CN114990098B

CN114990098B - 一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用

Info

Publication number: CN114990098B
Application number: CN202210642388.XA
Authority: CN
Inventors: 潘强; 任慧英; 于凌云; 孙虎芝; 田延军
Original assignee: Beijing Nuoan Parkway Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Nuoan Parkway Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2022-06-08
Filing date: 2022-06-08
Publication date: 2023-05-12
Anticipated expiration: 2042-06-08
Also published as: CN114990098A

Abstract

本申请属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用。一种葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。一种编码权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶PB50的基因，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。本申请的裂解酶能够快速裂解葡萄球菌，裂解酶的异源表达可溶性强，包涵体较少。

Description

一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用

技术领域

本申请属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用。

背景技术

自弗莱明发现青霉素以来，抗生素由于其广谱性和高效性的优点，被广泛快速地应用于医疗、农业、畜牧业、养殖业等，使具有天然耐药性或者获得耐药性的病原细菌大量繁殖，也使细菌的耐药性不断增强。从而导致细菌耐药性成为一个全球性的问题。已开发抗生素类药物有上百种，开发新型抗生素的速率，远远赶不上耐药菌的进化速率，随着耐药性的增强，最终也会使细菌感染变得无药可治。据报道，抗生素会引发包括过敏反应、肾毒性、心脏毒性、肝毒性和神经毒性等不良反应，促使人类需要开发更安全、高效的替抗产品。

目前应用研发较多的替抗产品包括植物提取物、酸化剂、微生态制剂、噬菌体及其裂解酶等。噬菌体裂解酶是双链DNA噬菌体在感染宿主细胞的后期表达的一种细胞壁水解酶。裂解酶在“杀死”细菌方面，具有以下优势：第一，裂解酶与其来源噬菌体相比，裂解谱更广，可以作用于更多病原菌；第二，裂解酶裂解速率快，通常数分钟即可完成裂解过程；第三，与抗生素、溶菌酶等其他抗菌剂联用效果更好，可以降低单一药物的副作用，并降低耐药性的产生；第四，未见耐药性相关报道。在减抗、替抗的大背景下，裂解酶体现的诸多优势，使其在农业、养殖、食品安全、医疗等领域具有较高的可开发价值。

葡萄球菌属是一群革兰氏阳性球菌，能引起人和动物的许多严重感染，在人类患病、畜禽疾病及各类环境微生物、食品源微生物中的检出率极高。而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的传播给临床治疗带来了巨大的挑战。我们期望能够找到一种应对葡萄球菌感染的裂解酶，从噬菌体基因组出发，挖掘更多新型、广谱的裂解酶，为农业、养殖、食品安全、医疗等领域的减抗替抗事业，开辟更多可能性。高效、广谱的噬菌体裂解酶，在葡萄球菌感染的治疗、消杀方面具有巨大的产业化价值。但是，噬菌体裂解酶在异源表达时，通常存在可溶性差、包涵体较多的难题。获得高效、广谱的噬菌体裂解酶是很有必要的。

发明内容

为了获得高效、广谱的葡萄球菌噬菌体裂解酶，本申请提供一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用。

第一方面，本申请提供一种葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

第二方面，本申请提供一种编码权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶PB50的基因，所述基因序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本申请提供编码葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的基因的用途，应用时采用该基因重组表达产生权利要求1所述的能裂解葡萄球菌的酶。

第四方面，本申请提供一种抑菌组合物，包括上述葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50。

第五方面，本申请提供一种抑菌剂，其主要活性成分为葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50、含有PB50表达元件的载体、含有PB50表达元件的表达盒或含有PB50表达元件的宿主细胞中的至少一种，裂解酶PB50的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示或者编码葡萄球菌裂解酶PB50的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，抑菌谱为人源葡萄球菌和动物源葡萄球菌。

