CN114107271B

CN114107271B - 具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶及其制备与应用

Info

Publication number: CN114107271B
Application number: CN202111532742.5A
Authority: CN
Inventors: 卢雪梅; 张书航
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2021-12-15
Filing date: 2021-12-15
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-12-15
Also published as: CN114107271A

Abstract

本发明公开了一种具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶，所述酶为沙门氏菌噬菌体裂解酶，命名为XFII，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码该酶的基因命名为XFII，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了所述的裂解酶在制备宽杀菌谱的生物杀菌剂中的应用以及在富营养条件下裂解病原菌的应用。同时还提供了一种能够从体外自发裂解革兰氏阴性菌的壳聚糖‑裂解酶XFII杀菌剂复配组合，该杀菌剂有望替代抗生素抑制有害病原菌的增殖。本发明提供的宽裂解谱、高活性、产量高、高耐热、耐富营养、无需预处理宿主菌可自发裂解革兰氏阴性菌等优点的裂解酶对环境、食品表面及体内环境的杀菌具有潜在应用价值。

Description

具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶及其制备与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶及其制备与应用。

背景技术

沙门氏菌(Salmonella)是一种常见的革兰氏阴性食源性致病菌。感染沙门氏菌会出现呕吐、腹泻、发热等症状，引起非伤寒沙门氏菌感染症如急性肠胃炎，或是伤寒等烈性传染病。沙门氏菌分布非常广泛，寄生于人类和动物肠道内，通过动物携带、***而传播到环境、饲料、水源和食物中，再通过家禽、肉类、奶类、蛋类等传播给人类，还会在食品加工和运输过程中发生交叉污染。

目前治疗细菌感染的手段主要有3种，首先是抗生素治疗，但是由于人类和兽药中过度使用抗生素，使得耐药性细菌感染大流行，而噬菌体和噬菌体裂解酶可能是替代抗生素的新型抗菌药物。沙门氏菌裂解酶研究较少，目前报道的有20多种。研究较为成熟的沙门氏菌噬菌体裂解酶有LysSE24、SPN9CC、LysSP1、LysLorf22、LysSTP4、SPN1S、LysSTG2、Lys68、LysWL59及LysWL60等。游离酶的稳定性较差，其在使用、运输、储存及制剂过程需要耐受高温，而温度的升高会导致酶的失活，因此开发一些耐高温的酶制剂，可以从根本上解决酶制剂热稳定性差的问题。裂解酶的应用过程中由于食品表面为富营养条件，并且体内环境中也含有血清和各种营养质。报道显示除革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌噬菌体裂解酶CF301能够在血清中具有促进杀菌活性外，大多数裂解酶在LB培养基及血清等富营养条件下的杀伤活性会显著降低或丧失。并且到目前为止有关沙门氏菌裂解酶在富营养条件中的杀菌活性尚无报道。因此开发能够在各种富营养条件下具有活性的裂解酶具有重要意义和应用价值。另外，除了应用于环境杀菌外，在食品消毒和体内杀菌方面裂解酶也有潜在的应用价值，应用范围也随之扩大。裂解酶在人血液、血清和血浆中增强的活性和功能性可以提供新型的治疗剂和改进的抗菌法。

针对革兰氏阳性菌的裂解酶研究已经取得较满意的进展，而针对革兰氏阴性菌的裂解酶研究面临着较大的难题。主要原因在于，裂解酶的作用靶点是细胞壁的肽聚糖成分，而革兰氏阴性菌肽聚糖层外面包裹的外膜阻碍了裂解酶与肽聚糖的接触，无法起到杀菌作用。然而，经过研究者们的不断尝试和努力，革兰氏阴性菌裂解酶面临的难题有望由以下途径克服或解决：(1)鉴定识别能穿透外膜的天然裂解酶；(2)将裂解酶与外膜渗透剂如EDTA、柠檬酸、苹果酸和阳离子多肽、抑菌剂等协同作用；(3)将裂解酶与一段能渗透外膜的多肽进行融合表达等。但关于裂解酶与抑菌剂壳聚糖的复配去解决以上难题未见报道。这种可以自发从体外裂解病原菌的配伍使得其可以作为食品添加剂，具有应对食品污染的潜在应用。可以作为畜禽饲料添加剂使用能提高畜禽免疫力，增加畜禽抵抗外源致病菌侵染的能力，在畜禽养殖行业也具有潜在的应用价值。

