CN115010800A

CN115010800A - Pvrig基因人源化非人动物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN115010800A
Application number: CN202210655015.6A
Authority: CN
Inventors: 张译夫; 姚佳维; 刘重慧
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-06-10
Filing date: 2022-06-10
Publication date: 2022-09-06
Also published as: WO2022258049A1

Abstract

本发明提供了一种人源化PVRIG蛋白、一种人源化PVRIG基因、一种PVRIG基因的靶向载体、一种PVRIG基因人源化的非人动物及其构建方法和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人PVRIG蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化PVRIG蛋白，可以作为人PVRIG信号机理研究、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

PVRIG基因人源化非人动物的构建方法及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种PVRIG基因人源化非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

PVRIG(PVR related immunoglobulin domain containing)又称CD112R，属于脊髓灰质炎病毒受体样蛋白，是一类新出现的具有T细胞共信号功能的IGSF(Igsuperfamily，免疫球蛋白超家族)。主要在T细胞和NK细胞中表达。其受体CD112(PVRL2)广泛表达于肿瘤细胞，如急性髓性白血病、多发性骨髓瘤和上皮癌肿瘤细胞。阻断CD112R-CD112会导致产生IFN-γ的NK细胞数显著增加，说明阻断PVRIG信号通路能够增强人NK细胞功能。

目前，对于CD112-CD112R之间的作用机理及效应有了一些研究，但并不十分清楚。COM701是首个获美国FDA批准进入临床试验的PVRIG抗体。COM701靶向PVRIG能有效刺激某些癌症的肿瘤免疫反应，而且和PD-1和TIGIT抗体具有协同作用，能够增强T细胞的功能，提高抗肿瘤反应。说明PVRIG可作为新的免疫靶点，单独或与其他靶点联用，用于肿瘤的治疗；

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的***，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因的复杂性，例如，人和小鼠PVRIG蛋白的一致性为39％，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。

鉴于PVRIG复杂的作用机制，以及在肿瘤治疗领域的巨大应用价值，为进一步探索其相关生物学特性，提高临床前期药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发PVRIG相关信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种人源化PVRIG蛋白，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分，其中，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少20个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、131、132、133个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含130个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；优选的，包含C端去除0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含C端去除3个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；更优选包含SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白信号肽的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，例如包含至少5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、36、37、38、39个氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，进一步优选的，包含39个氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，更优选的，所述的信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-39位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1-39位所示氨基酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含SEQ ID NO：2第1-169位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-169位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-169位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-169位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG蛋白还包含非人动物PVRIG蛋白的全部或部分。优选包含SEQ ID NO：1第164-234位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQID NO：1第164-234位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第164-234位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第164-234位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG基因的全部或部分编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG基因的1号至6号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至4号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列。最为优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含与SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQID NO：5编码的氨基酸序列。

优选的，所述人源化PVRIG蛋白还包含来源于非人动物的的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG蛋白还包含非人动物PVRIG基因编码的氨基酸序列的全部或部分，优选为非人动物PVRIG基因的4-5号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选还包含3号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：11所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：11所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述人源化PVRIG蛋白包含至少25个氨基酸序列与人PVRIG的相应氨基酸序列相同，其中所述非人动物表达所述人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、斑马鱼、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种编码上述人源化PVRIG蛋白的核酸。

本发明的第三方面，提供了一种人源化PVRIG基因，所述的人源化PVRIG基因包含人PVRIG基因的部分。

优选的，所述的人源化PVRIG基因编码上述的人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的人源化PVRIG基因包含编码人PVRIG蛋白的全部或部分的核苷酸序列。进一步优选包含编码人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的的全部或部分核苷酸序列，更优选的，所述的人源化PVRIG基因包含编码人PVRIG蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的胞外区包含人PVRIG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少20个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、131、132、133个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含130个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；优选的，包含C端去除0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含C端去除3个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；更优选包含SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；所述的信号肽包含人PVRIG蛋白信号肽的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，例如包含至少5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、36、37、38、39个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，进一步优选的，包含39个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，更优选的，所述的信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-39位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1-39位所示氨基酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG基因包含人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或3-4号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG基因还包含非人动物PVRIG基因的全部或部分。进一步优选包含非人动物PVRIG基因的4号至5号外显子的全部或部分，更进一步优选还包含部分1号外显子和/或部分3号外显子的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG基因包含编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQID NO：2第1-169位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG基因还包含编码非人动物PVRIG蛋白全部或部分的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG基因还包含编码SEQ IDNO：1第164-234位的核苷酸序列；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第164-234位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：1第164-234位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：1第164-234位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化PVRIG基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；

B)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)转录的mRNA与SEQ ID NO：10所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

D)转录的mRNA具有SEQ ID NO：10所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或，

E)包含SEQ ID NO：6和/或7所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化PVRIG基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素***(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬***(Tamoxifen System)。

本发明的第四方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列；

B)编码人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人PVRIG蛋白的胞外区和/或信号肽的全部或部分核苷酸序列，进一步优选编码人PVRIG蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、131、132、133个连续氨基酸，更优选的，还包含编码人PVRIG蛋白的信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，例如包含至少5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、36、37、38、39个连续氨基酸，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列；

C)人或人源化PVRIG基因的核苷酸序列；或，

D)人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列；进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ IDNO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂(5’同源臂)和/或3’臂(3’同源臂)。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物PVRIG基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，其选自非人动物PVRIG基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：6、7、8和/或9。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物PVRIG基因的1号至5号外显子上，进一步优选位于非人动物PVRIG基因的1号至3号外显子上。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组***。进一步优选的，所述特异性重组***为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组***)。所述的特异性重组***为2个，分别装在抗性基因的两侧。

本发明的第五方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。

本发明的第六方面，提供了一种上述的靶向载体和/或上述细胞在PVRIG基因编辑中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、***或替换。

本发明的第七方面，提供了一种PVRIG基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源PVRIG蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的非人动物体内包含人PVRIG基因的部分，更优选包含上述的人源化PVRIG基因。

优选的，人PVRIG基因的部分或者人源化PVRIG基因的核苷酸序列可操作的连接到至少一条染色体中内源性PVRIG基因座处的内源性调控元件。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或3-4号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含编码人PVRIG蛋白的全部或部分的核苷酸序列。优选包含编码人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人PVRIG蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的胞外区包含人PVRIG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少20个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、131、132、133个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含130个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；优选的，包含C端去除0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含C端去除3个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；更优选包含SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；所述的信号肽包含人PVRIG蛋白信号肽的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，例如包含至少5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、36、37、38、39个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，进一步优选的，包含39个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，更优选的，所述的信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-39位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1-39位所示氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物基因组中包含编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的内源PVRIG蛋白表达降低或缺失。

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、OX40、LAG3、TIM3、CD27、CD47、SIRPA、CTLA4和CD226中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，所述PVRIG基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。

本发明的第八方面，提供了一种上述的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达上述的人或人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的人源化PVRIG蛋白包含上述的人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人源化PVRIG基因，所述的人源化PVRIG基因包含上述的人源化PVRIG基因。

