞质区的全部或部分的氨基酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：1的1-30位和961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1的1-30位和961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码上述的人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包括人IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的2号外显子的全部或部分至14号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分的核苷酸序列，其中，人IGF1R基因2号外显子的部分包含人IGF1R基因2号外显子至少100bp到至少546bp，例如100、200、300、400、467、468、469、470、471、500或546bp连续核苷酸序列，优选人IGF1R基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人IGF1R基因14号外显子的部分包含人IGF1R基因14号外显子至少20bp到至少103bp，例如20、30、40、50、60、70、80、90、93、94、95、96、97、100、101、102或103bp连续核苷酸序列，优选人IGF1R基因14号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或者，所述的人源化IGF1R基因包含NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包括非人动物IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选的，所述的人源化IGF1R基因包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的全部或部分至21号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分的核苷酸序列，其中，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至少5bp到至少103bp，例如5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或103bp连续核苷酸序列，或者，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至多20bp，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因21号外显子至少100bp到至少7648bp，例如100、380、381、382、383、384、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、7600或7648bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因还包含辅助序列，优选的，所述的辅助序列选自WPRE序列、3’UTR、polyA序列和/或STOP序列中一种、两种或三种以上的组合。

优选的，所述的人源化IGF1R基因还包含SEQ ID NO：13和/或14所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包括人IGF1R基因2号外显子的全部或部分至14号外显子全部或部分编码区的核苷酸序列，和，非人动物IGF1R基因14号外显子的全部或部分至21号外显子全部或部分编码区的核苷酸序列，优选的，所述的人源化IGF1R基因包括人IGF1R基因2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分的核苷酸序列(优选为编码区的核苷酸序列)，以及，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分的核苷酸序列(优选为编码区的核苷酸序列)。

优选的，所述的人源化IGF1R基因中，人IGF1R基因的部分和非人动物IGF1R基因的部分直接相连，或者，通过接头相连，所述的接头可以是任意接头，只要保证发挥完整人源化IGF1R基因的功能即可。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因包括SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物IGF1R基因的部分(优选包含非人动物IGF1R基因1号外显子的全部和2号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子)、人IGF1R基因的部分(优选包含人IGF1R基因1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选包含2号外显子的全部或部分至14号外显子的全部或部分，更优选包含2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分编码区的核苷酸序列)、非人动物IGF1R基因的部分(优选包含非人动物14号外显子的全部或部分至21号外显子的全部或部分，进一步优选包含14号外显子的部分，15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码区的核苷酸序列)、辅助序列、非人动物IGF1R基因2号外显子的部分和3号至21号外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物IGF1R基因的部分(优选包含非人动物IGF1R基因1号外显子的全部和2号外显子的部分，优选还包含1-2号内含子)、人IGF1R基因的部分(优选包含人IGF1R基因1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选包含2号外显子的全部或部分至14号外显子的全部或部分，更优选包含2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分编码区的核苷酸序列)、非人动物IGF1R基因的部分(优选包含非人动物14号外显子的全部或部分至21号外显子的全部或部分，进一步优选包含14号外显子的部分，15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码区的核苷酸序列)、辅助序列、非人动物IGF1R基因3号至21号外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物1号外显子的全部和2号外显子的部分、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、辅助序列、非人动物IGF1R基因2号外显子的部分和3号至21号外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物1号外显子的全部和2号外显子的部分、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、辅助序列、非人动物IGF1R基因3号至21号外显子的全部。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物1号外显子的全部和2号外显子的部分、NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列、SEQ ID NO：8、辅助序列、非人动物IGF1R基因2号外显子的部分和3号至21号外显子的全部。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物1号外显子的全部和2号外显子的部分、NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列、SEQ ID NO：8、辅助序列、非人动物IGF1R基因3号至21号外显子的全部。

优选的，所述的人源化IGF1R基因还包含SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ IDNO：9或12所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物1号外显子的全部和2号外显子的部分、SEQ ID NO：9或12、非人动物IGF1R基因2号外显子的部分和3号至21号外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IGF1R基因从5’端到3’端依次包括非人动物1号外显子的全部和2号外显子的部分、SEQ ID NO：9或12、非人动物IGF1R基因3号至21号外显子的全部。

优选的，所述的人源化IGF1R基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列；

B)与SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

C)与SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

D)具有SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化IGF1R基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素***(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬***(Tamoxifen System)。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含下列组中的一种：

A)人IGF1R基因的部分，优选包含人IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选包含人IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选包含人IGF1R基因的2号外显子的全部或部分至14号外显子的全部或部分，更进一步优选包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分编码区的核苷酸序列，其中，人IGF1R基因2号外显子的部分包含人IGF1R基因2号外显子至少100bp到至少546bp，例如100、200、300、400、467、468、469、470、471、500或546bp连续核苷酸序列，优选人IGF1R基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人IGF1R基因14号外显子的部分包含人IGF1R基因14号外显子至少20bp到至少103bp，例如20、30、40、50、60、70、80、90、93、94、95、96、97、100、101、102或103bp连续核苷酸序列，优选人IGF1R基因14号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选的，所述的人IGF1R基因的部分包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或者，所述的人IGF1R基因的部分包含NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，

B)编码人IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码人IGF1R蛋白胞外区的全部或部分的核苷酸序列，更优选包含编码人IGF1R蛋白胞外区至少100个到至少905个，例如100、200、300、400、500、600、700、800、876、877、878、879、880、900或905个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码人IGF1R蛋白跨膜区的全部或部分的核苷酸序列，更进一步优选包含编码人IGF1R蛋白跨膜区至少5个到至少24个，例如5、10、15、20、21、22、23或24个连续氨基酸的核苷酸序列，再优选包含编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有与编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含下列组中的一种：

C)非人动物IGF1R基因的部分，优选包含非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选包含非人动物IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的全部或部分至21号外显子的全部或部分，更进一步优选包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码区的核苷酸序列，其中，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至少5bp到至少103bp，例如5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或103bp连续核苷酸序列，或者，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至多20bp，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因21号外显子至少100bp到至少7648bp，例如100、380、381、382、383、384、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、7600或7648bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选所述的非人动物IGF1R基因的部分包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，

