CN114958936A - 一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产l-色氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L‑色氨酸的方法，包括以下步骤：1)色氨酸生产菌株的扩大培养阶段：在摇瓶中添加种子培养基，将菌株接种至摇瓶内进行扩大培养；2)补料分批发酵阶段：摇瓶中添加含有纤维素的发酵培养基，将步骤1)中扩大培养后的种子接种至摇瓶，然后在摇瓶内加入纤维素酶粗酶液，纤维素酶粗酶液与发酵培养基中所含的纤维素组分持续反应，为发酵体系提供还原糖作为补料碳源。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法。
背景技术
在化石危机和可持续发展的呼吁下，各种清洁能源的发展已成为必然。生物质能也凭借其储量大的优势而被广泛接纳。其中，利用纤维素作为原料生产高附加值产品是一种绿色且可持续的生产方式。
氨基酸的生产方法主要是化学合成法、酶转化法、提取法和微生物发酵法，目前全球氨基酸总产量的85％以上都是通过微生物发酵法生产，发酵采用的碳源主要是淀粉原料，包括玉米淀粉、小麦淀粉等，存在与人争粮的问题。纤维素来源广泛，大多来自于玉米棒芯、秸秆、麦秆等农业废料。纤维素成分经高效的预处理、酶解后，可得到较高浓度的可发酵糖。利用纤维素原料进行氨基酸的发酵进行生产可以很好地解决粮食浪费以及与人争粮的问题。
现有的微生物发酵生产L-色氨酸的方法中普遍以葡萄糖作为碳源，而葡萄糖则以玉米等谷物中的淀粉为原材料所制备得来，这无形中增大了对粮食储备的消耗。本发明中采用纤维素作为碳源，纤维素可以由玉米棒芯、秸秆、麦秆等农业废料经简单处理后得到，由此解决了传统微生物发酵生产L-色氨酸的方法带来的浪费粮食以及与人争粮的问题。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，拓展微生物发酵生产氨基酸过程中可利用的碳源。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，包括以下步骤：
A、通过纤维素酶生产菌株异源表达纤维素酶；
B、利用步骤A中得到的纤维素酶与纤维素持续反应，获得碳源进行补料分批发酵生产L-色氨酸。
进一步的，所述步骤A中的异源表达纤维素酶包括以下步骤：
A1、构建纤维素酶生产菌株，采取电转化的方式将构建好的质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)；
A2、将纤维素生产菌株以1％～3％接种量接种于LB培养基中，在37℃、200rpm条件下培养，2～4h后添加0.1mM IPTG、7～9h添加1mM Ara进行诱导。12h后于10000rpm、5min的条件下对发酵液进行离心操作，收集离心后的上清液，得到纤维素酶粗酶液。
进一步的，所述步骤A1中的质粒为pET28a-cel5-lysis；
所述步骤A1中的电转化条件为2500v、4～6ms。
进一步的，所述步骤B中的补料分批发酵包括：
B1、将菌株W3110以2％的接种量接种于种子培养基中，在37℃，200rpm条件下培养12h；
B2、将步骤B1中所得发酵液以10％的接种量接种于含有纤维素的发酵培养基中，随后加入4％的纤维素酶粗酶液，在37℃，200rpm条件下培养。
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
本发明通过构建基因工程菌异源表达来自枯草芽孢杆菌的纤维素酶Endo-1,4-beta-glucanase，提高了纤维素酶的表达效率。
本发明通过基因工程法破碎细胞从而收集纤维素酶，与传统机械法相比，发热量小，对酶活性的影响较低，从而得以获取高活性的纤维素酶。
本发明将纤维素应用于高附加值产品的生产，实现了农业废料的二次利用。