优选的，所述的非人动物的基因组中还包含上述的核酸。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人PVRIG蛋白或上述的人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人PVRIG蛋白信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含上述的人源化PVRIG基因的核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座。

优选的，所述的构建方法包括将人PVRIG基因的部分核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座。

优选的，所述的人PVRIG基因的部分核苷酸序列包含人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或3-4号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列。优选的，所述的人PVRIG基因的部分核苷酸序列包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人PVRIG蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座。进一步优选的，所述的构建方法包括用包含编码人PVRIG蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座；更优选的，所述的构建方法包括用包含编码人PVRIG蛋白的信号肽和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座，其中，所述的胞外区包含人PVRIG蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，包含至少20个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、131、132、133个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含130个连续氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；优选的，包含C端去除0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区，进一步优选的，包含C端去除3个氨基酸的人PVRIG蛋白胞外区；更优选包含SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；所述的信号肽包含人PVRIG蛋白信号肽的全部或部分，优选的，包含至少5个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，例如包含至少5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、36、37、38、39个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，进一步优选的，包含39个连续氨基酸的人PVRIG蛋白信号肽，更优选的，所述的信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-39位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ IDNO:2的第1-39位所示氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座上。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列。

B)编码人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列，优选编码人PVRIG蛋白的胞外区和/或信号肽的全部或部分核苷酸序列，进一步优选编码人PVRIG蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，例如包含至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、131、132、133个连续氨基酸，更优选的，还包含编码人PVRIG蛋白的信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，例如包含至少5、10、11、12、13、14、15、20、30、35、36、37、38、39个连续氨基酸，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列。

C)人或人源化PVRIG基因的核苷酸序列；或，

D)人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选包含人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或3-4号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列。优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人PVRIG蛋白的cDNA序列导入非人动物PVRIG基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化PVRIG基因的核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于***、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。

优选的，所述的供体核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件可以是内源性或者外源性。

优选的，所述的调控元件包括但不限于内源性启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源性调控元件来自非人动物PVRIG基因。所述的外源性调控元件来自人PVRIG基因。

所述的导入为替换或***，具体地，所述的导入非人动物PVRIG基因座为替换非人动物相应区域，优选为替换非人动物基因组中编码内源PVRIG蛋白全部或部分的核苷酸序列。进一步优选的，替换非人动物基因组中编码SEQ ID NO:1的第1-163位的核苷酸序列。

优选的，非人动物PVRIG基因的2号外显子被替换，进一步优选地，还包含非人动物PVRIG基因的1号外显子的部分和/或3号外显子的部分被替换。

优选的，所述PVRIG基因和/或所述其他基因对于内源被替换基因座为纯合或杂合。

优选的，使用基因编辑技术进行PVRIG基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物PVRIG基因的编码框，将编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列或者人源化PVRIG基因的核苷酸序列***非人动物PVRIG基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物PVRIG基因的编码框可以采用敲除非人动物PVRIG基因的功能区或者采用***一段序列，使得非人动物PVRIG蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物PVRIG基因的编码框可以为敲除非人动物PVRIG基因的外显子1至外显子至5号外显子的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列或者人源化PVRIG基因的核苷酸序列和/或辅助序列***非人动物PVRIG基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子，使得PVRIG基因人源化的动物模型体内表达人PVRIG蛋白，不表达非人动物PVRIG蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人PVRIG蛋白的全部或部分(优选为人PVRIG蛋白的信号肽和/或胞外区的部分)***或替换至非人动物PVRIG基因的相应区域。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将人PVRIG基因的部分(优选为人PVRIG基因的1号至6号外显子，进一步优选为人PVRIG基因2号至4号外显子，更进一步优选为人PVRIG基因的2号至4号外显子的全部或部分，再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或3-4号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列***或替换至非人动物PVRIG基因的相应区域(优选为1号至5号外显子，进一步优选为1号至3号外显子，更进一步优选为1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分)。

优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得PVRIG基因人源化的非人动物。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将PVRIG基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为PD-1、PD-L1、TIGIT、OX40、LAG3、TIM3、CD27、CD47、SIRPA、CTLA4和CD226中的至少一种基因修饰的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。

优选的，所述的非人动物还包含PD-1、PD-L1、TIGIT、OX40、LAG3、TIM3、CD27、CD47、SIRPA、CTLA4和CD226中的一种或两种以上的基因修饰。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的PD-1、PD-L1、TIGIT、OX40、LAG3、TIM3、CD27、CD47、SIRPA、CTLA4或CD226蛋白。

本发明的第九方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化PVRIG蛋白。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞或细胞系或原代细胞培养物。

本发明的第十方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化PVRIG蛋白。或者，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第十一面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物(包括PVRIG基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物)。

本发明的第十二方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第十三方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代进行的。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第十四方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建动物模型中的应用。优选的，所述动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第十五方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备***或免疫相关疾病的药物中的用途。

本发明的第十六方面，提供了一种PVRIG基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的细胞表达上述的人源化PVRIG蛋白。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人PVRIG基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化PVRIG基因。优选的，所述的细胞包括可以发育为动物个体或不能发育成动物个体的细胞。

本发明的第十七方面，提供了上述细胞的构建方法，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入细胞PVRIG基因座上。

优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列。

C)人或人源化PVRIG基因的核苷酸序列；或，

D)人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，包含1号至6号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或3-4号内含子，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，例如至少包含50、70、100、110、115、116、117、118、119、120、130、150、170、200、220、250、270、300、310、316bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含118bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，例如至少包含10、20、30、35、36、37、38、39、40、50、60、70、80、90、100、110、120、127bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含38bp的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的导入细胞PVRIG基因座为替换细胞PVRIG基因的相应区域，优选为替换基因组中编码内源PVRIG蛋白胞外区的核苷酸序列。进一步优选的，替换细胞PVRIG基因中编码SEQ ID NO:1的第1-163位的核苷酸序列。

优选的，使用基因编辑技术进行PVRIG基因人源化的细胞的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用上述的靶向载体进行细胞的构建。

本发明的第十八方面，提供了一种包含上述人源化PVRIG基因的构建体或者表达上述人源化PVRIG蛋白的构建体。优选的，所述的构建体可以为质粒。

本发明的第十九方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第二十方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

优选的，上述任一细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织包括可以发育为动物个体或不能发育为动物个体的细胞、组织或器官或荷瘤后的瘤组织。

本发明的第二十一方面，提供了一种上述的人源化PVRIG蛋白、上述的人源化PVRIG基因、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物的应用，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与PVRIG相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与PVRIG相关的模型***中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与PVRIG相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人PVRIG信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究PVRIG基因功能，研究针对人PVRIG靶位点的药物、药效，研究与PVRIG相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。优选的，所述应用包括疾病和非疾病的治疗和诊断目的。

本发明的第二十二方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用于人PVRIG特异性调节剂的筛选。

本发明的第二十三方面，提供了一种人PVRIG特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗PVRIG抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述筛选方法不是治疗方法。该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十四方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括向个体体内移植人肿瘤细胞，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的PVRIG基因人源化的非人动物、上述的PVRIG基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述药物筛选或评价的方法包括治疗方法和非治疗方法。