D)编码非人动物IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码非人动物IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码非人动物IGF1R蛋白胞质区的全部或部分的核苷酸序列，更优选包含编码非人动物IGF1R蛋白胞质区至少50个到至少410个，例如50、100、150、200、250、300、350、400、407、408、409或410个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选包含编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有与编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体包含下列组中的一种：

E)编码上述的人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列；或，

F)上述的人源化IGF1R基因。

优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物IGF1R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选的，所述的5’臂为与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：3或5，在本发明的一个具体实施方式中，所述的5’臂序列如SEQ ID NO：3或5所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，其选自非人动物IGF1R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，优选的，所述的3’臂为与NCBI登录号为NC_000073.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列包含SEQ ID NO：4、6或32，在本发明的一个具体实施方式中，所述的3’臂序列如SEQ ID NO：4、6或32所示。

在本发明一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含5’臂和3’臂，所述的5’臂序列包含SEQ ID NO：3所示核苷酸序列，所述的3’臂序列包含SEQ ID NO：4所示核苷酸序列；或者，所述的5’臂序列包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的3’臂序列包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；或者，所述的5’臂序列包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列，所述的3’臂序列包含SEQ ID NO：32所示核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：13和/或14所示核苷酸序列。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子上，进一步优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物IGF1R基因的2号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-F)任一所述的核苷酸序列、3’同源臂。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括辅助序列，优选的，所述的辅助序列选自WPRE序列、3’UTR、polyA序列和/或STOP序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体从5’端到3’端依次包括5’同源臂、上述A)-F)任一所述的核苷酸序列、辅助序列、3’同源臂。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体从5’端到3’端依次包括5’同源臂、SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列、3’同源臂。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述的标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组***。进一步优选的，所述特异性重组***为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组***)。所述的特异性重组***为2个，分别同向装在抗性基因的两侧。

本发明的第四方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物IGF1R基因。其靶位点位于非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子上，优选位于非人动物IGF1R基因的2号外显子上。

优选的，所述的sgRNA在非人动物IGF1R基因上的靶位点包含SEQ ID NO：17、18和/或33所示核苷酸序列。

本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的DNA分子双链的核苷酸序列包含SEQ IDNO：19和SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22，SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：25，SEQID NO：24和SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：34和SEQ ID NO：36，或者，SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：37。

本发明的第六方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。

本发明的第七方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子和/或上述载体的细胞。

本发明的第八方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述的载体和/或上述细胞在IGF1R基因编辑中的应用。

优选的，所述的应用包括但不限于敲除、***或替换。

本发明的第九方面，提供了一种IGF1R基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化IGF1R蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白为上述的人源化IGF1R蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源IGF1R蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白至少100个到至少1367个，例如100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、905、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或1367个连续氨基酸的核苷酸序列。

更优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ ID NO：2的31-959位或58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-959位或58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的胞外区至少100个到至少905个，例如100、200、300、400、500、600、700、800、876、877、878、879、880、900或905个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ IDNO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码具有SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的跨膜区的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的跨膜区至少5个到至少24个，例如5、10、15、20、21、22、23或24个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述非人动物的基因组中包含编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码具有SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中还包含编码非人动物IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选的，所述的非人动物的基因组中还包含编码非人动物IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列，更优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码非人动物IGF1R蛋白的胞质区的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码非人动物IGF1R蛋白的胞质区至少50个到至少410个，例如50、100、150、200、250、300、350、400、407、408、409或410个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码具有SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的核苷酸序列。

更进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码非人动物IGF1R蛋白的胞外区的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码非人动物IGF1R蛋白的胞外区至少10个到至多50个，例如10、15、20、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列差异10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码具有SEQ ID NO：1的31-57位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的核苷酸序列。

再优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码非人动物IGF1R蛋白的信号肽的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码非人动物IGF1R蛋白的信号肽至少10个到至少30个，例如10、15、20、25、28、29或30个连续氨基酸的核苷酸序列；进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码SEQ ID NO：1的1-30位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1的1-30位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQID NO：1的1-30位所示氨基酸序列差异10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码具有SEQ ID NO：1的1-30位所示氨基酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含编码非人动物IGF1R蛋白的信号肽和胞质区的全部或部分的氨基酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：1的1-30位和961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1的1-30位和961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的部分的核苷酸序列，和，编码非人动物IGF1R蛋白的部分的核苷酸序列，所述的编码人IGF1R蛋白的部分的核苷酸序列和非人动物IGF1R蛋白的部分的核苷酸序列直接连接，或者通过接头连接，所述的接头可以是任意接头，只要保证编码的IGF1R蛋白发挥完整人源化IGF1R蛋白的功能即可。

优选的，所述的非人动物的基因组中包括人IGF1R基因1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选包括人IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选包括人IGF1R基因2号外显子的全部或部分至14号外显子的全部或部分，更进一步优选包括人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分编码区的核苷酸序列，其中，人IGF1R基因2号外显子的部分包含人IGF1R基因2号外显子至少100bp到至少546bp，例如100、200、300、400、467、468、469、470、471、500或546bp连续核苷酸序列，优选人IGF1R基因2号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；人IGF1R基因14号外显子的部分包含人IGF1R基因14号外显子至少20bp到至少103bp，例如20、30、40、50、60、70、80、90、93、94、95、96、97、100、101、102或103bp连续核苷酸序列，优选人IGF1R基因14号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：7所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：7所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：7所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或者，所述的非人动物的基因组中包含NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包括非人动物IGF1R基因1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选包括非人动物IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选包括非人动物IGF1R基因14号外显子的全部或部分至21号外显子的全部或部分，更进一步优选包括非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码区的核苷酸序列，其中，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至少5bp到至少103bp，例如5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或103bp连续核苷酸序列，或者，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至多20bp，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因21号外显子至少100bp到至少7648bp，例如100、380、381、382、383、384、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、7600或7648bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQID NO：9或12所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化IGF1R基因。

优选的，所述的非人动物的至少一个细胞的基因组中包含编码人IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列、人IGF1R基因的部分或上述的人源化IGF1R基因。

优选的，编码人IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列、人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性IGF1R基因的内源调控元件。