第六方面，本申请提供一种PCR引物组，包括特异性扩增葡萄球菌噬菌体PB50基因的引物对pET22b-PB50-F’和pET22b-PB50-R’、pET25b-PB50-F’和pET25b-PB50-R’、pET28a-PB50-F’和pET28a-PB50-R’或pET32a-PB50-F’和pET32a-PB50-R’，

各个引物的核苷酸序列分别为：

pET22b-PB50-F’：GGAATTCCATATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTGNde I酶切位点

pET22b-PB50-R’：CCGCTCGAGACTAAATGTACCCCATGCAGCAC

Xhol I酶切位点

pET25b-PB50-F’：GGAATTCCATATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTGNde I酶切位点

pET25b-PB50-R’：CCGCTCGAGACTAAATGTACCCCATGCAGCAC

Xhol I酶切位点

pET28a-PB50-F’：CGGGATCCATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

BamH I酶切位点

pET28a-PB50-R’：CCGCTCGAGTTAACTAAATG TACCCCATGC AGCACCA

Xhol I酶切位点

pET32a-PB50-F’：CGGGATCCATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

BamH I酶切位点

pET32a-PB50-R’：CCGCTCGAGTTAACTAAATG TACCCCATGC AGCACCA

Xhol I酶切位点，

引物对用于扩增的目的片段的大小为798bp。

第七方面，本申请提供一种葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的制备方法，包括以下步骤：

以葡萄球菌噬菌体基因组为模板，加入引物，进行PCR扩增，回收葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的编码基因，与相同酶切后的表达载体骨架连接，验证为阳性的重组表达载体pET-PB50转化表达宿主BL21(DE3)后，经液体培养基培养，诱导表达，收集菌体，提取，纯化，葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

优选的，所述的酶切采用Nde I/Xho I或者BamH I/Xho I双酶切。

优选的，所述的表达载体骨架为pET22b、pET25b、pET28a或pET32a。

综上，本申请至少具有以下有益效果。

1、本申请的裂解酶能够快速裂解葡萄球菌，裂解酶的异源表达可溶性强，包涵体较少，解决了现有的噬菌体裂解酶在异源表达时，通常存在可溶性差、包涵体较多的技术问题。

2、裂解酶与其来源噬菌体相比，裂解谱更广，可以作用于更多病原菌。

3、裂解酶裂解速率快。

4、与抗生素、溶菌酶等其他抗菌剂联用效果更好，可以降低单一药物的副作用，并降低耐药性的产生。

5、在减抗、替抗的大背景下，裂解酶体现的诸多优势，使其在农业、养殖、食品安全、医疗等领域具有较高的可开发价值。

说明书附图

图1：PB50在不同表达菌株中的表达情况电泳图(一)。

图2：PB50在不同表达菌株中的表达情况电泳图(二)。

图3：PB50粗酶液的抑菌效果图。

图4：PB50蛋白纯化电泳图。

图5：100ul酶液对5ml菌液的裂解效果。

图1中：

M：marker。

1.pET22b-PB50/BL21诱导组破碎上清。

2.pET22b-PB50/BL21诱导组破碎沉淀。

3.pET22b-PB50/BL21对照组破碎上清。

4.pET25b-PB50/BL21诱导组破碎上清。

5.pET25b-PB50/BL21诱导组破碎沉淀。

图2中：

M：marker。

1.pET25b-PB50/BL21诱导组破碎上清。

2.pET25b-PB50/BL21诱导组破碎沉淀。

3.pET32a-PB50/BL21诱导组破碎上清。

4.pET32a-PB50/BL21诱导组破碎沉淀。

5.pET28a-PB50/BL21诱导组破碎上清。

6.pET28a-PB50/BL21诱导组破碎沉淀。

7.pET28a-PB50/BL21诱导组破碎上清。

8.pET28a-PB50/BL21诱导组破碎沉淀。

图4中：

M：Marker。

CL：粗酶液；

FT：穿流液；

W1-W4：杂蛋白洗涤液；

E1-E7：目的蛋白洗脱液。

具体实施方式

菌株、质粒、培养基与试剂

大肠感受态BL21(DE3)：购自北京天根生化科技有限公司。

表达载体：购自Novengen公司。

NB培养基：购自BD公司。胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，补水至1L。固体NB培养基：在NB培养基基础上加入15g琼脂粉。121℃高压灭菌20min。