目前普遍采用分子克隆的方法制备噬菌体裂解酶利用原核表达***表达重组蛋白，该方法适用于能够确定编码裂解酶基因的噬菌体。但是在噬菌体裂解酶的诱导表达过程中由于裂解酶的产生会对大肠杆菌产生一定的杀伤作用，使得表达菌株产生生长缺陷，因此导致裂解酶的表达量低、不稳定。经检索，利用获得裂解酶的基因构建表达载体转入工程表达菌株C43(DE3)pLysS感受态中，利用感受态C43(DE3)pLysS与BL21感受态的区别在于其基因中含有至少一个未知突变，这个未知突变获得了高效表达毒性蛋白的能力。此突变位点参与大肠杆菌表达毒性蛋白时的细胞死亡途径。通过筛选获得重组表达菌株，用IPTG诱导得到表达宽裂解谱、高活性、产量高、高耐热、耐血清、无需预处理宿主菌可自发裂解革兰氏阴性菌等优点的革兰氏阴性噬菌体裂解酶的菌株及其酶产品还鲜见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶及其制备与应用。

本发明所述的具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶，其特征在于：所述裂解酶为沙门氏菌噬菌体裂解酶，命名为XFII，该裂解酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

上述裂解酶XFII具有良好的耐热性，在50-80℃热处理2h后仍保留较高的活性，并且能够在4℃条件下保存175天以上，在-20℃反复冻融5次活性几乎不丧失；在pH 5-11条件下活性显著，最适反应pH为8.0，最适反应温度是37℃。

本发明提供了一种编码所述具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶的基因，其特征在于：所述基因命名为XFII，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶的制备方法，包括构建表达具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶工程菌株，IPTG诱导，裂解酶的制备及纯化；其特征在于，步骤是：

(1)将沙门氏菌噬菌体与沙门氏菌共培养，得到含有沙门氏菌噬菌体的裂解液，纯化噬菌体裂解液并提取沙门氏菌噬菌体基因组DNA；其中，所述沙门氏菌噬菌体命名为XFII-1；

(2)以沙门氏菌噬菌体基因组DNA为模板，利用引物对P1和P2扩增沙门氏菌噬菌体裂解酶的基因，该基因命名为XFII，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，所述引物对的核苷酸序列如下：

P1上游引物：5-'GCGaagcttATGTCAAACCGAAACATCAGTGAC-3'，

P2下游引物：5'-TATctcgagCTTAGCAGCGCGCCCTACAGCTTC-3'；

(3)将扩增得到的裂解酶基因XFII利用限制性内切酶XhoI、HindIII双酶切后与表达载体pET-29b(+)连接，获得连接裂解酶基因XFII的重组质粒，该质粒命名为pET-29b-XFII；

(4)通过热激转化法将纯化后的pET-29b-XFII质粒转入工程表达菌株C43(DE3)pLysS感受态中，通过筛选获得重组表达菌株，并将其命名为C43-pET29b-XFII；

(5)活化重组表达菌株C43-pET29b-XFII并将其转接到LB培养基中，37℃、220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)并转至16℃、100rpm摇床培养条件下诱导表达4-5h，获得能表达有裂解酶的菌体发酵液；

(6)将获得的发酵液在6800-7000rpm、4℃条件下离心，收集沉淀的菌体，用pH＝7.4的50mM磷酸钠和300mM氯化钠缓冲液重悬菌体后超声破碎，将破碎后的菌液在12000rpm条件下离心20min，收集的上清液即为目的裂解酶粗酶液；

(7)将粗酶液经镍柱亲和层析柱纯化分离，最终得到的目的蛋白即为沙门氏菌噬菌体裂解酶，命名为XFII。

本发明所述的裂解酶XFII在制备宽杀菌谱的生物杀菌剂中的应用。

其中：所述裂解酶XFII能裂解革兰氏阴性病原菌和革兰氏阳性病原菌中的致病性大肠杆菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌。

本发明所述的裂解酶XFII在富营养条件下裂解病原菌的应用。

其中：所述富营养条件是指兔血清或人血清白蛋白或LB培养基，或模拟环境、食品、动物体内成分的复杂培养基；所述病原菌是致病性大肠杆菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌。裂解酶XFII在富营养条件下裂解病原菌的应用使得其在环境消毒、食品杀菌及体内环境杀菌方面具有潜在的应用。

本发明提供了一种能够表达所述裂解酶XFII的工程菌株，其特征在于：所述工程菌株命名为C43-pET29b-XFII该菌株是以C43(DE3)pLysS为出发菌株，转入含有SEQ IDNO.2所示核苷酸序列基因XFII的表达质粒pET-29b-XFII后经过筛选获得。

本发明提供了一种复配组合的宽谱杀菌剂，其特征在于：所述杀菌剂含有所述的裂解酶XFII和壳聚糖；其中所述裂解酶XFII与壳聚糖混合体积比优选是：6mg/mL壳聚糖:0.54mg/mL裂解酶XFII为1:3。