优选的，所述的非人动物通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座构建获得：

B)编码人IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码人IGF1R蛋白胞外区的全部或部分的核苷酸序列，更优选包含编码人IGF1R蛋白胞外区至少100个到至少905个，例如100、200、300、400、500、600、700、800、876、877、878、879、880、900或905个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码人IGF1R蛋白跨膜区的全部或部分的核苷酸序列，更进一步优选包含编码人IGF1R蛋白跨膜区至少5个到至少24个，优选为5、10、15、20、21、22、23或24个连续氨基酸的核苷酸序列，再优选包含编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有编码与SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的导入非人动物IGF1R基因座的核苷酸序列还包含：

C)非人动物IGF1R基因的部分，优选包含非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选包含非人动物IGF1R基因1号至21号外显子中的一种、两种或三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分，更优选包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的全部或部分至21号外显子的全部或部分，更进一步优选包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码区的核苷酸序列，其中，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至少5bp到至少103bp，例如5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或103bp连续核苷酸序列，或者，非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因14号外显子至多20bp，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因14号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含非人动物IGF1R基因21号外显子至少100bp到至少7648bp，例如100、380、381、382、383、384、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、7600或7648bp连续核苷酸序列，优选非人动物IGF1R基因21号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列；再优选的，所述的非人动物IGF1R基因的部分包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ IDNO：8所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，

更优选的，所述的非人动物还通过将下列任一核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座构建获得：

E)编码上述的人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列；或，

F)上述的人源化IGF1R基因。

优选的，所述的非人动物通过将SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座构建获得；或者，将包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座构建获得；或者，将包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座构建获得；或者，将包含具有SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座构建获得。

优选的，所述的非人动物使用上述的靶向载体构建。

优选的，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，更优选的，所述其他基因选自EGFR、HER2、VEGFR2、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、CCN2、NKP46、TNFR2、IL-2、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28中的至少一种。

优选的，所述的人或人源化IGF1R基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换或***)基因座为纯合。

优选的，所述的人或人源化IGF1R基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选替换或***)基因座为杂合。

本发明的第十方面，提供了一种IGF1R基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IGF1R蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因。

优选的，所述的非人动物内源IGF1R蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白为上述的人源化IGF1R蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化IGF1R基因。

优选的，所述的非人动物为上述IGF1R基因人源化的非人动物。

优选的，所述的构建方法包括将包含下列任一种的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上：

B)编码人IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IGF1R蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列，进一步优选包含编码人IGF1R蛋白胞外区的全部或部分的核苷酸序列，更优选包含编码人IGF1R蛋白胞外区至少100个到至少905个，例如100、200、300、400、500、600、700、800、876、877、878、879、880、900或905个连续氨基酸的核苷酸序列，进一步优选包含编码人IGF1R蛋白跨膜区的全部或部分的核苷酸序列，更进一步优选包含编码人IGF1R蛋白跨膜区至少5个到至少24个，优选为5、10、15、20、21、22、23或24个连续氨基酸的核苷酸序列，再优选包含编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有与编码SEQ ID NO：2的31-935位或58-935位所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列，再进一步优选包含编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或者，包含具有与编码SEQ ID NO：2的936-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的导入非人动物IGF1R基因座上的核苷酸序列还包含：

更优选的，所述的构建方法还包括将包含下列任一种的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上：

E)编码上述的人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列；或，

F)上述的人源化IGF1R基因。

优选的，所述的构建方法还包括将SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上；或者，将包含编码与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上；或者，将包含编码与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上；或者，将包含具有SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上。

优选的，上述A)-F)任一所述的核苷酸序列，或者，SEQ ID NO：9或12中任一个核苷酸序列在质粒上表达或在染色体上表达。

优选的，导入的序列可以为人IGF1R基因的基因组DNA序列、人IGF1R基因的cDNA序列、人IGF1R基因的CDS序列的全部或部分。

优选的，所述的导入为替换或***。

优选的，所述的导入位置位于非人动物IGF1R基因的内源调控元件之后。

其中，所述的***为在不删除核苷酸的条件下，将目的片段直接置于相邻两个碱基之间，或者删除部分核苷酸序列后将目的片段置于删除位置。其中，目的片段例如人IGF1R基因、人源化IGF1R基因、编码人或人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列、人IGF1R与非人IGF1R基因拼接获得的核苷酸序列，当然也可以为人IGF1R基因的部分核苷酸序列。

优选的，根据具体实施方案的需要，所述的***还可能包括破坏非人动物内源IGF1R基因的编码框或破坏***序列之后的内源IGF1R基因的编码框，随后进行***操作，或者，所述的***步骤既可以给内源IGF1R基因造成移码突变又可以实现***序列的步骤，所述的***序列包含辅助序列，优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子、翻转序列或敲除序列，进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE、3’UTR、polyA和/或STOP序列。

优选的，所述***的位置为非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子中，优选***非人动物IGF1R基因的2号外显子，更优选***非人动物IGF1R基因编码蛋白的57-58位所示氨基酸序列之间，或者，***NM_010513.2第773-774位所示核苷酸序列之间。

其中，所述的替换包括相应位置的替换或不相应位置的替换。所述相应位置的替换并不仅仅机械的代表人与非人动物IGF1R基因碱基位点直接对应的替换，还包括相应功能区的替换。

优选的，所述的导入非人动物IGF1R基因座为替换非人动物1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选的，非人动物IGF1R基因的2号至14号外显子的全部或部分被替换，更优选的，非人动物IGF1R基因的2号外显子和/或2-3号内含子的的全部或部分被替换。

更优选的，非人动物IGF1R基因中编码SEQ ID NO:1的58-213位所示氨基酸序列的核苷酸序列被替换。

优选的，编码人或人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列、人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因在非人动物体内通过调控元件进行调控。