1、噬菌体的分离

2021年12月从潍坊诸城市养殖场的貂的肺部分离葡萄球菌噬菌体，具体操作步骤：取生物体样本5g，用10mL噬菌体缓冲液(phage buffer)浸泡30min。使噬菌体充分进入缓冲液中，4500g离心10min，小心吸取上清，用0.22μm过滤器过滤除菌。

2、全基因组测序

该上述噬菌体经纯化后进行全基因组测序。经RAST在线预测，获得297个开放阅读框,挖掘到一个假设蛋白序列，命名为基因PB50。PB50基因全长798bp，编码265个氨基酸。该蛋白序列具备CHAP和SH3结构域。

3、重组表达载体的构建

构建pET22b-PB50、pET25b-PB50、pET28a-PB50和pET32a-PB50四个重组质粒。使其带有组氨酸纯化标签或其他促进表达的氨基酸修饰，本实施例是使其带有组氨酸纯化标签。以噬菌体基因组为模板，设计引物如下：

pET22b-PB50-F’：GGAATTCCATATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

Nde I酶切位点

pET22b-PB50-R’：CCGCTCGAGACTAAATGTACCCCATGCAGCAC

Xhol I酶切位点

pET25b-PB50-F’：GGAATTCCATATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

Nde I酶切位点

pET25b-PB50-R’：CCGCTCGAGACTAAATGTACCCCATGCAGCAC

Xhol I酶切位点

pET28a-PB50-F’：CGGGATCCATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

BamH I酶切位点

pET28a-PB50-R’：CCGCTCGAGTTAACTAAATG TACCCCATGC AGCACCA

Xhol I酶切位点

pET32a-PB50-F’：CGGGATCCATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

BamH I酶切位点

pET32a-PB50-R’：CCGCTCGAGTTAACTAAATG TACCCCATGC AGCACCA

Xhol I酶切位点

以2ul基因组为模板，分别加入引物1ul，采用Prime STAR Max进行PCR扩增目的基因。PCR程序如下：(1)98℃，2min；(2)98℃，10s，58℃，10s，72℃，5s，30个循环；(3)72℃，10min。将PCR产物进行凝胶电泳回收，确定条带大小符合预期。将PB50基因采用双酶切，T4连接酶16℃过夜连接的方法连接至4个质粒中，构建不同的重组质粒，并使用常规热激法将重组质粒转化至表达菌株BL21(DE3)。采用0.1mM IPTG诱导PB50蛋白表达，20℃诱导24h后，用PBS(50mM，pH7.0)洗涤菌体2次，以1/10体积的PBS重悬菌体，超声破碎释放胞内蛋白，超声条件为200W，超声3s，间歇5s，循环70次。离心收集破碎液上清和沉淀，经SDS-PAGE分析蛋白可溶性。

参考图1，PB50在pET22b-SA210/BL21和pET25b-SA210/BL21菌株内可以进行可溶性表达，参考图2，PB50在pET25b-SA210/BL21、pET28a-SA210/BL21和pET32a-SA210/BL21菌株内可以进行可溶性表达。在pET28a-SA210/BL21菌株内表达时，包涵体较多，约为可溶性蛋白的2倍；在pET32a-SA210/BL21菌株内表达时，几乎都是可溶性表达；在pET22b-SA210/BL21和pET25b-SA210/BL21菌株内表达时，可溶性蛋白为包涵体的2-3倍。综合来看，PB50在不同表达菌株内都能够进行可溶性表达，质粒及酶切位点的选择，会影响可溶性蛋白和包涵体的相对比重。噬菌体裂解酶在异源表达时，通常存在可溶性差、包涵体较多，但是本申请在采用本申请的质粒及酶切位点时，裂解酶在异源表达时可溶性强，包涵体较少。