本发明利用纤维素水解液充当碳源进行补料分批发酵，与传统发酵相比，在发酵过程中不断补充营养物质，极大地提高了L-色氨酸的产量；与传统补料分批发酵相比，利用农业废料纤维素作为碳源，降低了发酵成本。
附图说明
图1为实施例1不同酶浓度下的还原糖产量。
图2为实施例2不同底物浓度下的还原糖产量。
图3为实施例3W3110发酵液中还原糖浓度。
图4为实施例4W3110发酵液中L-色氨酸浓度。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
本发明以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的具体实验步骤为：
1、纤维素酶生产菌株的构建
通过冷甘油洗涤的方法将大肠杆菌BL21(DE3)制备为电转化感受态，将感受态细胞与3～5uL pET28a-cel5-lysis质粒混合均匀后置于冰上预冷5～10min，转移至预冷的1mm电转杯中，2500v、4～6ms条件下进行电转化，得到纤维素酶生产菌株。
2、纤维素酶粗酶液的获取
将纤维素酶生产菌株以2％接种量接种于LB培养基中，于3h添加0.1mM IPTG、8h添加1mM Ara进行诱导，在12h时收集发酵液，于10000rpm、5min的条件下进行离心操作，收集离心后的上清液，得到纤维素酶粗酶液。
3、纤维素酶酶解条件的确定
将不同比例的纤维素酶粗酶液分别加入等浓度的纤维素溶液中，反应一段时间后，取发酵液测得生成的还原糖总量，并确定较优的纤维素酶添加比例。随后以此比例将纤维素酶粗酶液分别添加至不同底物浓度的纤维素溶液中，反应后取能生成更多还原糖的纤维素浓度作为较优的底物浓度。
4、补料发酵生产L-色氨酸
将菌株W3110以2％的接种量接种于种子培养基中，在37℃，200rpm条件下培养12h，然后取发酵液以10％的接种量接种于含有纤维素的发酵培养基中，随后加入4％的纤维素酶粗酶液，在37℃，200rpm条件下培养。其中，种子培养基和含有纤维素的发酵培养基的添加量均为摇瓶容积的20％。
5、分析方法
5.1纤维素酶的酶活测定
取150μL pH 5.0的醋酸钠缓冲液(含1％纤维素)于1.5mL离心管中，加入50μL纤维素酶粗酶液吹打混匀后在37℃条件下反应10min。反应完全后加入200μL DNS溶液并混匀，置于100℃条件下反应10min，取出后立即置于冰上冷却至室温。于540nm波长下测定反应混合液的吸光值。纤维素酶的酶活单位1U定义为反应1分钟能够产生的还原糖的摩尔数(μmol)，计算公式如下：
其中C是反应后混合液中的还原糖浓度(g/L)，VT是纤维素酶水解反应时反应液的体积(μL)，VS是加入的酶液的体积(μL)，M是葡萄糖的摩尔质量，T是酶反应的时间(min)。
5.2纤维素酶解液中还原糖含量的测定
取200uL纤维素酶解液与200uL DNS溶液混匀，100℃条件下反应10min，取出后立即置于冰上冷却至室温。于540nm波长下测定反应液的吸光值。在一定浓度范围内，光吸收值与还原糖含量成正比，因此可以测定还原糖的含量。
5.3发酵液中L-色氨酸含量的测定
发酵液离心后取上清液50μL与450μL对二甲氨基苯甲醛溶液混匀。于100℃条件下反应2min后，加入亚硝酸钠溶液20μL，混匀后继续在100℃条件下反应3min。反应结束后置于冰上冷却至室温，随后在酶标仪中测量OD600nm下的吸光值。在一定浓度范围内，光吸收值与L-色氨酸含量成正比，由此可以测定L-色氨酸的含量。
实施例1
本实施例是确定不同比例的纤维素酶粗酶液对于纤维素酶水解体系的影响。
步骤：将纤维素酶粗酶液以4％与20％的浓度分别加入20g/L的纤维素溶液中，于37℃的条件下进行反应，通过比较不同反应时间可生成的还原糖的总量来反映酶浓度对酶反应的影响，实验结果如图1所示。
