CN104726429A - 一种具有增强的抑菌效果的噬菌体裂解酶 - Google Patents

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Abstract

本发明将裂解酶Bp7e氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分别进行突变为丙氨酸和谷氨酸，经原核表达技术得到了突变体蛋白并经Western-blot对其进行了鉴定，命名为Bp7c突变体蛋白。对Bp7e和Bp7e突变体蛋白进行了纯化及浓度测定，通过体外裂解实验及裂解谱检测得知，纯化的Bp7e和Bp7e突变体两种蛋白具有广谱的抑菌作用，对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和多种血清型大肠杆菌均有裂解效果，且Bp7e突变体裂解效果整体优于天然裂解酶Bp7e。

Description

一种具有增强的抑菌效果的噬菌体裂解酶
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种通过定点突变制备具有增强的抑菌效果的噬菌体裂解酶的方法及得到的突变的噬菌体裂解酶。
背景技术
随着耐药性的不断出现，噬菌体已经成为研究者开发新型生物制剂的热点之一。但噬菌体本身不能离开宿主菌生存、可能带来抗性基因、可能引起的毒力传播，使得人们对是否应开发噬菌体制剂来预防和治疗细菌感染这一问题仍然存在争议。因此，人们迫切需要寻找一种更安全有效的预防治疗细菌感染的方法。噬菌体裂解酶作为一种新型生物抗菌制剂所表现出的诸多优点也受到了研究者的青睐。噬菌体裂解酶(bacteriophage lysins)是由双链DNA噬菌体在溶菌周期末期在宿主菌体内产生的酶，除单链DNA的丝状噬菌体外，大多数噬菌体依靠裂解酶水解宿主菌细胞壁中的肽聚糖从而释放子代噬菌体。
纯化的噬菌体裂解酶可作用于细菌细胞壁特有的肽聚糖，同时引起细菌细胞裂解。但由于细菌细胞壁的结构差异，裂解酶对G+及G-菌的菌外杀伤效果不同，对G+细菌的作用明显高于对G-菌的作用。尽管如此，噬菌体裂解酶独特的杀菌特点和作用优势仍受到了研究者的青睐，并且通过基因工程手段对噬菌体裂解酶进行技术改造获得宽宿主谱的新型裂解酶蛋白也已经成为可能。
高效性并在短时间内发挥效力杀死细菌是噬菌体裂解酶显著的杀菌特点。几种裂解酶混合或裂解酶与抗生素联合使用时也能产生协同抗菌作用，提高杀菌效果。同时，相对较高的杀菌特异性而几乎不影响正常菌群是噬菌体裂解酶的又一大优势。一般来说，葡萄球菌噬菌裂解酶只杀灭特定的葡萄球菌，肺炎链球菌噬菌体裂解酶只对特定的链球菌敏感，它们对机体正常菌群几乎不会影响。当然，也有部分噬菌体裂解酶也表现出了一定的广谱性。
目前国内外很多研究者对多种噬菌体裂解酶做了不同程度的研究。Schuch等首次报道了噬菌体裂解酶在治疗细菌感染方面的应用。Vasala等将乳酸杆菌噬菌体LL-H中的一段裂解酶基因克隆到大肠杆菌中，表达出了具有溶解细胞壁作用的酶。Kikkawa等研究炭疽杆菌裂解酶PlyG经表达和纯化后，利用ELISA定性和定量检测发现，裂解酶PlyG具有裂解B类炭疽杆菌的作用，但裂解谱比较狭窄。Djurkovic等利用链球菌裂解酶Cpl-1和抗生素共同作用于耐青霉素的链球菌，结果发现裂解酶与青霉素发挥出了协同作用。我国近几年也有人开始利用噬菌体裂解酶等基因进行克隆并表达。陆海荣等将肺炎链球菌噬菌体裂解酶CPL21基因***pET28a载体，在大肠杆菌BL21中获得高效可溶性表达，经过DEAE亲和层析，获得了纯度高达97％的蛋白，抑菌试验表明，纯化的CPL21蛋白对临床肺炎链球菌具有明显的杀菌作用，且抑菌圈大小跟蛋白浓度成正比关系。刘爽等将噬菌体PhiX174裂解酶E克隆到pBV220载体后，再将重组载体转入到大肠杆菌O157∶H7中，经诱导表达后，发现大肠杆菌O157∶H7细菌表面形成了许多小孔，菌体内容物由孔道流出，形成菌壳，对大肠杆菌的裂解效率达98.4％，这一试验也为菌影疫苗的制备提供了思路。杨文慧等将分枝杆菌噬菌体D29裂解酶基因gene10在大肠-分枝杆菌穿梭载体克隆后，经分枝杆菌诱导表达，并证实了gene10蛋白具有裂解活性。
虽然噬菌体裂解酶和抗生素及噬菌体治疗相比存在诸多优势，但仍存在一些问题，其中抗菌药物的安全性是人们特别关注的问题。由于噬菌体裂解酶杀菌高效迅速的特点，人们也担心裂解酶再破坏细菌细胞壁和细胞膜时细菌裂解产生的有毒物质、炎性物质等能否对机体产生危害，但目前并没有关于裂解酶对机体产生危害的报道。在体内的清除速率是影响裂解酶杀菌作用的另一方面，由于噬菌体裂解酶是蛋白质，将其应用于黏膜或全身时，会刺激机体产生免疫应答，从而降低其活性，并加快其体内清除速率。另外，在体内裂解酶还可能被水解酶降解而失活，这也加快了其在体内清除的速度，成为裂解酶广泛应用于临床前需要解决的问题。