本发明提供了一种具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶及其制备与应用，所具有的独特优点和显著效果体现在：

(1)本发明提供的裂解酶XFII在原核表达***中的表达量高、酶活性强，能高效裂解细菌，有望取代传统的抗生素治疗，特别是针对多重耐药性致病菌的治疗，也可作为杀菌剂使用于环境杀菌。本发明公开的核苷酸序列可用于构建生产此裂解酶的基因工程菌株开展大规模裂解酶XFII的生产。

(2)本发明提供的裂解酶具有良好的热稳定性。目前报道的裂解酶多为常温型裂解酶，在常温下具有较高活性，本发明所述裂解酶在4-80℃范围内均具有催化活性，在4-70℃催化活性最高，可适用于较高温度环境的杀菌。

(3)本发明提供的噬菌体裂解酶序列编码的裂解酶在富营养条件下具有良好的催化活性。革兰氏阴性裂解酶应用的一个挑战是其在LB培养基和血清等富营养条件下的杀菌活性显著降低或丧失。在此背景下，本发明提供的裂解酶XFII能保持在LB培养基和兔血清等富营养条件下的杀菌活性，并且当反应体系中添加10-50％的兔血清时，能促进其裂解活性，使其活性提高大约136％。

(4)本发明提供的沙门氏菌裂解酶XFII属于宽谱裂解酶。裂解酶XFII对多种革兰氏阴性菌具有较好的杀菌效果，其中对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109以及多株环境分离致病性大肠杆菌、鲍曼不动杆菌AB1、肺炎克雷伯K3具有较强的杀菌效果，对多株环境分离致病性沙门氏菌具有良好的杀菌效果，甚至对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌也有一定的杀菌效果，说明该裂解酶具有较广的杀菌谱。

(5)重要的是，本发明提供的裂解酶XFII与壳聚糖复配组合制得的杀菌剂能够在无需EDTA预处理革兰氏阴性病原菌的情况下，自发从体外产生裂解作用，从而克服了额外添加具有细胞毒性的外膜破坏剂EDTA的障碍。这种复配组合可以自发从体外裂解病原菌的使得其可以作为食品添加剂，具有应对食品污染的潜在应用。还可以作为畜禽饲料添加剂使用能提高畜禽免疫力，增加畜禽抵抗外源致病菌侵染的能力，在畜禽养殖行业也具有潜在的应用价值。

附图说明

图1是本发明耐热裂解酶基因XFII产物电泳示意图。

其中：泳道1为Marker，泳道2、3为基因产物XFII，其大小为489bp。

图2表示用不同浓度咪唑洗脱裂解酶XFII及裂解酶LysSE24目的蛋白的SDS-PAGE示意图，图2A为裂解酶XFII的图谱，图2B为裂解酶LysSE24的图谱。

其中：M代表蛋白Marker，1-2代表50mM咪唑洗脱的目的蛋白；3-4代表100mM咪唑洗脱的目的蛋白；5-7代表200mM咪唑洗脱的目的蛋白。

图3A表示裂解酶XFII和裂解酶LysSE24对EDTA预处理的大肠杆菌JM109的裂解曲线，图3B表示将本发明裂解酶XFII在4-80℃处理2h之后剩余的相对酶活。

图4A表示本发明裂解酶置于4℃储存的裂解活性，图4B表示本发明裂解酶置于常温储存的裂解活性，图4C表示本发明裂解酶置于-20℃中反复冻融5次之后的裂解活性。

图5A表示反应温度对裂解酶活性的影响结果，图5B表示反应pH对裂解酶活性的影响结果。

图6表示裂解酶XFII和裂解酶LysSE24在LB培养基中的裂解活性。

图7A表示裂解酶XFII在兔血清培养基和Tris-HCl缓冲液中的裂解活性，图7B表示裂解酶LysSE24在兔血清培养基和Tris-HCl缓冲液中的裂解活性。

图8表示不同比例的裂解酶XFII与壳聚糖复配组合的体外自发裂解活性。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中，所涉及的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。其他所使用的材料、质粒、菌株、试剂等，如无特殊说明，均从商业途径得到。

实施例1：沙门氏菌噬菌体XFII-1基因组的提取

1)沙门氏菌噬菌体XFII-1纯培养液的获取。

从固体培养基上挑取沙门氏菌单菌落(标号为XFII)并接种于15mL LB培养基中，37℃振荡培养6-8h。

挑取沙门氏菌(标号为XFII)噬菌体噬菌斑，获得该沙门氏菌噬菌体，该噬菌体命名为XFII-1；将500μL沙门氏菌噬菌体XFII-1接种于上述沙门氏菌培养基中，37℃振荡培养4-6h，得到了含有沙门氏菌噬菌体XFII-1的裂解液，而后将该裂解液于8000rpm离心10min，用0.22μm的滤膜过滤得到除去残留沙门氏菌的纯化噬菌体裂解液，后续用于基因组提取。