在一个具体实施方式中，该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，上述任一的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，上述任一的非人动物还可以选自猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、***、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、***癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“PVRIG基因座”表示PVRIG基因1号至5号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的PVRIG基因座可以是PVRIG基因1号至5号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的PVRIG基因座可以是PVRIG基因1号至3号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化PVRIG蛋白”，包含来源于人PVRIG蛋白的部分和非人PVRIG蛋白的部分。

本发明所述的“人源化PVRIG蛋白”，包含来源于人PVRIG蛋白的部分。其中，所述的“人PVRIG蛋白”同“人PVRIG蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人PVRIG蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人PVRIG蛋白的部分”，为连续或间隔的5-326个(优选为10-169个)氨基酸序列与人PVRIG蛋白的氨基酸序列一致或与人PVRIG蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化PVRIG基因”，包含来源于人PVRIG基因的部分和非人PVRIG基因的部分。其中，所述的“人PVRIG基因”同“人PVRIG基因的全部”，即其核苷酸序列与人PVRIG基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人PVRIG基因的部分”为连续或间隔的20-2866bp(优选为20-674bp或20-507bp)个核苷酸序列与人PVRIG核苷酸序列一致或与人PVRIG核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“2号至3号外显子”包含2号外显子、2-3号内含子、3号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人PVRIG基因的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-316bp个，优选10-118bp个核苷酸序列与人PVRIG基因的3号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化PVRIG基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括从起始密码子开始至2号外显子最后一个核苷酸为止。

本发明所述的“细胞”可以为受精***或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。

本发明所述的“PVRIG蛋白”，例如“人PVRIG蛋白”、“非人动物PVRIG蛋白”或“人源化PVRIG蛋白”，均包含信号肽、胞外区、胞内区和/或跨膜区。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物。在一个实施方式中，所述PVRIG基因人源化的非人动物是啮齿类动物。在一个实施方式中，所述啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdc^scid IL-2rg^null背景的小鼠。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠PVRIG基因座和人PVRIG基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠PVRIG基因人源化改造示意图(非按比例)；

图3：PVRIG基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图4:Southern Blot检测阳性克隆结果示意图，WT为野生型；

图5：PVRIG基因人源化小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图6：PVRIG基因人源化小鼠F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，PC为阳性对照，M为Maker；

图7：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和PVRIG基因人源化纯合子小鼠(H/H)脾脏中PVRIGmRNA检测结果，H₂O为水对照；

图8：脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图9：脾脏中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图10：外周血中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图11：外周血中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图12：***中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图13：***中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图14：将小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化PVRIG小鼠体内，进行抗肿瘤药效试验后小鼠的体重结果示意图；

图15：将小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化PVRIG小鼠体内，进行抗肿瘤药效试验后小鼠的体重变化结果示意图；

图16：将小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化PVRIG小鼠体内，进行抗肿瘤药效试验后小鼠的肿瘤体积结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

SacI、EcoNI、NdeI酶购自NEB，货号分别为R3156V、R0521V、R0111V；

C57BL/6小鼠、Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45购自Biolegend，货号103138；

PE anti-human PVRIG Antibody购自R&D，货号MAB93651；

Purified anti-mouse CD16/32购自Biolegend，货号101302。

实施例1PVRIG基因人源化小鼠

小鼠PVRIG基因(NCBI Gene ID：102640920，Primary source：MGI:5596028，UniProt：A0A1B0GS01，位于5号染色体NC_000071.7的第138340193至138346953位，基于转录本NM_001378438.1及其编码蛋白NP_001365367.1(SEQ ID NO：1))和人PVRIG基因(NCBIGene ID：79037，Primary source：HGNC:32190，UniProt ID：Q6DKI7，位于7号染色体NC_000007.14的第100218625至100221490位，基于转录本NM_024070.3及其编码蛋白NP_076975.2(SEQ ID NO：2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源PVRIG基因座引入编码人PVRIG蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化PVRIG蛋白。具体来说，用基因编辑技术，在小鼠PVRIG基因调节元件的控制下，用人PVRIG基因组编码区替换小鼠PVRIG基因组编码区，或用包含人PVRIG基因的2号外显子部分序列至4号外显子部分序列约0.65kb替换小鼠1号外显子的部分序列至3号外显子的部分序列约0.65kb，得到人源化PVRIG基因座示意图如图2所示，实现对小鼠PVRIG基因的人源化改造。

设计如图3所示的打靶策略，图3中显示了靶向载体上含有小鼠PVRIG基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人PVRIG序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQID NO：3)与NCBI登录号为NC_000071.7的第138336113至138340230位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000071.7的第138342219至138345377位核苷酸序列相同。A片段上人PVRIG的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000007.14的第100219911至100220584位核苷酸序列相同；人PVRIG序列上游与小鼠的连接设计为：

(SEQ ID NO：6)，其中序列

中最后一个“C”是小鼠最后一个核苷酸，序列“ATGA”中第一个“A”是人第一个核苷酸。人PVRIG序列下游与小鼠的连接设计为

(SEQ IDNO：7)，其中序列

中的最后一个“G”是人的最后一个核苷酸，序列“GCAG”中的第一个“G”是小鼠序列的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组***Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为

(SEQ ID NO：8)，其中序列

中“G”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“CCTA”的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为

(SEQ ID NO：9)，其中序列“TATG”中“G”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“CTTC”中第一个“C”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠PVRIG的mRNA序列如SEQ ID NO：10所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：11所示。

鉴于人PVRIG具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆，再进行Southern Blot(分别用SacI、EcoNI、NdeI酶消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，检测结果如图4所示1-B08、3-E06、3-F11和3-G06均为阳性的克隆，进一步测序验证为阳性的且无随机***的克隆进行下一步实验。

表1：具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段	重组序列片段
				SacI	3’Probe	10.2kb	7.7kb
EcoNI	5’Probe	9.8kb	7.8kb
				NdeI	Neo Probe	—	9.0kb

其中，PCR测定包括下述引物：

WT-F：5’-GTGTAGGGCTGAATGGGATAAGGGC-3’(SEQ ID NO：12)

Mut-R：5’-GTGACACACAAGGTCAGCAGCAC-3’(SEQ ID NO：13)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F：5’-AAGGCCCCTCCATAGACTTCTCAGC-3’(SEQ ID NO：14)，

5’Probe-R：5’-GGGGCTGCTAACGTCAATCACCTAC-3’(SEQ ID NO：15)；

3’探针(3’Probe)：

3’Probe-F：5’-TCCATGGAACGTTGAATACCAGAAGT-3’(SEQ ID NO：16)，

3’Probe-R：5’-TGGTGCAAGTCTATAATTACAGCAGGTC-3’(SEQ ID NO：17)；

Neo探针(Neo Probe)：

Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：18)，

Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：19)；

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到PVRIG基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01、F1-02和F1-03三只小鼠均为阳性杂合小鼠。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机***的PVRIG基因人源化小鼠。