随着人类进入后基因组时代，蛋白质的结构设计和蛋白质组学技术的进步同时也推动了裂解酶改造领域的发展。一些研究者通过替换裂解酶的结构域的方法改变了天然裂解酶的特异性和催化活性。通过对裂解酶的有益修饰和改造，不仅可以增加裂解酶的裂解活性，还可能扩展其裂解谱进而达到优化裂解酶的目的。
近年来随着研究者对噬菌体及其裂解酶研究的重视，越来越多的噬菌体裂解酶已经通过原核表达等方法制备纯化，并且应用于细菌感染等方面的治疗。基于噬菌体裂解酶具有裂解效率高，不易产生耐药菌株等优点，为研究者开发新型药物特别是能杀灭抗生素耐药菌的生物制剂提供了广阔的发展前景。用其高性能的裂解酶更具理论和实用价值。目前，对噬菌体裂解酶研究正朝着以下几个方向发展：探究重要致病菌噬菌体及其裂解酶的基因序列及生物进化关系；用分子生物学及微生物培养法获得大量纯化的噬菌体裂解酶并检测其抑菌活性；通过基因工程等方法对天然裂解酶进行定向有益突变，最大限度的开发裂解酶的杀菌潜能。
发明内容
由于目前越来越多的耐药菌的出现，使得噬菌体与裂解酶疗法再度进入研究者的视野。随着人工改造噬菌体的理论和技术趋向成熟，应用基因工程技术人工改造噬菌体及其裂解酶也受到了研究者的青睐，噬菌体和裂解酶治疗也取得了突破性的进展。
本发明将裂解酶Bp7e(SEQ ID No：1)氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分别进行突变为丙氨酸和谷氨酸，经原核表达技术得到了突变体蛋白并经Western-blot对其进行了鉴定，命名为Bp7e突变体蛋白(SEQ ID No：2)。对Bp7e和Bp7e突变体蛋白进行了纯化及浓度测定，通过体外裂解实验及裂解谱检测得知，纯化的Bp7e和Bp7e突变体两种蛋白具有广谱的抑菌作用，对溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和多种血清型大肠杆菌均有裂解效果，且Bp7e突变体裂解效果整体优于天然裂解酶Bp7e。
附图说明
图1重组噬菌体裂解酶Bp7e突变体的SDS-PAGE电泳分析：1、空质粒的诱导表达；2、含裂解酶Bp7e突变体的重组质粒的诱导表达；M.标准蛋白分子质量。
图2诱导表达产物(裂解酶Bp7e突变体)的Western-blot鉴定：1、诱导表达产物；M、标准蛋白分子质量。
图3裂解酶Bp7e及其突变体对溶壁微球菌的抑菌效果：左图为裂解酶Bp7e；右图为裂解酶Bp7e突变体。
图4裂解酶Bp7e及其突变体对大肠杆菌的抑菌效果：左图为裂解酶Bp7c；右图为裂解酶Bp7e突变体。
图5裂解酶Bp7e及其突变体对金黄色葡萄球菌的抑菌效果：左图为裂解酶Bp7e；右图为裂解酶Bp7e突变体。
图6裂解酶Bp7e及其突变体对沙门氏菌的抑菌效果：左图为裂解酶Bp7e；右图为裂解酶Bp7e突变体。
图7蛋清溶菌酶对溶壁微球菌的抑菌效果。
图8蛋清溶菌酶对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果：自左至右依次为大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌。
图9裂解酶Bp7e及其突变体对不同菌株的裂解效率：(A)裂解酶Bp7e的裂解效率：(B)裂解酶Bp7e突变体的裂解效率。
具体实施方式
实施例1：噬菌体裂解酶Bp7e突变体的原核表达
1.1材料
噬菌体裂解酶Bp7e蛋白表达质粒pET28a-Bp7e、大肠杆菌BL21菌株由青岛农业大学动物科技学院微生物实验室保存；
1.2方法
1.2.1噬菌体裂解酶Bp7e氨基酸的首轮突变反应
1.2.1.1针对目的基因的突变位点设计引物
对Bp7e(SEQ ID No：1)氨基酸进行定点突变，使其第99位亮氨酸突变为丙氨酸，第102位蛋氨酸突变为谷氨酸。根据定点突变试剂盒的引物设计原则，设计两对引物，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
引物一上游：5′AAGTTCGTCGTTGTGCTGCAATTAACATGGTCTTC3′
引物一下游：5′GAAGACCATGTTAATTGCAGCACAACGACGAACTT3′
引物二上游5′TGTGCTGCAATTAACGAGGTCTTCCAAATGGG3′
引物二下游5′CCCATTTGGAAGACCTCGTTAATTGCAGCACA3′
以重组表达质粒pET28a-Bp7e为模板，用引物一及试剂盒所带试剂建立50μL的反应体系：