优选的，所述的调控元件可以是内源或者外源的，例如，所述的调控元件包括但不限于内源启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列***或替换编码非人动物IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGF1R基因的部分***或替换非人动物IGF1R基因的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分***或替换非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分编码区的核苷酸序列，以及，非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分编码区的核苷酸序列，***或替换非人动物IGF1R基因的2号至21号外显子的全部或部分，优选***或替换非人动物IGF1R基因的2号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人IGF1R蛋白的胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列***或替换编码非人动物IGF1R蛋白的胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列，和，编码非人动物IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列，优选编码人IGF1R蛋白的胞外区和/或跨膜区的核苷酸序列，和，编码非人动物IGF1R蛋白的胞质区的核苷酸序列，***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的58-213位或57-58位所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，NM_010513.2第773-774位所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列或者人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因的核苷酸序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含人IGF1R基因编码区序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的核苷酸序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的58-213位或57-58位所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，NM_010513.2第773-774位所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示核苷酸序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的58-213位或57-58位所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，NM_010513.2第773-774位所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含与NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列和SEQ ID NO：8所示核苷酸序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的58-213位或57-58位所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，NM_010513.2第773-774位所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的58-213位或57-58位所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，NM_010513.2第773-774位所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含编码人或人源化IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列或人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因的核苷酸序列***或替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO：1的58-213位或57-58位所示氨基酸序列的核苷酸序列，或者，NM_010513.2第773-774位所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括在非人动物内源IGF1R基因座处用人IGF1R基因的基因组片段，以及，非人动物IGF1R基因的基因组片段替换或***非人动物IGF1R基因的基因组片段以形成经修饰的IGF1R基因。

所述的人IGF1R基因的基因组片段包含人IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，优选包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分的核苷酸序列，优选所述的人IGF1R基因的基因组片段为编码区的核苷酸序列。

所述的非人动物IGF1R基因的基因组片段包含非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，优选包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分的核苷酸序列，优选所述的非人动物IGF1R基因的基因组片段为编码区的核苷酸序列。

所述的被替换或***的非人动物IGF1R基因的基因组片段包含非人动物IGF1R的1号至21号外显子的全部或部分，优选包含非人动物IGF1R基因的2号至14号外显子的全部或部分，进一步优选包含非人动物IGF1R基因的2号外显子的全部或部分。

所述的经修饰的IGF1R基因编码人源化IGF1R蛋白。

优选的，所述的经修饰的IGF1R基因的表达受到非人动物内源调控元件的调控。

优选的，所述非人动物的基因组包含人源化的内源IGF1R基因座，在该基因座中，内源IGF1R基因座的区段已被缺失并被替换为人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。

优选的，所述非人动物的基因组包含人源化的内源IGF1R基因座，在该基因座中，内源IGF1R基因座的区段未被缺失，其中***人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。

优选的，所述的人源化的内源IGF1R基因座包括内源IGF1R启动子，其中，人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列可操作地连接到内源IGF1R启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，非人动物内源IGF1R基因座的至少一个内含子和/或外显子已被缺失并被替换为人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。

在本发明的一个具体实施方式中，非人动物内源IGF1R基因座的内含子和/或外显子未被缺失并被***人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。在本发明的一个具体实施方式中，非人动物IGF1R的5’非翻译区和/或3’非翻译区尚未被缺失并尚未被替换为人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。

优选的，使用基因编辑技术进行IGF1R基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，所述的构建方法包括使用上述的靶向载体和/或sgRNA进行非人动物的构建。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中(优选为胚胎干细胞)，筛选出正确的阳性克隆细胞导入已分离好的囊胚中，培养该囊胚，然后将培养后的囊胚移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IGF1R基因人源化的非人动物。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向IGF1R基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向IGF1R基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得IGF1R基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将IGF1R基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因选自EGFR、HER2、VEGFR2、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、CCN2、NKP46、TNFR2、IL-2、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28中的至少一种。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的EGFR、HER2、VEGFR2、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、CCN2、NKP46、TNFR2、IL-2、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28蛋白中的至少一种。

优选的，所述的人或人源化IGF1R基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选***或替换)基因座为纯合。

优选的，所述的人或人源化IGF1R基因和/或其他基因对于内源被修饰(优选***或替换)基因座为杂合。优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选***或替换)基因座为纯合的，优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰(优选***或替换)基因座为杂合的。

本发明的第十一方面，提供了一种IGF1R基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失IGF1R基因的全部或部分。优选缺失IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分。进一步优选缺失IGF1R基因的2号外显子的全部或部分。

本发明的第十二方面，提供了一种IGF1R基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体和/或上述的sgRNA进行IGF1R基因缺失的非人动物的制备。

本发明的第十三方面，提供了一种IGF1R基因缺失的细胞，所述的细胞缺失IGF1R基因的全部或部分。优选缺失IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分。进一步优选缺失IGF1R基因的2号外显子的全部或部分。

本发明的第十四方面，提供了一种IGF1R基因缺失的细胞的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体和/或上述的sgRNA进行IGF1R基因缺失的细胞的构建。

本发明的第十五方面，提供了一种多基因修饰非人动物的构建方法，包括如下步骤：

I)提供上述的非人动物，或者采用上述构建方法获得的非人动物；

II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因EGFR、HER2、VEGFR2、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、CCN2、NKP46、TNFR2、IL-2、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28修饰的非人动物中的至少一种。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰(优选***或替换)基因座均可以是纯合的。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因对于内源被修饰基因座(优选***或替换)均可以是杂合的。

本发明的第十六方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代。

本发明的第十七方面，提供了一种IGF1R基因人源化非人动物的基因组。

优选的，所述的基因组中包含人或人源化IGF1R基因的全部或部分，和/或，包含编码人IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列。

优选的，所述的IGF1R基因为上述的IGF1R基因。

优选的，所述的IGF1R蛋白为上述的IGF1R蛋白。

优选的，所述的基因组，包含用人IGF1R基因的基因组片段(优选人IGF1R基因的全部或部分CDS序列)，和/或，非人动物IGF1R基因的基因组片段(优选非人动物IGF1R基因的全部或部分CDS序列)***或替换非人动物IGF1R基因的基因组片段以形成经修饰的IGF1R基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的基因组包括在非人动物内源IGF1R基因座处用人IGF1R基因的基因组片段，以及，非人动物IGF1R基因的基因组片段替换或***非人动物IGF1R基因的基因组片段以形成经修饰的IGF1R基因。

所述的经修饰的IGF1R基因编码人源化IGF1R蛋白。

优选的，所述的基因组包含人源化的内源IGF1R基因座，在该基因座中，内源IGF1R基因座的区段已被缺失并被替换为人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。

在本发明的一个具体实施方式中，非人动物内源IGF1R基因座的内含子和/或外显子未被缺失并被***人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。

在本发明的一个具体实施方式中，非人动物IGF1R的5’非翻译区和/或3’非翻译区尚未被缺失并尚未被替换为人IGF1R和非人动物IGF1R的嵌合序列。

本发明的第十八方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含上述的人源化IGF1R基因，和/或，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化IGF1R蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