2)噬菌体XFII-1基因组DNA提取。

利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒按其使用说明书所述方法对获得的纯化噬菌体裂解液进行沙门氏菌噬菌体基因组DNA提取，最终提取的产物即为沙门氏菌噬菌体XFII-1的基因组DNA，置于-20℃保存备用。

实施例2：裂解酶基因在NCBI库进行功能比对

将提取的沙门氏菌噬菌体XFII-1的基因组DNA送至生物公司进行全基因组测序，通过RAST工具对基因组进行基因预测，将样本预测的ORF序列通过EMBOSS中的transeq程序转换为氨基酸序列，该氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。预测的具有裂解细胞壁功能的氨基酸序列与公共数据进行比较，通过上传NCBI库进行同源性比对发现本发明提供的裂解酶的氨基酸序列(SEQ ID No.1)与多个沙门氏菌噬菌体的裂解酶包括裂解酶LysSP1、LysSE24等相似度较高，但目前并没有查到相似度为100％的裂解酶被研究与应用的报道。

通过序列注释和比对分析获得沙门氏菌噬菌体裂解酶的基因，该基因大小为489bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述基因命名为XFII。

实施例3：XFII基因的克隆、重组表达载体及表达菌株的构建

1、裂解酶基因XFII的扩增

根据XFII基因的核苷酸序列(SEQ ID No.2)设计引物P1和P2，5'端增加双酶切位点XhoI、HindIII以及保护性碱基，以实施例1中获取的沙门氏菌噬菌体基因组DNA为模板，按照如下程序利用PCR进行XFII基因的扩增，将PCR产物在1.5％琼脂糖中电泳鉴定，片段大小为489bp，条带单一明亮，凝胶电泳结果如图1所示。

其中，所述引物P1和P2的核苷酸序列是：

P1上游引物：5-'GCGaagcttATGTCAAACCGAAACATCAGTGAC-3'，

P2下游引物：5'-TATctcgagCTTAGCAGCGCGCCCTACAGCTTC-3'。

DNA聚合酶Phanta Max Super Fidelity进行PCR扩增，PCR反应体系是：

PCR反应程序如下所示：

2、重组质粒pET-29b-XFII的构建

将扩增获得的XFII基因产物与空载体pET-29b(+)用限制性内切酶XhoI、HindIII按照如下酶切反应体系进行双酶切处理，回收大小正确的DNA条带。

酶切反应体系：

分别取4μL双酶切后胶回收的XFII基因片段和1μL双酶切后胶回收的pET-29b(+)空质粒，加入的5μL DNAligase Solution I连接酶，混匀后置于16℃下过夜连接，将连接产物转化DH5α。

挑取转化子进行PCR验证，并将质粒上的目的片段进行测序，确定其序列是否完全正确。将鉴定正确的重组质粒命名为pET-29b-XFII。

3、含目的基因XFII的大肠杆菌C43表达菌株的构建

将测序正确的质粒pET-29b-XFII转入到大肠杆菌C43(DE3)pLysS感受态中。

在20μL感受态C43(DE3)pLysS中加入1μL质粒pET-29b-XFII混匀后冰上放置30min。取出后42℃水浴热激90sec，再迅速取出冰浴2min。然后加入900μL LB培养基，37℃、220rpm振荡孵育培养1h。把菌液涂布在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃培养8-12h。在平板上随机挑取单菌落接种至5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养10-16h。至此获得了含目的基因XFII的C43表达菌株，将其命名为C43-pET29b-XFII，并置于-80℃冰箱中保存甘油菌种备用。

裂解酶LysSE24是近期报道的热稳定性较高的裂解酶，本发明将两个裂解酶的杀菌活性及其部分性质进行了比较。

LysSE24裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。将裂解酶LysSE24的氨基酸序列与裂解酶XFII的氨基酸序列进行比对，发现裂解酶LysSE24与本发明裂解酶XFII的相似度为98％。

同样，以上述工程菌株构建的方法，先将pET29b-XFII的质粒通过定点突变手段构建pET29b-LysSE24质粒载体，再将质粒pET29b-LysSE24热激转化工程菌株C43(DE3)pLysS中获得可表达裂解酶LysSE24的重组菌，命名为C43-pET29b-LysSE24，并置于-80℃冰箱中保存甘油菌种备用。