选择pET22b-PB50/BL21(DE3)菌株进行以下步骤：

参考图3，将破碎液上清在一株人源葡萄球菌的固体平板上点样测试，可见明显的噬菌斑，证实PB50粗酶液具备裂解活性。

4、噬菌体裂解酶的纯化

将构建好的表达菌株用0.1mM IPTG低温诱导24h，收集破碎液上清。采用碧云天蛋白纯化试剂盒(购自碧云天，产品编号P2226)进行纯化。取1ml混合均匀的50％BeyoGoldHis-tag Purification Resin，4℃离心弃去液体；向离心管中加入非变性裂解液平衡凝胶两次；将4ml破碎液上清加入其中，4℃缓慢震荡过夜。将破碎液及混合物转移至亲和层析柱柱管中，收集穿流液。洗柱6次，每次加入0.5ml非变性洗涤液，以除去杂蛋白。洗脱目的蛋白10次，每次加入0.5ml非变性洗脱液，至穿出液中无蛋白。收集所有的穿出液，进行SDS-PAGE分析，确定纯化条件。

参考图4，粗酶液经4℃震荡过夜，可与凝胶完全结合，穿流液中不含目的蛋白。层析柱经四次洗涤即图4中W1-W4，可将杂蛋白完全脱除，避免杂蛋白的影响。经7-10次洗脱即图4中E1-E7，可将纯化后的目的蛋白完全洗脱下来，将有活性的穿出液于4℃，用PBS缓冲液(50mM，pH7.0)透析过夜，获得纯化后的酶液。用Biovision软件，配合Quantum CX5 Edge18.02a成像***，分析获得蛋白纯度可达90％以上。

5、PB50蛋白抗菌活性剂抗菌速率及抗菌谱检测

(1)在5ml菌液中，加入100ul纯酶液混匀，10min左右菌液即可由浑浊变为明显澄清。参照图5所示，图5中左边的试管为5ml菌液的对照；右边的试管为5ml菌液，加入100ul纯酶液混匀，10min后状态图，可以看出其明显澄清，说明裂解酶裂解速率快。

(2)取200μl受试葡萄球菌增殖液，与融化至60℃左右的固体NB培养基混合，迅速倒板。待凝固后，用直径6mm的打孔器在培养基上打孔，吸取纯化后的PB50酶液50μl至点样孔，4℃静置约2小时，待酶液完全吸收后，放于37℃静置培养过夜，测量抑菌圈直径。具体裂解谱结果见表1。

表1PB50裂解酶的裂解谱

所有受试菌株均来自本单位，其中的标准菌株由青岛农业大学赠予。

由表1可知，裂解酶PB50对人源、宠物源、猪源、牛源等不同来源的葡萄球菌均有较好的裂解效果，总裂解率达到89％，裂解活性较高。

基于噬菌体的基因组分析，我们获得了一个对葡萄球菌具有高效裂解活性的蛋白。对于在人医、宠物疾病及畜牧养殖领域，由葡萄球菌引起的各类感染中，裂解酶PB50较为广谱高效的杀菌活性，对于开发新型抗葡萄球菌药物、体外控制葡萄球菌感染具有非常重大的意义。

6、葡萄球菌噬菌体抗菌谱检测

同样取200μl受试葡萄球菌增殖液，与融化至60℃左右的固体NB培养基混合，迅速倒板。待凝固后，用新鲜的葡萄球菌噬菌体增殖液(效价为10⁸PFU/ml)，吸取5ul点在平板上，4℃静置约0.5小时，待完全吸收后，放于37℃静置培养过夜，记录有无噬菌斑形成。具体裂解谱结果见表2。

表2葡萄球菌噬菌体的裂解谱

所有受试菌株均来自本单位，其中的标准菌株由青岛农业大学赠予。“+”