1.2.1.2突变质粒的选择
PCR反应结束后使用MutazymeTM酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA。具体步骤为，先准备上述PCR反应产物，加入1μL(10U/μL)MutazymeTM酶37℃温育1小时。
1.2.1.3将突变质粒转化入大肠杆菌表达菌株BL21中
(1)将10μL突变质粒加入50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，轻轻混匀后，冰浴30min；
(2)42℃水浴中热激90s，迅速置于冰上2～3min，加入1000μLB液体培养基，37℃振荡培养90min；
(3)4000r/min离心5min弃去600μL上清液后悬浮菌液；
(4)取100μL菌液均匀涂布含Kana的LB平板上，完全吸收后置37℃倒置培养过夜。
1.2.1.4序列分析
当LB平板上长出白色菌落则证明发生了定向突变，提取质粒后经琼脂糖凝胶电泳检查目的条带，并将检测的含突变质粒的白色菌落重新复苏，37℃过夜摇菌后送至上海生工生物工程有限公司进行测序；测序结果表明成功将第99位亮氨酸突变为丙氨酸
1.2.2噬菌体裂解酶Bp7e氨基酸的次轮突变反应
以首轮突变正确的裂解酶Bp7e突变质粒为模版，用引物二建立次轮PCR扩增体系。方法同上，经测序证实，得到如SEQ ID No：2所示的裂解酶Bp7e突变体。即经过两轮突变过程，使裂解酶Bp7e最终突变为目的裂解酶Bp7e突变体。
1.2.3重组表达质粒菌pET28a-Bp7e突变体蛋白的诱导表达
挑取测序突变正确的白色菌落，接种含Kana的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，次日按1∶100的体积比例即取70μL接种7mL含Kana的LB液体培养基中，37℃振荡培养约2h使培养液的OD600约为0.6～0.8，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃振荡培养3h，4000r/min离心10min收集菌体沉淀，将菌体沉淀用700μL PBS重新悬浮后转移至1.5mL离心管中，加入70μL的1×SDS上样缓冲液，煮沸15min，4000r/min离心3min，取上清进行SDS-PAGE电泳分析，将重组蛋白命名为裂解酶Bp7e突变体，并设同条件下诱导表达的空质粒pET28a作对照。将重组表达的裂解酶Bp7e突变体蛋白进行Western-blot鉴定。电泳结果如图1所示，Western-blot结果如图2所示。由图1和图2可见，重组质粒pET28a-Bp7突变体的诱导表达在22KD处出现一条条带；空载体对照组在目的条带处没有出现条带，与预期结果相符。
实施例2：噬菌体裂解酶Bp7e及其突变体蛋白的抑菌活性检测
1材料和方法
1.1材料
溶壁微球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、01，015，024，078，088血清型大肠杆菌由本实验室保存。
1.2方法
1.2.1噬菌体裂解酶Bp7e及其突变体蛋白的纯化
(1)组装层析柱：将1mL填料混匀后加入层析柱，室温静置10min，待分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。
(2)分别将表达裂解酶Bp7e及其突变体的菌株挑取单菌落接种于5mL含Kana的LB液体培养中37℃振荡培养过夜。
(3)次日分别取出2.5mL加入250mL含Kana的LB液体培养(每个重组菌培养2瓶)，37℃振摇培养至OD600为0.6～0.8左右，而后加入IPTG使得重组菌蛋白诱导体系中IPTG浓度为1.0mmol/L，37℃振荡培养3h，4000r/min离心10min收集菌体。
(4)收集菌体后，每100mg菌体(湿重)加入1-5mL细菌裂解液(每1mL细菌抽提试剂中已加入10μLPMSF)，超声裂解菌体。
(5)超声过程中保持菌液处于冰浴中，超声条件为的超声仪功率220Hz，期间避免溶液过热，超声3s，间歇1s，待菌液较清亮时，约30min停止超声。
(6)10000rpm，4℃离心3min，收集上清中的可溶性蛋白。
(7)用Binding Buffer将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为10倍柱体积/小时，收集流穿液，通过控制加入的菌体裂解液的速度来控制流速。
(8)使用15倍柱体积的Binding Buffer冲洗柱子，洗去杂蛋白。