优选的，所述的细胞、组织或器官根据来源的不同，一部分可以发育为动物个体，一部分不会发育为动物个体。

本发明的第十九方面，提供了一种瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第二十方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。

优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

优选的，所述的动物模型为甲状腺相关性眼病动物模型。

本发明的第二十一方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述的构建方法是利用上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物进行的。

优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

优选的，所述的动物模型为甲状腺相关性眼病动物模型。

本发明的第二十二方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。

本发明的第二十三方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗和/或预防肿瘤、炎症或免疫相关疾病(例如甲状腺相关性眼病)的药物中的用途。

本发明的第二十四方面，提供了一种IGF1R基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化IGF1R蛋白，和/或，所述的细胞的基因组中包含人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因。

优选的，所述的细胞表达上述的人源化IGF1R蛋白。

优选的，所述的细胞的基因组中包含上述的人源化IGF1R基因。

本发明的第二十五方面，提供了一种IGF1R基因人源化的细胞的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体和/或上述的sgRNA进行IGF1R基因人源化的细胞的构建。

本发明的第二十六方面，提供了一种上述的人源化IGF1R蛋白、上述的人源化IGF1R基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物、上述的细胞、组织或器官、上述的瘤组织或上述动物模型的应用。

优选的，所述的应用可以为非疾病的诊断和/或治疗目的应用。

优选的，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与IGF1R相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与IGF1R相关的模型***中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与IGF1R相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人IGF1R信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究IGF1R基因功能，研究针对人IGF1R靶位点的药物、药效，研究与IGF1R相关的炎症、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型用于人IGF1R特异性调节剂的筛选。

本发明的第二十八方面，提供了一种人IGF1R特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗IGF1R抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述筛选方法不是治疗方法。该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十九方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括构建动物模型，向动物模型给予候选药物，对给予候选药物的动物模型进行药效检测和/或比较。

优选的，所述人用药物筛选或评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于甲状腺相关性眼病、GVHD(移植物抗宿主病)、银屑病、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、***、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、***癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。

本发明所述“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IGF1R基因座”表示IGF1R基因1号至21号外显子上任选一段的DNA片段。

在本发明的一个具体实施方式中，被替换的IGF1R基因座可以是IGF1R基因1号至21号外显子上任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化IGF1R蛋白”，包含来源于人IGF1R蛋白的部分。其中，所述的“人IGF1R蛋白”同“人IGF1R蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人IGF1R蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人IGF1R蛋白的部分”，为连续或间隔的5-1367个(优选为10-1367或10-902个)，例如5、10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350或1367个连续氨基酸序列与人IGF1R蛋白的氨基酸序列一致或与人IGF1R蛋白的氨基酸序列具有90％以上同源性。

本发明所述的“人源化IGF1R基因”，包含来源于人IGF1R基因的部分。其中，所述的“人IGF1R基因”同“人IGF1R基因的全部”，即其核苷酸序列与人IGF1R基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人IGF1R基因的部分”为连续或间隔的20bp-315992bp(优选为20bp-12235bp、20bp-3920bp、20bp-2706bp)，例如20、50、100、500、1000、1500、2000、2500、2700、2706、3000、3500、3900、3920、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、12235、20000、50000、100000、200000、300000、

310000、315992bp连续核苷酸序列与人IGF1R基因核苷酸序列一致或与人IGF1R基因核苷酸序列具有90％以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至21号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子、4-5号内含子、5号外显子、5-6号内含子、6号外显子、6-7号内含子、7号外显子、7-8号内含子、8号外显子、8-9号内含子、9号外显子、9-10号内含子、10号外显子、10-11号内含子、11号外显子、11-12号内含子、12号外显子、12-13号内含子、13号外显子、13-14号内含子、14号外显子、14-15号内含子、15号外显子、15-16号内含子、16号外显子、16-17号内含子、17号外显子、17-18号内含子、18号外显子、18-19号内含子、19号外显子、19-20号内含子、20号外显子、20-21号内含子和21号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“xx-xxx号内含子”表示xx号外显子与xxx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“细胞”可以为受精***或者其他体细胞，优选包括但不限于肝脏细胞、成骨细胞、单核细胞、肿瘤细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。

本发明所述的“组织”或“器官”不能发育为个体。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdc^scid IL-2rg^null背景的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠IGF1R基因座和人IGF1R基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠IGF1R基因人源化改造示意图一(非按比例)；

图3：IGF1R基因打靶策略及靶向载体设计示意图一(非按比例)；

图4：IGF1R基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图5：IGF1R基因打靶策略及靶向载体设计示意图二(非按比例)；

图6：IGF1R基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型对照，H₂O为水对照，M为Marker；

图7：Southern Blot检测结果示意图，其中WT为野生型对照；

图8：小鼠IGF1R基因人源化改造示意图二(非按比例)；

图9：IGF1R基因打靶策略及靶向载体设计示意图三(非按比例)；

图10：RT-PCR检测结果，其中+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为IGF1R基因人源化纯合子小鼠，H₂O为水对照；

图11：C57BL/6野生型小鼠脑部蛋白表达结果，其中图(A)为鼠脑部细胞核染色，图(B)为人IGF1R(hIGF1R)蛋白表达情况，图(C)为鼠CD31(mIGF1R)蛋白表达情况，图(D)为合并结果，图(C)和图(D)中箭头指示检测到的细胞；

图12：IGF1R基因人源化纯合子小鼠脑部蛋白表达结果，其中图(A)为鼠脑部细胞核染色，图(B)为人IGF1R(hIGF1R)蛋白表达情况，图(C)为鼠CD31(mIGF1R)蛋白表达情况，图(D)为合并结果，图(B)、图(C)和图(D)中箭头指示检测到的细胞。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

BclI、AseI、Nco、BbsI、EcoRI、BamHI酶购自NEB，货号分别为R0160S、R0526S、R0193S、R0539L、R0101M、R0136M；