表2：引物名称及具体序列

实施例2PVRIG人源化小鼠表达检测

通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化PVRIG mRNA的表达情况，例如RT-PCR等。具体来说，分别取5周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和本实施例1制得的PVRIG基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取小鼠脾脏，按照Trizol试剂盒说明书抽提细胞RNA，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测，检测结果如图7所示。从图7中可以看出，在C57BL/6野生型小鼠脾脏中检测到鼠PVRIG mRNA，没有检测到人源化PVRIG mRNA；在PVRIG基因人源化纯合子小鼠脾脏中仅检测到人源化PVRIG mRNA，没有检测到小鼠PVRIG mRNA。

RT-PCR引物序列包括：

PCR-F1：5’-TGACCTTGTGTGTCACTGCG-3’(SEQ ID NO：25)

PCR-R1：5’-GGCTGAGATTTACTCAAACACCA-3’(SEQ ID NO：26)

PCR-F2：5’-GTCTCTGAAGCAAGCCCTGAG-3’(SEQ ID NO：27)

PCR-R2：5’-GGTGCTAGTGAGAGATGGCTG-3’(SEQ ID NO：28)

GAPDH-F：5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’(SEQ ID NO：29)

GAPDH-R：5’-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：30)

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化PVRIG蛋白的表达情况，例如流式细胞术等。具体来说，分别取5周龄雌性C57BL/6野生型小鼠和5周龄雌性PVRIG基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏组织，分别用抗人PVRIG抗体PE anti-human PVRIGAntibody(hPVRIG)、鼠白细胞识别抗体Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45(mCD45)、抗鼠CD16/32抗体Purified anti-mouse CD16/32等识别染色后进行流式检测，结果表明，C57BL/6小鼠脾脏中免疫细胞(特征为mCD45+)有0.99％hPVRIG阳性细胞(特征为mCD45+hPVRIG+)。PVRIG纯合子小鼠脾脏中免疫细胞有30.3％hPVRIG阳性细胞(mCD45+hPVRIG+)。说明C57BL/6小鼠脾脏细胞不表达人源化PVRIG蛋白，PVRIG人源化小鼠脾脏细胞能够成功表达人源化PVRIG蛋白。

进一步对野生型C57BL/6小鼠(C57BL/6)和PVRIG人源化纯合子小鼠(B-hPVRIG)的脾脏、外周血和***中的白细胞和T细胞免疫分型情况进行流式检测。脾脏中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图8和图9所示，外周血中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图10和图11所示。从图中可以看出，PVRIG基因人源化纯合子小鼠脾脏和外周血样本中B细胞(B cells)、T细胞(T cells)、NK细胞(NK cells)、CD4+T细胞(CD4+T cells)、CD8+ T细胞(CD8+T cells)、粒细胞(Granulocytes)、DC细胞(Dendritic cells)、巨噬细胞(Macrophages)和单核细胞(Monocytes)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图8、图10)，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图9、图11)。

***中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图12和图13所示，从图中可以看出，PVRIG基因人源化纯合子小鼠***样本中B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞、CD8+ T细胞等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图12)，CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图13)。

上述结果表明PVRIG基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和在脾脏、外周血和***中的分布。

实施例3双重人源化或多重双人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的PVRIG小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、TIGIT、OX40、LAG3、TIM3、CD27、CD47、SIRPA、CTLA4和/或CD226等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化PVRIG小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得PVRIG与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的PVRIG小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化PVRIG与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人PVRIG和其它基因调节剂的体内药效验证等。

实施例4药效实验

利用本发明制备的PVRIG基因人源化小鼠构建肿瘤模型，可用于测试靶向人PVRIG的药物的药效。具体来说，选取实施例1制备的PVRIG基因人源化纯合子小鼠(6周龄)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×10⁵个)，待肿瘤体积约100-150mm³后，按瘤体积分为对照组或治疗组(n＝5/组)。对照组注射hIgG(购自：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；货号：AG-0011)，治疗组使用COM-701(G2，药物信息参见专利文本(公开号US10213505B2))和SRF-813抗体(G3，药物信息参见专利文本(公开号US20200040081A1))。具体分组和给药情况见表3。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm³时执行安乐死。实验周期内小鼠体重情况和肿瘤体积测量结果分别如图14-16所示。

表3：分组及给药情况

表4中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时、分组后14天、分组后第17天时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠情况、肿瘤(体积)抑制率(TumorGrowth Inhibition value，TGI_TV)以及治疗组与对照组小鼠肿瘤体积的统计学差异(P值)。

表4：肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率

如图14、15和表4所示，整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好，在第17天时，所有治疗组(G2、G3)与对照组(G1)相比，动物体重呈增长趋势(图14和15)，均无明显差异(P>0.05)，表明动物对抗人PVRIG抗体COM-701和SRF-813的耐受性良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。如图16和表4所示，从肿瘤体积结果上看，在各个时期，治疗组肿瘤体积均小于对照组，且在第17天，G2和G3组小鼠肿瘤体积分别为1662±312mm³和2058±433mm³，均小于对照组2388±243mm³。实验结果表明本发明实施例的方法制备的PVRIG人源化小鼠可用于靶向人PVRIG的药物的体内药效检测。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> PVRIG基因人源化非人动物的构建方法及应用

<130> 1

<150> CN202110650639.4

<151> 2021-06-10

<150> CN202111294418.4

<151> 2021-11-03

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 234

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

Met Arg Thr Gly Asn Thr Gln Ala Ala His Ala Thr Asn Met Gly Gln

1 5 10 15

Met Gln Thr Leu Val Leu Phe Ser Thr Leu Leu Thr Leu Cys Val Ser

20 25 30

Glu Ala Ser Pro Glu Val Trp Val Gln Val Gln Met Glu Ala Thr Asn

35 40 45

Leu Ser Ser Phe Ser Val His Cys Gly Val Leu Gly Tyr Ser Leu Ile

50 55 60

Ser Leu Val Thr Val Ser Cys Glu Gly Phe Val Asp Ala Gly Arg Thr

65 70 75 80

Lys Leu Ala Val Leu His Pro Glu Phe Gly Thr Gln Gln Trp Ala Pro

85 90 95

Ala Arg Gln Ala His Trp Glu Thr Pro Asn Ser Val Ser Val Thr Leu

100 105 110

Thr Met Gly Gln Ser Lys Ala Arg Ser Ser Leu Ala Asn Thr Thr Phe

115 120 125

Cys Cys Glu Phe Val Thr Phe Pro His Gly Ser Arg Val Ala Cys Arg

130 135 140

Asp Leu His Arg Ser Asp Pro Gly Leu Ser Ala Pro Thr Pro Ala Leu

145 150 155 160

Asn Leu Gln Ala Asp Leu Val Arg Ile Leu Gly Thr Ser Gly Val Phe

165 170 175

Leu Phe Gly Phe Ile Phe Ile Leu Cys Leu Arg Trp Gln Gln Arg His

180 185 190

Trp Cys Leu Ser Lys Ser Gln Pro Ser Leu Thr Ser Thr Gln Ala Gln

195 200 205

Val Glu Thr Gln Pro Pro His Leu Ala Ser Thr His Ser Ser Phe Ile

210 215 220

Ser Met Glu Asn Gly Leu Tyr Ala Leu Ala

225 230

<210> 2

<211> 326

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Arg Thr Glu Ala Gln Val Pro Ala Leu Gln Pro Pro Glu Pro Gly