(9)使用Elution Buffer洗脱，收集洗脱峰。洗脱峰可以分管收集，每1mL收集1管。
(10)洗脱后，依次使用10倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用3倍柱体积的20％乙醇平衡(乙醇要将填料浸没)，4℃保存。
(11)对收集的洗脱峰通过SDS-PAGE电泳检测。
通过对收集管内溶液的电泳检测和蛋白浓度分析后最终合并保留得到相应的经纯化的噬菌体裂解酶Bp7e及其突变体蛋白，纯化蛋白经透析过夜备用。
1.2.2裂解酶Bp7e蛋白及其突变体的平板抑菌试验
分别将大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球和溶壁微球菌复苏，挑取单菌落于LB肉汤中37℃180rpm培养10h左右，分别取适量菌液用灭菌生理盐水倍比稀释至OD600为0.13左右，使其菌液浓度达到108cfu/mL。取200uL菌液用灭菌的棉签在普通平板上均匀涂布，放上灭菌牛津杯，在牛津杯中分别加入200μL浓度为1mg/mL的纯化裂解酶Bp7e蛋白及其突变体蛋白蛋白，37℃温箱中培养12h左右观察并测量抑菌圈大小，同时检测浓度为1mg/mL的标准蛋清溶菌酶的抑菌效果做为对照试验，结果如表1和图3-8所示。
表1 裂解酶Bp7e蛋白及其突变体对检测菌种的抑菌圈大小
由表1和图3-8结果可见，裂解酶Bp7e蛋白及其突变体对溶壁微球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均有明显的抑菌效果，对大肠杆菌的抑菌圈最大，而且裂解酶Bp7c突变体蛋白对这4种菌的抑菌圈都比Bp7e大，标准蛋清溶菌酶对溶壁微球菌抑菌效果明显，而对大肠杆菌、沙门氏菌及金黄色葡萄球菌均没有明显抑菌效果。
1.2.3 Bp7裂解酶及其突变体裂解效率及裂解谱的检测
将长至对数生长期的01、015、024、078、088血清型大肠杆菌和溶壁微球菌离心后分别用PBS缓冲液重悬，调节成吸光度值OD600为0.5左右。将浓度相同的纯化的裂解酶Bp7c蛋白及其突变体蛋白各取100μL加入等量细菌混悬液中，记录初始蛋白与细菌悬液的OD600值，每株细菌各做3个重复。37℃温箱培养，分别测量2h及6h时混合悬液的OD600。以细菌混悬液浊度下降50％为裂解阳性标准，检测噬菌体Bp7e及突变体上述菌株的裂解作用，结果见表2和图9。
表2 裂解酶Bp7e蛋白及其突变体的裂菌谱测定(+为阳性：±为弱阳性)
结果显示，所测菌株混悬液的OD600值均有所下降，裂解酶Bp7e及其突变体的裂解谱一致，突变体的裂解效率均高于天然裂解酶，且在2h后检测溶壁微球菌、大肠杆菌015和088的OD600值下降50％以上，而对大肠杆菌01，024，078，2h后检测OD600值下降不到50％，而6h检测其0D600值均下降50％左右。说明裂解酶Bp7e及突变体的裂解谱较广且裂解谱相同，而裂解酶Bp7e突变体的裂解效果更好，见表2，但两种蛋白对不同菌株的裂解效率不同，对大肠杆菌015和088的裂解效率最高，见图9。

Claims (9)

1.一种溶菌酶Bp7e，其特征在于：其具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。
2.一种溶菌酶Bp7e突变体，其特征在于：其为将权利要求1所示的溶菌酶Bp7e氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分别进行突变为丙氨酸和谷氨酸得到的突变体。
3.权利要求2所述的溶菌酶Bp7e突变体，其特征在于：其具有SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
4.编码权利要求1所述的溶菌酶Bp7e或权利要求2或3所述的溶菌酶Bp7e突变体的核酸。
5.包含权利要求4所述核酸的表达质粒。
6.包含权利要求4所述的核酸或权利要求5所述的表达质粒的宿主细胞。
7.权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于：所述细胞为大肠杆菌。
8.权利要求1所述的溶菌酶Bp7e、权利要求2或3所述的溶菌酶Bp7e突变体在制备治疗或预防细菌感染的药物中的用途。
9.权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的细菌为溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌。
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