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

APC Anti-IGF1 Receptor antibody[EPR19322]购自abcam，货号为ab225298；

PE anti-human CD221(IGF-1R)Antibody购自Biolegend，货号为351805；

Zombie NIR^TMFixable Viability Kit购自Biolegend，货号为423106；

Purified anti-mouse CD16/32购自Biolegend，货号为101302；

PE Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody购自Biolegend，货号为400112；

重组APC兔IgG,单克隆抗体[EPR25A]-同型对照购自abcam，货号为ab232814；

Trizol试剂盒购自TakaRa，货号6110A；

IGF-I ReceptorβAntibody购自Cell Signaling Technology，货号：3027S；

Recombinant Anti-CD31 antibody[EPR17259]购自abcam，货号为ab182981。

实施例1 IGF1R基因人源化小鼠

小鼠IGF1R基因(NCBI Gene ID：16001，Primary source：MGI：96433，UniProt ID：E9QNX9，位于7号染色体NC_000073.7的第67601486至67883416位，基于转录本NM_010513.2及其编码蛋白NP_034643.2(SEQ ID NO：1))和人IGF1R基因(NCBI Gene ID：3480，Primarysource：HGNC:5465，UniProt ID：P08069，位于15号染色体NC_000015.10的第98648539至98964530位，基于转录本NM_000875.5及其编码蛋白NP_000866.1(SEQ ID NO：2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IGF1R基因座引入编码人IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化IGF1R蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠内源IGF1R基因调节元件的控制下，将编码人IGF1R蛋白的部分核苷酸序列和编码鼠IGF1R蛋白的部分核苷酸序列***或替换小鼠IGF1R基因座，实现对小鼠IGF1R基因的人源化改造，得到人源化IGF1R基因座示意图如图2所示。

靶向载体上含有小鼠IGF1R基因的上游和下游的同源臂序列、编码人IGF1R蛋白的部分核苷酸序列和编码小鼠IGF1R蛋白的部分核苷酸的片段。例如，采用如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠IGF1R基因的上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人IGF1R蛋白的部分核苷酸序列、编码小鼠IGF1R蛋白的部分核苷酸序列、WPRE序列、polyA序列和STOP序列的A片段(SEQ ID NO:9)。其中，5’同源臂(SEQ ID NO:3)与NCBI登录号为NC_000073.7的第67649276至67653634核苷酸序列相同；3’同源臂(SEQ ID NO:4)与NCBI登录号为NC_000073.7的第67654709至67659216位核苷酸序列相同。A片段上包含的人IGF1R核苷酸序列(SEQ ID NO:7)与NCBI登录号为NM_000875.5的第1215至3920位核苷酸序列一致性为99％，第1326-1328位由“AGC”突变为“TCA”，A片段上包含的小鼠IGF1R核苷酸序列(SEQ ID NO:8)与NCBI登录号为NM_010513.2的第3483至4712位核苷酸序列相同。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组***FRT重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与STOP序列的连接设计为：

/>

其中序列/>

中的“A”是STOP序列的最后一个核苷酸，序列“CCTT”中第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为：/>

其中序列/>

中最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“TCCA”中的“T”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠IGF1R的mRNA序列如SEQ ID NO：10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：11所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经PCR鉴定(引物如表1所示)为阳性的克隆再进行Southern Blot检测确认无随机***后，进一步测序验证正确的克隆进行下一步实验。

表1 PCR引物名称及具体序列

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图4)后，再通过互相交配即可得到IGF1R基因人源化纯合子小鼠。

此外，还可引入CRISPR/Cas***进行基因编辑，设计如图5所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠IGF1R基因上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人IGF1R蛋白的部分核苷酸序列、编码小鼠IGF1R蛋白的部分核苷酸、WPRE序列、polyA序列和STOP序列的A2片段(SEQ ID NO:12)。其中，5’同源臂(SEQ ID NO:5)与NCBI登录号为NC_000073.7的第67652308至67653634位核苷酸序列相同；3’同源臂(SEQ ID NO:6)与NCBI登录号为NC_000073.7的第67654709至67655862位核苷酸序列相同。A2片段上包含的人IGF1R核苷酸序列为SEQ ID NO:7，A2片段上包含的小鼠IGF1R核苷酸序列为SEQ ID NO:8。改造后的人源化小鼠IGF1R的mRNA序列如SEQ ID NO：10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：11所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，示例性sgRNA在IGF1R基因上的靶序列如下：

sgRNA1靶位点(SEQ ID NO：17)：5’-GTCGCTGGCCTCGAGAGCCTGGG-3’；

sgRNA2靶位点(SEQ ID NO：18)：5’-GACCTAGGACTCGTGGAAGCTGG-3’；

利用UCA试剂盒检测sgRNA的活性，确定其可介导高效切割效率后，在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表2)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-IGF1R-1和pT7-IGF1R-2。

表2 sgRNA1和sgRNA2序列列表

pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：27)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-IGF1R-1和pT7-IGF1R-2质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精***质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的IGF1R基因人源化小鼠品系。

可通过PCR鉴定F1代小鼠体细胞的基因型(引物如表1所示)，示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01至F1-09的9只小鼠均为阳性杂合子小鼠。

对F1代PCR鉴定为阳性的小鼠测序并进行Southern blot检测，确认是否存在随机***。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BclI酶或AseI酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表3，示例性F1代的检测结果如图7所示：F1-03、F1-04、F1-05、F1-06、F1-07和F1-09均为阳性杂合子小鼠。这表明使用本方法成功构建出可稳定传代且无随机***的IGF1R基因人源化小鼠。

表3具体探针及目的片段的长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				BclI	3’Probe	6.1kb	4.9kb
AseI	WPREProbeProbe	--	7.1kb

探针合成引物如下：

3’Probe-F(SEQ ID NO：28)：5’-GGTCGAGCTGGTACTACGGCAG-3’，

3’Probe-R(SEQ ID NO：29)：5’-TAAGCACTCCATTGTGAAACCACAG-3’；

WPRE Probe-F(SEQ ID NO：30)：5’-GTGGATACGCTGCTTTAATGCC-3’，

WPRE Probe-R(SEQ ID NO：31)：5’-AAGGGAGATCCGACTCGTCTG-3’；

此外，A2片段上包含的人IGF1R核苷酸序列无突变，与NCBI登录号为NM_000875.5的第1215至3920位核苷酸序列相同，采用上述类似的方法，也可实现对小鼠的人源化改造。改造后的人源化小鼠IGF1R的mRNA序列如SEQ ID NO：42所示，表达的蛋白序列如SEQ IDNO：11所示。