1 5 10 15

Leu Glu Gly Ala Met Gly His Arg Thr Leu Val Leu Pro Trp Val Leu

20 25 30

Leu Thr Leu Cys Val Thr Ala Gly Thr Pro Glu Val Trp Val Gln Val

35 40 45

Arg Met Glu Ala Thr Glu Leu Ser Ser Phe Thr Ile Arg Cys Gly Phe

50 55 60

Leu Gly Ser Gly Ser Ile Ser Leu Val Thr Val Ser Trp Gly Gly Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ala Gly Gly Thr Thr Leu Ala Val Leu His Pro Glu Arg Gly

85 90 95

Ile Arg Gln Trp Ala Pro Ala Arg Gln Ala Arg Trp Glu Thr Gln Ser

100 105 110

Ser Ile Ser Leu Ile Leu Glu Gly Ser Gly Ala Ser Ser Pro Cys Ala

115 120 125

Asn Thr Thr Phe Cys Cys Lys Phe Ala Ser Phe Pro Glu Gly Ser Trp

130 135 140

Glu Ala Cys Gly Ser Leu Pro Pro Ser Ser Asp Pro Gly Leu Ser Ala

145 150 155 160

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Ile Leu Arg Ala Asp Leu Ala Gly Ile Leu

165 170 175

Gly Val Ser Gly Val Leu Leu Phe Gly Cys Val Tyr Leu Leu His Leu

180 185 190

Leu Arg Arg His Lys His Arg Pro Ala Pro Arg Leu Gln Pro Ser Arg

195 200 205

Thr Ser Pro Gln Ala Pro Arg Ala Arg Ala Trp Ala Pro Ser Gln Ala

210 215 220

Ser Gln Ala Ala Leu His Val Pro Tyr Ala Thr Ile Asn Thr Ser Cys

225 230 235 240

Arg Pro Ala Thr Leu Asp Thr Ala His Pro His Gly Gly Pro Ser Trp

245 250 255

Trp Ala Ser Leu Pro Thr His Ala Ala His Arg Pro Gln Gly Pro Ala

260 265 270

Ala Trp Ala Ser Thr Pro Ile Pro Ala Arg Gly Ser Phe Val Ser Val

275 280 285

Glu Asn Gly Leu Tyr Ala Gln Ala Gly Glu Arg Pro Pro His Thr Gly

290 295 300

Pro Gly Leu Thr Leu Phe Pro Asp Pro Arg Gly Pro Arg Ala Met Glu

305 310 315 320

Gly Pro Leu Gly Val Arg

325

<210> 3

<211> 4118

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaacttaaag tataaattta gctctcatat cttatccata acaaaaacct tcctttatgg 60