实施例4：重组蛋白裂解酶XFII的制备与纯化

1、重组蛋白的诱导与制备

将实施例3中获得的C43-pET29b-XFII、C43-pET29b-LysSE24的C43表达菌株分别在5mL LB培养基中活化，转接进50mL三角瓶37℃、220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，添加1mM IPTG转至16℃，100rpm的摇床中，培养4h。7000rpm离心分离收集菌体，取出1mL发酵液上清待用，菌体沉淀用50mM磷酸钠(pH＝7.4)和300mM氯化钠缓冲液悬起后超声破碎，将破碎好的菌液在12000rpm条件下离心20min，收集破碎液的上清液，破碎液沉淀用2mL缓冲液重悬。分别取50μL发酵液上清、破碎液上清、破碎液沉淀加入12.5μL5×Loading Buffer沸水浴10min，随后进行SDS-PAGE检测裂解酶表达情况，结果显示大部***解酶存在于破碎液上清中，蛋白得率超过100mg/L。

2、重组蛋白的扩大制备及纯化

将保存的菌株C43-pET29b-XFII、C43-pET29b-LysSE24分别接种于5mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，次日，按照体积比1％接种量加入到新鲜的300mL含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入1mM IPTG，16℃，100rpm的摇床中，诱导裂解酶表达。7000rpm离心10min收集菌体，用30mL 20mM的咪唑溶液重悬，超声破碎至含菌体的咪唑溶液透明清晰，12000rpm离心20min，收集含粗酶液的破碎液上清液抽滤之后备用。

将4℃保存的镍柱亲和层析柱中20％酒精流出，至流尽。加入10倍柱体积的500mMNaCl，20mM Tris-HCl，20mM咪唑，至流尽。将抽滤后的含粗酶液的破碎液上清全部上柱，至溶液全部流出。加入10mL 500mM NaCl，20mM Tris-HCl，50mM咪唑，pH7.4进行杂蛋白洗脱；添加咪唑浓度分别为50mM、100mM、200mM的缓冲液分别收集2mL，5mL，7mL，放置于4℃保存。

将收集的含目的蛋白的缓冲液分别取出50μL，加入12.5μL 5×Loading Buffer，沸水浴10min，12000rpm离心5min。SDS-PAGE凝胶图谱检测重组蛋白裂解酶XFII的纯度，实验结果如图2所示。其中图2A为裂解酶XFII的图谱，图2B为裂解酶LysSE24的图谱。

最后利用Bradford试剂盒对裂解酶XFII的浓度进行测定，通过稀释将其调整成相同浓度。相关裂解活性检测的方法及具体实验步骤参考实施例5。

实施例5：裂解酶XFII对大肠杆菌JM109的抗菌效果及其他细菌的杀菌谱分析

1、裂解酶XFII对大肠杆菌JM109的杀菌效果

用5mL LB培养基活化宿主菌大肠杆菌JM109，将其转接入50mL锥形瓶中37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8。7000rpm离心10min，弃上清，用10mL 20mM Tris-HCl(pH＝8.0)和100mMEDTA的缓冲液37℃孵育5min。7000rpm离心10min以除去EDTA，将细胞重悬于上述缓冲液中洗涤两次，最后用缓冲液调至OD₆₀₀约为1.0。将纯化裂解酶XFII调至蛋白浓度为0.104mg/mL，在96孔板中加入1μL(20-25nM)的裂解酶XFII和199μL的EDTA预处理后的大肠杆菌JM109。试验设置三个重复，1μL磷酸钠缓冲液作为阴性对照。将酶标板立即置于酶标仪中，37℃条件下检测30min，以裂解时间为横坐标，ΔOD₆₀₀为纵坐标，得到裂解曲线。

利用浊度法检测裂解酶XFII的杀菌活性，发现菌液在裂解酶XFII的作用下迅速变得澄清，并且5min内OD₆₀₀即从0.8降至0.2，其结果如图3A所示。说明本实验表达的裂解酶XFII具有良好的杀菌活性。

将LysSE24的纯化酶调至与XFII相同的蛋白浓度(0.104mg/mL)，比较其杀菌活性，利用同样的方法检测裂解酶LysSE24的杀菌活性，并将裂解酶LysSE24与裂解酶XFII的杀菌活性进行比较，结果如图3A所示，本发明的裂解酶XFII比裂解酶LysSE24的活性高193％。表明裂解酶XFII在应用过程中能够大大降低使用成本和工业生产成本。

通过保守序列分析发现裂解酶XFII的活性位点为：Glu18、Pro29、Thr35。而裂解酶LysSE24是通过裂解酶XFII突变点N-40-Y，A-97-V，A-159-D而获得的，通过Swiss-model模拟三维结构发现，40位、97位及159位点均位于蛋白质的表面，而突变之后的3种氨基酸的空间位阻都比原有氨基酸的位阻大，于是猜测这可能是影响LysSE24酶活性的一个原因。