或者，将A2片段上的WPRE序列、polyA序列替换为小鼠的3’UTR序列，采用上述类似的方法，也可实现对小鼠的人源化改造。改造后的人源化小鼠IGF1R的mRNA序列如SEQ IDNO：43所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：11所示。

进一步通过流式细胞术检测阳性小鼠体内人源化IGF1R蛋白的表达情况。具体来说，分别取7周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和IGF1R基因人源化杂合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取肾脏组织，分别用人鼠交叉IGF1R抗体APC Anti-IGF1 Receptor antibody[EPR19322](mIGF1R)、抗人IGF1R抗体PE anti-human CD221(IGF-1R)Antibody(hIGF1R)、细胞活/死染料Zombie NIR^TMFixable Viability Kit、抗鼠CD16/32抗体Purified anti-mouse CD16/32等识别染色后进行流式检测。数据显示，C57BL/6野生型小鼠肾脏中mIGF1R阳性细胞(特征为mIGF1R+)比例为29.5％，hIGF1R阳性细胞(特征为hIGF1R+)比例为1.04％；IGF1R基因人源化杂合子小鼠肾脏中hIGF1R阳性细胞比例为30.3％，mIGF1R阳性细胞比例为37.9％。结果表明，在野生型C57BL/6小鼠体内只能检测到鼠IGF1R蛋白，不能检测到人或人源化IGF1R蛋白；在IGF1R基因人源化杂合子小鼠体内既可以检测到鼠IGF1R蛋白，也能检测到人源化IGF1R蛋白。

将F1代鉴定为阳性的杂合小鼠相互交配，获得IGF1R基因人源化纯合子小鼠。取7周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和10周龄雌性IGF1R基因人源化纯合子小鼠(H/H)各一只，脱颈安乐死后取肾脏组织、大脑组织以及肺部组织，分别通过与上述类似的流式细胞术检测人或人源化IGF1R蛋白的表达情况，检测结果如表4所示。

表4流式细胞术检测结果

从表4中可以看出，在野生型小鼠C57BL/6体内仅检测到鼠IGF1R蛋白，不能检测到人或人源化IGF1R蛋白；人源化IGF1R蛋白只能在IGF1R人源化纯合子小鼠中检测到。

可以通过RT-PCR检测IGF1R基因人源化小鼠体内mRNA的表达情况，具体来说，分别选取7周龄雌性C57BL/6小鼠(+/+)和本实施制备的10周龄雌性IGF1R基因人源化纯合子(H/H)各1只，脱颈安乐死后取脑组织，使用表5所示的引物序列进行RT-PCR检测，检测结果如图10所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠体内仅检测到鼠IGF1R mRNA，未检测到人的IGF1R mRNA；人的IGF1R mRNA仅在IGF1R基因人源化纯合子小鼠体内检测到。

表5 RT-PCR引物序列及目的片段大小

进一步地，采用IF染色检测小鼠脑部人源化IGF1R蛋白的表达情况。具体来说，选取6-8周龄雌性C57BL/6野生型小鼠(+/+)和本实施制备的IGF1R基因人源化纯合子小鼠(H/H)各3只，脱颈安乐死后取脑部组织，制成石蜡切片并用特异性抗人IGF1R抗体IGF-IReceptorβAntibody和抗鼠CD31抗体Recombinant Anti-CD31 antibody[EPR17259]联合染色，检测小鼠脑部鼠CD31(mCD31)和人IGF1R(hIGF1R)蛋白表达情况。示例性结果如图11和图12所示，图11为C57BL/6野生型小鼠脑部蛋白表达结果，图12为IGF1R基因人源化纯合子小鼠脑部蛋白表达结果，其中图11(A)和图12(A)为小鼠脑部细胞染色，图11(D)和图12(D)为合并结果。

结果显示，在C57BL/6小鼠中可检测到mCD31+脑微血管内皮细胞(箭头所示)，未见hIGF1R+脑微血管内皮细胞(图11)；在IGF1R纯合子小鼠可检测到mCD31+脑微血管内皮细胞和hIGF1R+脑微血管内皮细胞(箭头所示)，表明IGF1R基因人源化纯合子小鼠脑部中可以成功表达人源化IGF1R蛋白(图12)。

实施例2 IGF1R基因人源化小鼠(二)

本发明的发明人还通过将实施例1中人鼠嵌合序列***到小鼠IGF1R基因的二号外显子中，成功获得了IGF1R人源化小鼠。改造小鼠的基因座的示意图如图8所示，实现了对小鼠IGF1R的另一种人源化改造。

设计如图9所示的打靶策略，图中显示了靶向载体上含有小鼠IGF1R基因上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人IGF1R蛋白的部分核苷酸序列、编码小鼠IGF1R蛋白的部分核苷酸、WPRE序列、polyA序列和STOP序列的A3片段。其中，5’同源臂如SEQ ID NO:5所示，3’同源臂(SEQ ID NO:32)与NCBI登录号为NC_000073.7的第67653635至67654952位一致性为99％，第67653751至67653753位由“GGG”突变为“CCC”。A3片段上包含的人IGF1R核苷酸序列与NCBI登录号为NM_000875.5的第1215至3920位核苷酸序列相同，A3片段上包含的小鼠IGF1R核苷酸序列为SEQ ID NO:8。改造后的人源化小鼠IGF1R的mRNA序列如SEQ ID NO：42所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：11所示。

sgRNA3靶位点(SEQ ID NO：33)：5’-GTCGCTGGCCTCGAGAGCCTGGG-3’；

利用UCA试剂盒检测sgRNA的活性，确定其可介导高效切割效率后，在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸序列(见表6)，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-IGF1R-3。

表6 sgRNA3序列列表

pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：27)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pT7-IGF1R-3质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精***质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的IGF1R基因人源化小鼠品系。

可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表1所示)，将F0鉴定为阳性的IGF1R基因人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，获得F1阳性小鼠。

对F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机***。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用NcoI酶或AseI酶消化基因组，转膜，杂交。具体探针及目的片段的长度见表7。最后再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。