aggggcattt cagcacttac tttcctgtgc atcctcacat ccaatacgga actcagagga 120

cggcttgcag gcattctttc tctccttcta ccatgtgatt gaactcaggt catcacccta 180

gtggcaagtg catctaccag ttatgccccc aaattctgga ttttaatgga ctgggccatg 240

cagtaccctg tgtttggacc tcaagaaatg ggtcttgctg gaatcactgc ctgattttct 300

gtctgcatta ggccaagcca gtagacagaa agaacaaggg aacccagtga agagctggtt 360

acttccacaa ggagactggg atatggaggt caggacttat gggggaagaa gtatctgtgt 420

gactgggcag tggtggtgta tacctttact cccaacattt gggaggcaga ggcaggcaga 480

tttctgagtt cgaggccagc ctggtctaca gagtgagttc caggacagcc agggctatac 540

agacaaaccc tgtctcgaaa aaccaccccc caaaaagtac ctgtgtgaag acttccatgc 600

ctgaactgag gaggctgatt gatattcatc ccatctccac ggaggtacag gaaagatcat 660

gatgctctgt gttgtcatat cttgctcata aatctctctc tctctctctc tctctctctc 720

tctctctctc tctctctcac acacacacac cccaacacac tctgtacccc agtgtcctgg 780

agagagaagc ttcaaggaag gtgtcatacc atggccacta accttcactg agggtacacg 840

ccacaaccag ctgagtgtcc caactatact aacagactta atcctttagc cacacacagc 900

ttcttggcag gcaatattag ttatttttct tgttgttatt ggtacagaaa agactaggag 960

taataaattg atgttacaga gaattaagag gaattcagtt gaaggagcac tgtttctaat 1020

gtgactcaag gcagaatagt acagtaacca gattgttaga aactgtagga agggaaattt 1080

tttatagtgt agggagccaa tcttgactac cagccatcag gcccatctgc atatcaaaga 1140

acatgcttct gtctacccta agcttcaagc tggctggcct gaaagcttct agggattctc 1200

ctgtctccac cttttacctc cccaaagaaa tgatgggatt atacacagca gctaccaagt 1260

ccagcctttg catgggttct aggtattcat aaaaaaagat cctcatgcct caagcttttt 1320

tttttttttt tttaaacaca ttaaggcccc tccatagact tctcagctga gttctcagtt 1380

tcttctacat gttggtaaat ggtgtcaacc aaagcagaga ggactgcccc ttcagtactt 1440

gaagttagcc tgtttgccac tgcagcaaag aatttgattg ctggcatcac agcctgcctg 1500

ctgtgacagc cattcaagta ggaagtgcca ccctaaggca gctatctgga ggtgatgaaa 1560

caggcaggat ctcagcaagt gggagatgga gtcctttata cgtaggtgat tgacgttagc 1620

agccccttgt gccccaggga ttgttgatag aaaaaaaaaa aagagacata acactcacgt 1680

caaagatgag aaatagttta ttctggagcc aaggtcatgg cctggggaca caggttgaag 1740

ttgctccaaa ttccatgctc ctacatggaa gcaggtttgt gaaatcttta tagtaacaga 1800

agaaagccaa atcaagatac tttaaaaata tgttggtgga accattaagt caacagtaga 1860

ggtaggcaaa gggggaaacc ttgtgttact aggccgcaga ggctatgtga cagtgtttta 1920

agcatttggt tggctggcaa gctagcacta tgtttgacca ttccaagtgg ttccaaatct 1980

aaagtcaagt acagaagtaa gttggtctta aggtggctaa cgatggcaca agataatgta 2040

gctctggact taaaacattc caaactctca ataatctctg acgttccaat cagcttatta 2100

atcttgcagt cattcatgaa aggcagagct ttgttatggg aacttttttt tccatttttt 2160

tattagatat tttctttatt tacatttcaa atgctatccc gaaagttccc tataacctgc 2220

gcccctcccc cgccccaccc tgctccacta cccacccact cccacttctt agccctggtg 2280

ttcccctgta ctggggcata taaagtttgc aagaccaagg ggcctctctt cccgatgatg 2340

gccaattagg ccatcttctg ctgcataact tttaaagatc ctttagccta cgtagcctga 2400

cctcaggtta gtcagctttg tcacattaac tggtgaaagc aggtctctgt caggtctctg 2460

ggcctcagag gagatcaaag aatgaagaga atgctggcca gaccaggaac tgtggggaca 2520

aaggcctgga gaccactctg gtaggcactg tgagggctag tttatatgtc tgcagcggca 2580

aggataaaga gacaaaatag tgttcagata gagagagccc gggctctggt gtagacctgg 2640

gattctggtt ctcagtacac agcgttctga tccctggaca gggtcggtca cctgtcacca 2700

catataccgc agcatcctgg tcaatttgtg gcattctcta aattactttg tgtaggacaa 2760

agagcagtgg caatgcttgt ggaaagaaaa aacaatttgg tggggacagt gactgcctcc 2820

atgacacaat tcatgggcaa gggccaacct gcccttggga cttcccaatt caataaagca 2880

atatgtcaca tagcaatatg acacatgggg gtggggagag ttaagaacag aagcaggtct 2940

gagagaaact tcaatgtttt ggttcctaga gaaataagga agagcaagca aaggaatgat 3000

ccgtgtgttt tgagggtcac ctgggctgct gcagtgaagc caaggttgat gtggggtgat 3060

cagcaagcca atttgttatt ttgctcttcc cagcagatga cattaatagg tagatggtgg 3120

taagggaggc agagagaaat cagttggtca gaatgggagt cagcaggatg gagatgaaca 3180

aacagcttca gggctaagca gtttgaagtt aatgtgctaa caagcagagc tctgaatggg 3240

acaagtgaag accactctta ttagtgttat gaaatataaa atataaattg tggtataaca 3300

tggtaggagt aatacttggc aggacagtgc cgagatgttc ctctgaggaa tcacaccatg 3360

cagcatgcct gtataaagat ttattgtgga gatgggagtg ggaacctgga aagaggtaga 3420

ggcagagaaa ggataggaca gagaaagaca ggaagagaga aagagagcaa gagaggcctg 3480

ccaggaacac atgggaactg agagagtggg aaagggagaa gtgggggtag ggctgtgagc 3540

agtcctcttt agatgatgct gcgctgccag gcacctgcct cacaccgggt ggggcagaga 3600

caagcttttg ctgggtagcc attgggcaga attgcctgtt tccaggtgga catgggacag 3660

gagctgggaa gggatggtga attgcagatt caaaccaggg actactagta tgtaatactg 3720

agaacacacc ttggggtgtg ctgggtcact caggttggct cctgactgcc tccacaatgg 3780

ctttcctgat tttaggatct tgcaatctcc agttgttcca ttccctgccc cttagctgtg 3840

tagggctgaa tgggataagg gctaagttcc tcaggggcag ccatggaccc tcctctctct 3900

gaggcaaaga gacgattgac ctcagcgacc tctgcagctt tcctcactac tactgcagat 3960

ctaggaagta gcaagcaaag cctggtactg taactttaag agggacaacc cattaccctg 4020

agttcactac cactgaggcc tgcaaaaagg aaataaggct aggttgtggg aagttaccac 4080

agtgcctcta actgctgaca atgtgaaaac ctccagcc 4118

<210> 4

<211> 3159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cttccagaat aacagctctg agacttaaat atatttacaa atgcctaggc caaagctctg 60