2、裂解酶XFII的杀菌谱检测

利用实施例5第一部分中的杀菌检测方法分别选择大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109、大肠杆菌C43(DE3)及多株环境分离致病性大肠杆菌、鲍曼不动杆菌标准菌株、多株环境分离的沙门氏菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌进行了裂解酶XFII的杀菌谱测定，结果显示裂解酶XFII在EDTA预处理指示菌的前提下对这些指示菌具有很明显的杀菌效果，进一步将裂解酶XFII对这些指示菌的杀菌效果进行比较，结果如表1所示。同时裂解酶XFII对多种革兰氏阴性菌具有较好的杀菌效果，其中对大肠杆菌DH5α、大肠杆菌JM109以及多株环境分离致病性大肠杆菌、鲍曼不动杆菌AB1、肺炎克雷伯K3具有较强的杀菌效果，对多株环境分离致病性沙门氏菌具有良好的杀菌效果，甚至对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌也有一定的杀菌效果，说明该裂解酶XFII属于广谱裂解酶。

表1：裂解酶XFII的杀菌谱

注：++++：裂解清透，OD₆₀₀下降0.6左右；+++：裂解较澄清OD₆₀₀下降0.5左右；++：裂解较澄清，OD₆₀₀下降0.3左右；+：裂解浑浊，不充分，OD₆₀₀下降0.2左右，-：不裂解。

实施例6：裂解酶XFII的热稳定性检测及部分酶学性质(储存性，酸碱度)分析

1、裂解酶XFII的热稳定性及低温储存性检测

将纯化的裂解酶XFII分别取20μL放置在4℃、20℃、30℃、37℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃水浴锅中处理2h。取出处理的样品冰浴30分钟，按照实施例5第一部分中的方法进行杀菌活性检测，以未经处理的裂解酶为对照，计算相对杀菌活性，相对裂解活性＝处理酶的裂解活性/未处理酶的裂解活性×100％，其中杀菌活性＝ΔOD₆₀₀/Δt。其结果如图3B所示，裂解酶XFII在70℃以下处理2h，其杀菌活性与不经处理的裂解酶活性相近，而80℃热处理2h的杀菌活性仍具有54.82％，证明其稳定性良好，在未来的保存运输中都具有自己独特的优势。

纯化的裂解酶XFII放置在4℃低温储存，定期取样按照实施例5第一部分中的方法测剩余杀菌活性。以储存日期为横坐标，5min内的ΔOD₆₀₀为纵坐标，得到储存日期内的裂解曲线。结果如图4A所示，在4℃条件下储存175天的杀菌活性仍较显著，更久时间的数据未显示，同样的方法检测了将裂解酶XFII置于常温条件下储存后的杀菌活性。结果如图4B所示，15天之内的酶活性几乎不降低。

纯化的裂解酶XFII放在-20℃中反复冻融，每次冷冻2h，取出融化1h，按需取出20μL检测杀菌活性。结果如图4C所示，在-20℃条件下反复冻融5次之后的裂解酶XFII杀菌活性仍较显著，更多次数的数据未显示，这些结果都证明裂解酶XFII比较稳定，适宜长期储存使用。

2、裂解酶XFII的耐热分析，最适温度及最适pH检测

按照实施例5第一部分中的方法配好反应体系，宿主菌JM109统一调至OD₆₀₀≈1.0，随后将各体系放置在4℃、10℃、20℃、30℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃温度下反应5分钟，取出离心管，试验设置三个重复，将相同体积磷酸钠缓冲液作为阴性对照。立即置于酶标仪中，测量剩余OD₆₀₀。以反应温度为横坐标，5min内的ΔOD₆₀₀为纵坐标得到最适反应温度的杀菌曲线。结果如图5A所示，显示在4-60℃范围内裂解酶XFII均具有良好的裂解活性，尤其在37℃催化活性最高。

大肠杆菌JM109细胞重悬在通用缓冲液中调节pH在3-12之间，之后按照实施例5第一部分中的方法，在最适温度(37℃)下，根据反应前后OD₆₀₀的变化量确定其最适pH，结果如图5B所示，显示裂解酶XFII催化范围为pH 7-11，最适pH为8。

实施例7：裂解酶XFII在复杂培养基中的杀菌活性

1、裂解酶XFII在LB培养基中的裂解活性

将EDTA处理的大肠杆菌JM109清洗之后重悬在LB培养基中，按照实施例5第一部分中的方法检测杀菌活性。结果如图6所示，裂解酶XFII的杀菌活性在LB培养基中受到了轻微抑制，而同样的方法检测裂解酶LysSE24在LB培养基中对大肠杆菌JM109的杀菌活性，结果如图6所示，裂解酶LysSE24的杀菌活性受到严重的抑制，几乎没有杀菌活性。