表示有噬菌斑，“-”表示无噬菌斑。

由表1可知，裂解酶PB50对人源、宠物源、猪源、牛源等不同来源的葡萄球菌均有较好的裂解效果，总裂解率达到89％，裂解活性较高。而相同条件下，如表2所示，其来源的葡萄球菌噬菌体对92株受试菌的裂解率仅为39％。

6、葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50抑菌组合物

PB50对受试人源葡萄球菌具有很好的裂解效果，裂解率达到91.3％，因此可用于面部皮肤由葡萄球菌引起的各类感染。向含有PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯0.5％，甘油硬脂酸酯0.5％，氢化卵磷脂0.5％，鲸蜡硬脂醇0.8％，聚二甲基硅氧烷2.0％，氢化米糠油2％，辛酸甘油三酯5％，丙二醇4％，甘油5％，透明质酸钠0.05％，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物0.2％，去离子水54％的润肤乳混合物中，加入1％PB50纯酶液，混合均匀后采用平板涂布的方法测定抑菌效果，发现加入PB50的乳液混合物具有裂解活性，可在菌膜上形成裂解斑。

以上均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、结构、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 北京诺安百汇医药科技有限公司

<120> 一种裂解酶、编码基因、组合物、抑菌剂制备方法及应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 265

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Thr Lys Thr Gln Ala Leu Asp Trp Val Asn Ser Arg Ile Gly

1 5 10 15

Arg Arg Leu Asp Phe Asp Gly Trp Tyr Gly Ala Gln Cys Met Asp Leu

20 25 30

Thr Ile Gly Tyr Cys Asn Tyr Ile Ser Gly Gly Ser Phe Arg Pro Trp

35 40 45

Gly Asn Ala Ile Asn Leu Lys Asp Asn Thr Met Pro Ala Gly Trp Lys

50 55 60

Leu Ile Lys Asn Thr Pro Ser Phe Leu Pro Gln Pro Gly Asp Ile Ala

65 70 75 80

Ile Trp Ala Tyr Ala Pro Tyr Asp Val Tyr Gly His Thr Gly Ile Ile

85 90 95

Thr Ser Ala Asn Leu Asn Asn Phe Tyr Ser Val Asp Gln Asn Trp Phe

100 105 110

Asn Ala Gly Ser Asn Gly Ser Pro Ala Ala Lys Val Phe His Asp Tyr

115 120 125

Thr Gly Phe Trp Gly Val Ile Arg Pro Ala Phe Gly Ser Thr Ser Thr

130 135 140

Lys Lys Ala Thr Pro Lys Lys Ala Ala Pro Lys Lys Lys Val Val Lys

145 150 155 160

Lys Ala Ala Thr Lys Lys Ala Ala Thr Thr Ala Thr Trp Lys Arg Asn

165 170 175

Ser Ala Gly Ile Leu Trp Lys Thr Glu Lys Ala Lys Phe Thr Cys Asn

180 185 190

Val Ser Ser Gly Ile Ile Thr Arg Lys Asn Gly Pro Trp Thr Gly Trp

195 200 205

Ala Gln Gly Pro Phe Met Lys Lys Gly Asp Thr Ile Lys Tyr Asp Glu

210 215 220

Ile Gln Asp Phe Asp Gly His Ile Trp Val Ser Gly Asn Phe Lys Gly

225 230 235 240

Gln Tyr Val Tyr Val Pro Ile Gly Lys Ser Asn Gly Lys Gly Gln Arg

245 250 255

Ile Gly Ala Ala Trp Gly Thr Phe Ser

260 265

<210> 2

<211> 798

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaaaacaa aaactcaagc tcttgattgg gttaatagtc gtattggtcg tagactagat 60