gcttgttttt tgattatctc ataatttaat aacctatttg ccttattctt tgtaaaccac 120

atgggtggct acttctgctc aggttctata catctgtcct tcttagagtc cccagggtga 180

atcctcccac acttgactct atctcagaat tactctctct gtactgaaac ttccacctcc 240

ctatatccta cctaagctaa taggctaaca gcatttttat agacaagtga tgtttccatt 300

caagagattc tctctacaga ggcaggcaga gagagacctt gaagacacag ggttgactat 360

aggctcatac acctgaaatt gttctaccta ggagctgtgc tcctctgcag gagacaagca 420

ccctgggctc ctgtaccatc cacagagaag acaaaatgag ctgtaagcct tgtgagaacc 480

ttgtgagccg taaggaccct gggtttggat tcctgggcca ctctagcctg gcaaaccaca 540

tagcttgaat acatgggagg ttccccttgc ttgtggggta catccggagg ctaaggaagc 600

cttaggaaca tgaagattgc aaacagggag actaaactgt tgtttggtct gtttaggctt 660

taatgccctt gaaccaaacc tgaaagatgg agaagcttgg gatcctgtac agggtagaga 720

atcaggaagt cttttaagga aaaatctgag cataagcatt cctagtgggc atcctgggaa 780

accctgttag tggttttgtt cctaccagct gacaactaac cccactgctg aggggccaga 840

tggtccccac agggccatag cacaagaagc ccagaagcca ctggcaaggg gataacttca 900

cagcagctgt gagttagggc agggtgacct ggaattcata gcccagccct ctgctgggag 960

ggggagctgg accatcctca ggcactctcc ggaagctgcc actggctgtt gcttttccca 1020

actactcacc tctgggaaga ccagcaacta ggcccccaag aatcctccac agactcctct 1080

gcctccagtc accccgagtc tgacttcctt ggtatagtct ctgccaccct cagccttatt 1140

cccttgacaa ttctgcttgt ggtgtctcca tagtctttct caccttccct atgtctgctg 1200

catgtcccct tgcaacttgc tgggtgtctg taccccagca tagccctcct ggcagtctag 1260

attcataact accacatcct gagaagcctg taccacattc tgaattggcc caagatcttt 1320

tcttcctcag tccaacctca ctccaaccag tggcaagcct atggaagctg tgggactgag 1380

gggttgtgtg accttgaatc aatggctagc ctttagacct caaaccattg cctagtgcat 1440

tgttctcagg ttctcaactc cagcttcctg gggccaccat gcataggaag tatccaaaag 1500

actgccaaca atgacaacaa gctatggaat atgaaaagaa aatcaggtct gagatcttgg 1560

ccagcaggac cagggagaag gcccttgtca gggtggtgtg gtgtgggaaa ggtctgattg 1620

gaacagtgga gccttcctcc ttctttctat tgcatgagat tttccaaagc cccacagggg 1680

agtcacttta accatatccc ccaaagcaca ggacattagg tctgttagca aagttatggt 1740

gaagagggac aaggtttcca aaccgaggtt ccagccaacc tctgcagaac aggggtcagt 1800

ggcagaaagg attctgtaga tccactctta aaccgattca gcatctgtga aataaaataa 1860

cttgctcaca agacagtgat ggctggaaag agtccagggt ctgagagctg ccacaaacag 1920

ctcttccaga agagtgaagg acaagataag gcagaaggtc aaagtgagag agaggaggac 1980

cagccagcta tggcatgcct gttggtggcc agctatggtg ccttgccctc catatcctcc 2040

ttcaggatgt ctaagcacgg atgcatactg ggctggaaaa atgaagcaga gtccagaatg 2100

ggtggggtct gtaggattct ggtcttttct ggctgggagt gagtgccaag gggtagaagg 2160

ctttctctaa ggattgtagt gttacagttc ttttagacaa tactcaatga aacagctctc 2220

ttagacgctc ttcagtgaaa cagctggtgt gcatacactt tatttggggt ggacaatggt 2280

tgtatatgaa tcttggagag ttggaaggag ttttcaggtt gaatgtaaaa tcattggcca 2340

gagtttaatc ccaggttctt gctggatggg tccttatttg gaaagatgtt gaacttatag 2400

tttgccaagt tgaacttgta ggtttgcaac cttctccaga tagagggtgt gggggtcagg 2460

ctccccagac aaggtcagag aggggaaacc catgctggaa aaaaaggagt ccctcatttt 2520

gcgccaagct cagatgagtg agctatctgg acatggtaga cttggacctt aagtagcaag 2580

gtttccaaac atctcccccc cccccccccg ttttatttat aatggagaga tgtcatagta 2640

gccttcagcc cctgtgttgg gaacagtttg gtactgagct agaacccagt tggcaatggt 2700

ttttgtaatg ctactcatct gctgttttaa aaattggaca aggcagggtg ccaggaggag 2760

ggctctgatg gccagtacag ggccaaggag ggcagggaga agccaagcca caagggggtt 2820

tgagtaccat gaggttgggg tgttagacac atagcaggct tggagattcc cagtgcagat 2880

gagcatttgt atgtcttgtt ccaccagaca gatttgttaa catagaatca gcattccttt 2940

cccaatataa tgcaggtcct tcactgtttg gcagtcatca agtccagagc aactcccact 3000

aggaagttta tgtgttgttg aaggttgaag ggactcaaga ccatctgtag tagaagcctg 3060

gtcaagcttg tcctggaagt ctctggccaa atggcgtgct tgggctgttt cagctgctcc 3120

tgtggcaccc agtgagactg taagacccag tctgatgaa 3159

<210> 5

<211> 674

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgagaacag aggcacaggt gccggccctg cagcccccag aacctggact ggagggggcc 60

atggggcacc ggaccctggt cctgccctgg gtgctgctga ccttgtgtgt cactgcgggt 120

gagtgccggc accagagagg ggcaggggct gcagggaggg tgatgtagga caacagccca 180

ccgaccttgc tgctgttcca cagggacccc ggaggtgtgg gttcaagttc ggatggaggc 240

caccgagctc tcgtccttca ccatccgttg tgggttcctg gggtctggct ccatctccct 300

ggtgactgtg agctgggggg gccccaacgg tgctgggggg accacgctgg ctgtgttgca 360

cccagaacgt ggcatccggc aatgggcccc tgctcgccag gcccgctggg aaacccagag 420

cagcatctct ctcatcctgg aaggctctgg ggccagcagc ccctgcgcca acaccacctt 480

ctgctgcaag tttgcgtcct tccctgaggg ctcctgggag gcctgtggga gcctcccgcc 540

cagctcagac ccaggtgggg ccggggcgag gggtccagga gggcagggag gggctcggga 600

actggccacc catctgattc ttgtctccgt gcccagggct ctctgccccg ccgactcctg 660

cccccattct gcgg 674

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gctgacaatg tgaaaacctc cagccatgag aacagaggca caggtgccgg cc 52

<210> 7

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccgccgactc ctgcccccat tctgcgggca gacctggtga ggatcttggg aacctc 56

<210> 8

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtgttttct ctcatggcct caagcctatc gaaggagtac tgaattccga agttcctatt 60

ctctagaaag 70

<210> 9

<211> 88

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaagtatag gaacttcatc agtcaggtac ataatggtgg atctgatatc catatgcttc 60

cagaataaca gctctgagac ttaaatat 88

<210> 10

<211> 1283

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgacctctgc agctttcctc actactactg cagatctagg aagtagcaag caaagcctgg 60

tactgtaact ttaagaggga caacccatta ccctgagttc actaccactg aggcctgcaa 120

aaaggaaata aggctaggtt gtgggaagtt accacagtgc ctctaactgc tgacaatgtg 180

aaaacctcca gccatgagaa cagaggcaca ggtgccggcc ctgcagcccc cagaacctgg 240

actggagggg gccatggggc accggaccct ggtcctgccc tgggtgctgc tgaccttgtg 300

tgtcactgcg gggaccccgg aggtgtgggt tcaagttcgg atggaggcca ccgagctctc 360

gtccttcacc atccgttgtg ggttcctggg gtctggctcc atctccctgg tgactgtgag 420

ctgggggggc cccaacggtg ctggggggac cacgctggct gtgttgcacc cagaacgtgg 480

catccggcaa tgggcccctg ctcgccaggc ccgctgggaa acccagagca gcatctctct 540

catcctggaa ggctctgggg ccagcagccc ctgcgccaac accaccttct gctgcaagtt 600

tgcgtccttc cctgagggct cctgggaggc ctgtgggagc ctcccgccca gctcagaccc 660

agggctctct gccccgccga ctcctgcccc cattctgcgg gcagacctgg tgaggatctt 720

gggaacctca ggagttttcc tgtttggttt catctttata ctatgtctcc ggtggcagca 780

gaggcattgg tgtttgagta aatctcagcc atctctcact agcacccagg cacaggtgga 840

gactcagcct ccccacttgg cctctacaca cagcagcttc atctccatgg agaatggact 900

gtatgctctg gcatgagtga aacttcccca cactcttccc aacttccacc gactgtctgg 960

agcacagtac cctggaaaaa tgcttagaag ttcaatgaca ggtacccttg gtccactaca 1020

ggcctttgga acatctatct actgatgtct tcaacctggg caccaggctt cttcatgaat 1080

cttgctctat tcttaagctt ctgatcagtg tcatcaaacc ctgctagcca ggatgtggtt 1140

attgagtgtg cataaatgga cacaagtgtg agccgaagag tacgacaaag gttcagttac 1200

atcctgtttt tgcacacatt tccaaacacc cagatgattt ctttaccaat gtccataaag 1260

tggtccttct gtttgggact tta 1283

<210> 11

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Met Arg Thr Glu Ala Gln Val Pro Ala Leu Gln Pro Pro Glu Pro Gly

1 5 10 15

Leu Glu Gly Ala Met Gly His Arg Thr Leu Val Leu Pro Trp Val Leu

20 25 30

Leu Thr Leu Cys Val Thr Ala Gly Thr Pro Glu Val Trp Val Gln Val

35 40 45

Arg Met Glu Ala Thr Glu Leu Ser Ser Phe Thr Ile Arg Cys Gly Phe

50 55 60

Leu Gly Ser Gly Ser Ile Ser Leu Val Thr Val Ser Trp Gly Gly Pro

65 70 75 80

Asn Gly Ala Gly Gly Thr Thr Leu Ala Val Leu His Pro Glu Arg Gly

85 90 95

Ile Arg Gln Trp Ala Pro Ala Arg Gln Ala Arg Trp Glu Thr Gln Ser

100 105 110

Ser Ile Ser Leu Ile Leu Glu Gly Ser Gly Ala Ser Ser Pro Cys Ala

115 120 125

Asn Thr Thr Phe Cys Cys Lys Phe Ala Ser Phe Pro Glu Gly Ser Trp

130 135 140

Glu Ala Cys Gly Ser Leu Pro Pro Ser Ser Asp Pro Gly Leu Ser Ala

145 150 155 160

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Ile Leu Arg Ala Asp Leu Val Arg Ile Leu