尽管众多裂解酶在简单的缓冲溶液中具有强烈的杀菌活性，但在细菌生长支持条件下，裂解酶的有效性往往会降低，这限制了它们的更广泛的有效性，特别是在体外应用。而本发明的裂解酶XFII能够在LB培养基存在的富营养条件下表现出杀菌活性，这成为其独特的优势之一而具有更广泛的应用价值。

2、裂解酶XFII在血清培养基中的裂解活性

按照实施例5第一部分中的方法在调至OD₆₀₀≈1.0的大肠杆菌JM109的反应体系中加入0％、10％、20％、30％、40％、50％的兔血清，以50％兔血清及磷酸钠盐缓冲液不加裂解酶为阴性对照，按照实施例5第一部分中的方法测OD₆₀₀的变化。结果如图7A所示，裂解酶XFII在添加高达50％兔血清时仍能促进其裂解大肠杆菌JM109。而同样按照实施例5第一部分中的方法对裂解酶LysSE24进行耐血清的检测，结果如图7B所示，裂解酶LysSE24也可以在血清中体现杀菌活性，其杀菌活性与在Tris-HCl缓冲液中的活性相当，而不表现出明显的血清促进其杀菌活性的特性。

实施例8：裂解酶XFII与壳聚糖复配组合的体外杀菌活性

用5mL LB培养基活化宿主菌大肠杆菌JM109，将其转接入50mL锥形瓶中37℃培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8。7000rpm离心10min，弃上清，用10mL 20mM Tris-HCl(pH＝8.0)清洗一次菌体，最后用缓冲液调至OD₆₀₀约为1.0。将纯化裂解酶XFII调至蛋白浓度为0.54mg/mL，并用1％的乙酸配置6mg/mL的壳聚糖，尝试将裂解酶和壳聚糖按照不同的比例混合(1:1、1:2、2:1、3:1、1:3、4:1、1:4，V/V)形成杀菌剂复配组合。在96孔板中对每组不同的比例混合进行体外杀菌活性测试。

各组测试时在96孔板中每孔加入30μL杀菌剂复配组合裂解大肠杆菌JM109。试验设置三个重复，Tris-HCl缓冲液、裂解酶XFII、壳聚糖溶液作为阴性对照。将酶标板立即置于酶标仪中，37℃条件下检测30min，以裂解时间为横坐标，ΔOD₆₀₀为纵坐标，得到裂解曲线。结果如图8所示，未经EDTA预处理的大肠杆菌JM109在杀菌剂复配组合的作用下具有一定的裂解作用，并且不同的配方比例的组合杀菌效果不同，当壳聚糖:裂解酶为1:3时效果最明显，OD₆₀₀能够并且5min内OD₆₀₀即从0.9降至0.55。而仅仅用裂解酶XFII作用于未经预处理的JM109时，由于革兰氏阴性菌外膜的存在，必须在EDTA、氯仿、柠檬酸等外膜破坏剂的作用下才具有良好的裂解作用，因此裂解酶XFII单独作用时，JM109大肠杆菌的OD₆₀₀呈现水平的趋势，并且不管是裂解酶XFII的Tris-HCl缓冲液或是壳聚糖本身均不对大肠杆菌JM109产生裂解作用。同时实验还证实裂解酶XFII与壳聚糖复配组合对大肠杆菌DH5α也有良好的体外裂解作用，因此其具有宽谱性。

上述这种突破革兰氏阴性菌的外膜并从体外自发裂解病原菌的裂解酶XFII与壳聚糖复配组合的配方从未报道，壳聚糖(Chitosan)又称脱乙酰甲壳素，是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，符合国家食品添加剂使用标准GB-2760，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。同时，由于壳聚糖带正电，猜测能与带负电细胞表面相作用，而破坏膜透性，进而与裂解酶XFII具有协同作用。这种可以自发从体外裂解病原菌的配伍使得其可以作为食品添加剂，具有应对食品污染的潜在应用。同时也其可以作为畜禽饲料添加剂使用，能提高畜禽免疫力，增加畜禽抵抗外源致病菌侵染的能力，在畜禽养殖行业也具有潜在的应用价值。