表7具体探针及目的片段的长度

探针合成引物如下：

A Probe-F(SEQ ID NO：38)：5’-GCTAAAATGTAGCTATGGCTCAGGGC-3’，

A Probe-R(SEQ ID NO：39)：5’-CCACAGACAGACACAAATCAAATGAC-3’；

5’Probe-F(SEQ ID NO：40)：5’-GTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTG-3’，

5’Probe-R(SEQ ID NO：41)：5’-AAGGGAGATCCGACTCGTCTGAG-3’；

实施例3药效验证

利用本方法制得的IGF1R基因人源化小鼠可以用于评估靶向人IGF1R抗体的药效。例如，取IGF1R基因人源化纯合子小鼠，通过建立眼眶炎症小鼠模型等甲状腺相关性眼病模型。将小鼠分为对照组或治疗组，治疗组注射靶向人IGF1R的抗体药物，对照组注射等体积的生理盐水或PBS。然后进行磁共振成像(MRI)、组织病理学、免疫荧光和细胞因子阵列分析，可有效评估抗体药物在人源化IGF1R小鼠体内的安全性和体内药效。

此外，利用本方法制得的IGF1R人源化小鼠可以用于评估靶向人IGF1R的药物的药效。例如，取IGF1R人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm³后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人IGF1R的药物，对照组注射等体积的生理盐水或PBS。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估药物的体内安全性和体内药效。

实施例4双重人源化或多重人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的IGF1R小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有EGFR、HER2、VEGFR2、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、CCN2、NKP46、TNFR2、IL-2、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT、CD28等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化IGF1R小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得IGF1R与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的IGF1R小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化IGF1R与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人IGF1R和其它基因调节剂的体内药效验证等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims

1.一种IGF1R基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IGF1R蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的胞外区和跨膜区的全部或部分，优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含非人动物IGF1R蛋白的信号肽、胞外区和/或胞质区的全部或部分，再进一步优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQ ID NO：1的1-30、31-57和/或961-1369位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1的1-30、31-57和/或961-1369位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

优选的，所述的人源化IGF1R蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

3.根据权利要求1-2任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分；

进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

更优选的，所述的人源化IGF1R基因包含SEQ ID NO：7或NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7或NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列，最优选的，所述人源化IGF1R基因包含SEQ ID NO：7；

优选的，所述的人源化IGF1R基因还包含非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分；

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：1的1-30、31-57和/或961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1的1-30、31-57和/或961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列。

4.根据权利要1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IGF1R基因包含SEQID NO：9或12所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；优选的，所述的人源化IGF1R基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列；

5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将包含下列任一种的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上：

A)人IGF1R基因的部分，优选包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子和14号外显子的部分，进一步优选包含SEQ ID NO：7或NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：7或NM_000875.5的第1215-3920位所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列，更优选的，所述人IGF1R基因的部分包含SEQ ID NO：7；

B)编码人IGF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人IGF1R蛋白胞外区和/或跨膜区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

优选的，所述的导入非人动物IGF1R基因座上的核苷酸序列还包含：

C)非人动物IGF1R基因的部分，优选包含非人动物IGF1R基因的14号外显子的部分、15号至20号外显子的全部和21号外显子的部分；进一步优选包含SEQ ID NO：8所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：8所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或，

D)编码非人动物IGF1R蛋白的部分核苷酸序列，优选包含编码非人动物IGF1R蛋白胞质区的全部或部分核苷酸序列，进一步优选包含编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1的961-1369位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

进一步优选的，所述的构建方法包括将包含下列任一种的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上：

E)编码人或人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列；或，

F)人或人源化IGF1R基因；

更优选的，所述的构建方法包括将包含SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上；或者，将包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列导入非人动物IGF1R基因座上。

6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或***，

优选的，所述的导入非人动物IGF1R基因座为替换非人动物1号至21号外显子的全部或部分，优选非人动物IGF1R基因2号外显子和/或2-3号内含子的全部或部分被替换；

优选的，所述的导入非人动物IGF1R基因座为***非人动物内源调控元件之后，更优选的，所述的导入非人动物IGF1R基因座为***非人动物IGF1R基因的1号至21号外显子中，优选***非人动物IGF1R基因的2号外显子；

更优选的，编码人或人源化IGF1R蛋白的全部或部分的核苷酸序列、人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。

7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将IGF1R基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；优选的，所述的其他基因选自EGFR、HER2、VEGFR2、B7H3、BCMA、FAP、CXCR4、CSF2、CCN2、NKP46、TNFR2、IL-2、IL-15RA、IL-10、PD-1、PD-L1、TIGIT或CD28中的至少一种；

优选的，所述的人IGF1R基因的部分或人源化IGF1R基因和/或其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。

8.一种人源化IGF1R蛋白，其特征在于，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的全部或部分。

9.根据权利要求8所述的人源化IGF1R蛋白，其特征在于，所述的人源化IGF1R蛋白包含人IGF1R蛋白的胞外区和跨膜区的全部或部分，优选的，所述的人源化IGF1R蛋白包含SEQID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

最优选的，所述的人源化IGF1R蛋白的氨基酸序列包含SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列。

10.一种人源化IGF1R基因，其特征在于，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的部分；

优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码权利要求8-9任一所述的人源化IGF1R蛋白的核苷酸序列。

11.根据权利要求10所述的人源化IGF1R基因，其特征在于，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的1号至21号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化IGF1R基因包含人IGF1R基因的2号外显子的部分、3号至13号外显子的全部和14号外显子的部分；

进一步优选的，所述的人源化IGF1R基因包含编码SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：2的31-959或58-959位所示氨基酸序列的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

12.根据权利要求10-11任一所述的人源化IGF1R基因，其特征在于，所述的人源化IGF1R基因包含SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：9或12所示核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；优选的，所述的人源化IGF1R基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：10、42或43所示核苷酸序列；

13.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求10-12任一所述的人源化IGF1R基因，和/或，所述的细胞、组织或器官表达权利要求8-9任一所述的人源化IGF1R蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求1-7任一所述的构建方法获得的非人动物。

14.根据权利要求9所述的人源化IGF1R蛋白、权利要求10-12任一所述的人源化IGF1R基因或权利要求2-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物，进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

15.一种权利要求10-12任一所述的人源化IGF1R基因、权利要求8-9任一所述的人源化IGF1R蛋白、权利要求1-7任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求13所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述的应用包括：