165 170 175

Gly Thr Ser Gly Val Phe Leu Phe Gly Phe Ile Phe Ile Leu Cys Leu

180 185 190

Arg Trp Gln Gln Arg His Trp Cys Leu Ser Lys Ser Gln Pro Ser Leu

195 200 205

Thr Ser Thr Gln Ala Gln Val Glu Thr Gln Pro Pro His Leu Ala Ser

210 215 220

Thr His Ser Ser Phe Ile Ser Met Glu Asn Gly Leu Tyr Ala Leu Ala

225 230 235 240

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gtgtagggct gaatgggata agggc 25

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgacacaca aggtcagcag cac 23

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aaggcccctc catagacttc tcagc 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggggctgcta acgtcaatca cctac 25

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tccatggaac gttgaatacc agaagt 26

<210> 17

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tggtgcaagt ctataattac agcaggtc 28

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gagatgaggc tatatcctaa gaccc 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gttcagaagc agagaggaga gggca 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

aacctgagca gaagtagcca cccat 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gctccaattt cccacaacat tagt 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tgaccttgtg tgtcactgcg 20

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggctgagatt tactcaaaca cca 23

<210> 27

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gtctctgaag caagccctga g 21

<210> 28

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggtgctagtg agagatggct g 21

<210> 29

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tcaccatctt ccaggagcga ga 22

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gaaggccatg ccagtgagct t 21

Claims

1.一种人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的部分。

2.根据权利要求1所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白包含人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的全部或部分，优选的，所述的人PVRIG蛋白的部分包含人PVRIG蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含人PVRIG蛋白胞外区至少20个连续氨基酸，优选的，包含SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第40-169或40-172位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白还包含人PVRIG蛋白的信号肽的全部或部分，优选的，包含人PVRIG蛋白信号肽至少5个连续氨基酸，其中，所述的信号肽包含与SEQ ID NO:2的第1-39位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第1-39位所示氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白包含SEQ ID NO：2第1-169位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-169位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-169位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-169位所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列，

优选的，所述的人源化PVRIG蛋白还包含非人动物PVRIG蛋白的部分。

5.根据权利要求1-4任一所述的人源化PVRIG蛋白，其特征在于，所述的人源化PVRIG蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：11所示氨基酸序列；

6.一种编码权利要求1-5任一项所述人源化PVRIG蛋白的核酸。

7.一种人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因包含人PVRIG基因的部分。

8.根据权利要求7所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因包含人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，包含2号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列。

9.根据权利要求7或8所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

10.根据权利要求7-9任一所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因还包含非人动物PVRIG基因的全部或部分，进一步优选包含非人动物PVRIG基因的4号至5号外显子的全部或部分，更进一步优选还包含部分1号外显子和/或部分3号外显子的核苷酸序列。

11.根据权利要求7-10任一所述的人源化PVRIG基因，其特征在于，所述的人源化PVRIG基因的核苷酸序列包含下列组中的任一种：

A)转录的mRNA为SEQ ID NO：10所示核苷酸序列；

E)包含SEQ ID NO：6和/或7所示的核苷酸序列。

12.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体核苷酸序列，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列；

B)编码人PVRIG蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列的全部或部分，优选编码人PVRIG蛋白的胞外区和/或信号肽的全部或部分核苷酸序列，进一步优选编码人PVRIG蛋白的胞外区至少20个连续氨基酸的核苷酸序列，更优选的，还包含编码人PVRIG蛋白的信号肽至少5个连续氨基酸的核苷酸序列，更进一步优选的，编码SEQ ID NO：2第1-169位的核苷酸序列；

C)人或人源化PVRIG基因的核苷酸序列；或，

D)人PVRIG基因的1号至6号外显子的全部或部分，优选的，人PVRIG基因的2号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，2号外显子的部分、3号外显子的全部和4号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含50bp的核苷酸序列，4号外显子的部分至少包含10bp的核苷酸序列，进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或***一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

13.根据权利要求12所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：3所示；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000071.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：4所示。

14.一种非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化PVRIG蛋白。

15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述人源化PVRIG蛋白为权利要求1-5任一项所述的人源化PVRIG蛋白。

16.根据权利要求14或15所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含权利要求6所述的核酸或权利要求7-11任一项所述的人源化PVRIG基因。

17.根据权利要求14-16任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将供体核苷酸序列导入非人动物PVRIG基因座上，优选的，所述的供体核苷酸序列包含下列组中的一种：

A)编码人或人源化PVRIG蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化PVRIG基因的核苷酸序列；或，

18.根据权利要求17所述的构建方法，其特征在于，所述供体核苷酸序列可操作的连接到内源调控元件。

19.根据权利要求17-18任一项所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或***，任选地，所述的导入非人动物PVRIG基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物PVRIG基因的2号外显子被替换，进一步优选的，还包含非人动物PVRIG基因的1号外显子的部分和/或3号外显子的部分被替换。

20.根据权利要求14-19任一项所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求12-13任一项所述的靶向载体进行非人动物的构建。

21.根据权利要求14-20任一项所述的构建方法，其特征在于，进一步包括将PVRIG基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、TIGIT、OX40、LAG3、TIM3、CD27、CD47、SIRPA、CTLA4和CD226中的至少一种。

22.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官表达权利要求1-5任一项所述的人源化PVRIG蛋白，或者，所述的细胞、组织或器官包含权利要求6所述的核酸或权利要求7-11任一项所述的人源化PVRIG基因，或者，权利要求14-21任一项所述的构建方法获得的非人动物。

23.一种荷瘤后的瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织表达权利要求1-5任一项所述的人源化PVRIG蛋白，或者，所述的瘤组织包含权利要求6所述的核酸或权利要求7-11任一项所述的人源化PVRIG基因，或者，权利要求14-21任一项所述的构建方法获得的非人动物。

24.一种权利要求1-5任一所述的人源化PVRIG蛋白、权利要求6所述的核酸、权利要求7-11任一所述的人源化PVRIG基因或权利要求14-21任一所述的构建方法获得的非人动物的应用，其特征在于，所述的应用包含：

E)研究PVRIG基因功能，研究针对人PVRIG靶位点的药物、药效，研究与PVRIG相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

25.根据权利要求4-5任一所述的人源化PVRIG蛋白、权利要求10-11任一所述的人源化PVRIG基因、权利要求14-21任一所述的构建方法、权利要求22所述的细胞、组织或器官、权利要求23所述的瘤组织，其特征在于，所述非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。