序列表

<110> 山东大学

<120> 具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶及其制备与应用

<141> 2021-12-09

<160> 1

<210> 1

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 裂解酶XFII的氨基酸序列

<222>（1）…（162）

<400> 1

Met Ser Asn Arg Asn Ile Ser Asp Asn Gly Leu His Phe Thr Ala Ala

1 5 10 15

Phe Glu Gly Phe Arg Gly Thr Ala Tyr Arg Ala Thr Pro Ser Glu Lys

20 25 30

Tyr Phe Thr Ile Gly Tyr Gly His Asn Gly Ala Asp Val Lys Glu Gly

35 40 45

Gln Lys Ile Thr Glu Gly Gln Gly Leu Leu Leu Leu His Lys Asp Met

50 55 60

Ala Lys Ala Val Ala Ala Val Asp Ala Val Ala His Pro Ser Leu Asn

65 70 75 80

Gln Ser Gln Phe Asp Ala Val Cys Asp Leu Val Tyr Asn Ala Gly Ala

85 90 95

Gly Ala Ile Ala Val Ser Thr Gly Thr Gly Gln Ala Leu Arg Lys Gly

100 105 110

Asp Ala Ser Thr Leu Arg Asn Lys Leu Thr Gln Phe His Tyr Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Ser Leu Leu Gly Leu Arg Arg Arg Ala Ala Gly Arg Val Ala

130 135 140

Leu Phe Asp Gly Met Leu Trp Gln Gln Ala Glu Ala Val Gly Arg Ala

145 150 155 160

Ala Lys

　　162

<210> 2

<211> 489

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> 编码裂解酶XFII基因的核苷酸序列

<222>（1）…（489）

<400> 2

atgtcaaacc gaaacatcag tgacaacgga ttacacttca ccgccgcgtt cgaggggttc 60

cgcgggaccg cctaccgcgc gacaccttca gaaaaatact ttactattgg ctacggccac 120

aacggcgcag atgtaaaaga aggtcagaag attaccgaag gccagggtct cctgcttctg 180

cataaagata tggctaaggc cgtagctgct gtagacgccg tagcgcatcc gtctctaaat 240

cagtcacagt tcgacgccgt gtgtgacctg gtgtataacg ctggtgcagg tgcgattgct 300

gtgtcaaccg gaacaggtca ggcgctgcgc aaaggcgatg catctacact gcgtaataag 360

ttaactcagt tccattatca gaacggcaaa tcactcctcg gattgcggcg ccgagctgct 420

ggtcgtgttg cactgttcga cggtatgctg tggcaacagg ccgaagctgt agggcgcgct 480

gctaagtag 489

<210> 3

<211> 162

<212> PRT

<213> 人工序列

<221> 裂解酶LysSE24的氨基酸序列

<222>（1）…（162）

<400> 3

Met Ser Asn Arg Asn Ile Ser Asp Asn Gly Leu His Phe Thr Ala Ala

1 5 10 15

Phe Glu Gly Phe Arg Gly Thr Ala Tyr Arg Ala Thr Pro Ser Glu Lys

20 25 30

Tyr Phe Thr Ile Gly Tyr Gly His Tyr Gly Ala Asp Val Lys Glu Gly

35 40 45

Gln Lys Ile Thr Glu Gly Gln Gly Leu Leu Leu Leu His Lys Asp Met

50 55 60

Ala Lys Ala Val Ala Ala Val Asp Ala Val Ala His Pro Ser Leu Asn

65 70 75 80

Gln Ser Gln Phe Asp Ala Val Cys Asp Leu Val Tyr Asn Ala Gly Ala

85 90 95

Gly Val Ile Ala Val Ser Thr Gly Thr Gly Gln Ala Leu Arg Lys Gly

100 105 110

Asp Ala Ser Thr Leu Arg Asn Lys Leu Thr Gln Phe His Tyr Gln Asn

115 120 125

Gly Lys Ser Leu Leu Gly Leu Arg Arg Arg Ala Ala Gly Arg Val Ala

130 135 140

Leu Phe Asp Gly Met Leu Trp Gln Gln Ala Glu Ala Val Gly Arg Asp

145 150 155 160

Ala Lys

　　162

Claims

1.具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶在制备富营养条件下裂解病原菌制剂中的应用，其特征在于：所述裂解酶为沙门氏菌噬菌体裂解酶，命名为XFII，该裂解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该裂解酶的基因命名为XFII，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述富营养条件是指兔血清或LB培养基；所述病原菌是致病性大肠杆菌、沙门氏菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌及金黄色葡萄球菌。

2.一种复配组合的宽谱杀菌剂，其特征在于：所述杀菌剂由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的具有体外裂解活性的耐热耐富营养沙门氏菌宽谱裂解酶和壳聚糖制成；其中所述裂解酶与壳聚糖混合体积比是：6mg/mL壳聚糖:0.54mg/mL裂解酶为1:3。