tttgatggtt ggtatggagc tcagtgtatg gatttaacta taggttactg taattatatc 120

tcaggtggtt ctttccgtcc ttggggtaat gcaattaatc ttaaagacaa cacaatgcca 180

gctggatgga aattaattaa aaatactcca tcattcttac ctcaacctgg tgatattgct 240

atttgggctt atgcacctta tgatgtttat ggtcatacag gtattattac ttcagctaac 300

ttaaataact tctattcagt tgaccaaaac tggtttaatg caggaagtaa cggttcaccg 360

gcagctaaag tatttcatga ttatacaggt ttctggggag taattcgtcc agcttttggt 420

agtacatcta ctaagaaagc aactcctaag aaagcggctc ctaagaaaaa agtagttaaa 480

aaagcagcta ctaagaaagc agctacaact gctacttgga aacgtaattc tgcaggaatt 540

ctatggaaaa ctgaaaaagc taaattcaca tgtaatgttt cttcaggaat tattactcgt 600

aaaaatggtc catggactgg atgggctcaa ggtccattta tgaagaaagg tgatactatt 660

aaatatgatg aaattcaaga tttcgatgga catatttggg tatcaggtaa ctttaaaggt 720

caatatgttt atgtaccaat tggtaaatca aatggtaaag gacaacgtat tggtgctgca 780

tggggtacat ttagttaa 798

Claims

1.一种葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO .1所示。

2.一种编码权利要求1所述的葡萄球菌裂解酶PB50的基因，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO .2所示。

3.如权利要求2所述编码权利要求1所述葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的基因的用途，其特征在于：应用时采用该基因重组表达产生权利要求1所述的一种葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50。

4.一种抑菌组合物，其特征在于：包括如权利要求1所述的一种葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50。

5.一种抑菌剂，其特征在于：其主要活性成分为葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50、含有PB50表达元件的载体、含有PB50表达元件的表达盒或含有PB50表达元件的宿主细胞中的至少一种，裂解酶PB50的氨基酸序列为SEQ ID NO .1所示或者编码葡萄球菌裂解酶PB50的基因序列如SEQ ID NO .2所示。

6.根据权利要求5所述的抑菌剂，其特征在于：抑菌谱为人源葡萄球菌和动物源葡萄球菌。

7.葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

以葡萄球菌噬菌体基因组为模板，加入引物，PCR扩增，回收葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的编码基因，与相同酶切后的表达载体骨架连接，验证为阳性的重组表达载体pET-PB50转化表达宿主BL21后，经液体培养基培养，诱导表达，收集菌体，提取，纯化，葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

特异性扩增葡萄球菌噬菌体PB50基因的引物对为以下四组引物对之一：

（1）pET22b-PB50-F’和pET22b-PB50-R’

核苷酸序列为：

pET22b-PB50-F’：GGAATTCCATATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

Nde I酶切位点

pET22b-PB50-R’：CCGCTCGAGACTAAATGTACCCCATGCAGCAC

Xhol I酶切位点；

（2）pET25b-PB50-F’和pET25b-PB50-R’

核苷酸序列为：

pET25b-PB50-F’：GGAATTCCATATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

Nde I酶切位点

pET25b-PB50-R’：CCGCTCGAGACTAAATGTACCCCATGCAGCAC

Xhol I酶切位点；

（3）pET28a-PB50-F’和pET28a-PB50-R’

核苷酸序列为：

pET28a-PB50-F’：CGGGATCCATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

BamH I酶切位点

pET28a-PB50-R’：CCGCTCGAGTTAACTAAATG TACCCCATGC AGCACCA

Xhol I酶切位点；

（4）pET32a-PB50-F’和pET32a-PB50-R’

核苷酸序列为：

pET32a-PB50-F’：CGGGATCCATGAAAACAAAAACTCAAGCTCTTG

BamH I酶切位点

pET32a-PB50-R’：CCGCTCGAGTTAACTAAATG TACCCCATGC AGCACCA

Xhol I酶切位点。

8.如权利要求7所述葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的制备方法，其特征在于：所述的酶切采用Nde I/Xho I或者BamH I/Xho I双酶切。

9.如权利要求7或8所述的葡萄球菌噬菌体裂解酶PB50的制备方法，其特征在于，所述的表达载体骨架为pET22b、pET25b、pET28a或pET32a。