由实验结果可知，虽然两种酶浓度相差5倍，还原糖产量却没有太大的影响，故选用4％酶浓度来作为反应条件。
实施例2
本实施例是确定不同比例的纤维素底物浓度对纤维素酶水解体系的影响。
步骤：配制浓度为1g/L、5g/L、10g/L、20g/L的纤维素溶液，分别加入4％的纤维素酶粗酶液，于37℃的条件下进行反应。通过比较不同反应时间可生成的还原糖的总量来选择合适的底物浓度，实验结果如图2所示。
由实验结果可知，还原糖的产量几乎与底物浓度成正比，20g/L的底物浓度下还原糖的产量要远高于其他三组。因为在后续的实验中要为发酵体系提供较高的还原糖浓度，所以选择20g/L的纤维素浓度作为后续的反应条件。
实施例3
本实施例在同样的发酵条件下，探究本发明中的补料分批发酵方法对发酵体系带来的影响。
步骤：配制发酵培养基以及含有20g/L纤维素的发酵培养基。将菌株W3110以2％的接种量接入种子培养基后以37℃和200rpm的条件培养12h，之后以10％接种量分别转接至发酵培养基以及含有20g/L纤维素的发酵培养基。其中含有纤维素的发酵培养基的培养基分为两组，一组在接种后立即加入4％的纤维素酶粗酶液，另一组则不加。随后在37℃，200rpm的条件培养48h，每12h取样，将样品离心后取上清加入等量的DNS溶液，在100℃条件下反应10min，待反应液冷却至室温后测量其在光波长为540nm下的吸光值，并计算得出还原糖的浓度。结果如图3所示。
由实验结果可知，添加了纤维素以及纤维素酶粗酶液的组别中在发酵过程中还原糖的浓度始终处于一个较高的位置。由此可以得出，培养基中的纤维素酶与纤维素作用后确实可以起到类似流加碳源的作用。
实施例4
本实施例在同样的发酵条件下，探究本发明中的补料分批发酵方法对发酵体系中L-色氨酸产量的影响。
步骤：配制发酵培养基以及含有20g/L纤维素的发酵培养基。将菌株W3110以2％的接种量接入种子培养基后以37℃，200rpm的条件培养12h，之后以10％接种量分别转接至发酵培养基以及含有20g/L纤维素的发酵培养基。其中含有纤维素的发酵培养基的培养基分为两组，一组在接种后立即加入4％的纤维素酶粗酶液，另一组则不加。随后在37℃和200rpm的条件培养48h，每12h取样，将样品离心后取上清50μL与450μL对二甲氨基苯甲醛溶液混匀。于100℃条件下反应2min后，加入亚硝酸钠溶液20μL，混匀后继续在100℃条件下反应3min。反应结束后置于冰上冷却至室温，随后在酶标仪中测量OD600nm下的吸光值，并计算得出发酵液中的L-色氨酸含量。结果如图4所示。
由实验结果可知，添加了纤维素以及纤维素酶粗酶液的组别中L-色氨酸的产量始终高于另外两组，使目标产物L-色氨酸的产量提高了26.19％。由此可以得出，本发明中的补料分批发酵方法可以提高发酵体系中的L-色氨酸产量。
Claims (9)
1.一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)色氨酸生产菌株的扩大培养阶段：在摇瓶中添加种子培养基，将菌株接种至摇瓶内进行扩大培养；
2)补料分批发酵阶段：摇瓶中添加含有纤维素的发酵培养基，将步骤1)中扩大培养后的种子接种至摇瓶，然后在摇瓶内加入纤维素酶粗酶液，纤维素酶粗酶液与发酵培养基中所含的纤维素组分持续反应，为发酵体系提供还原糖作为补料碳源。
2.如权利要求1所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤1)中，色氨酸生产菌株为W3110。
3.如权利要求1所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤1)中，种子培养基成分为磷酸氢二钾、酵母粉、磷酸二氢钾、葡萄糖和七水合硫酸镁。
4.如权利要求1所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤1)中，接种量为培养基总体积的1％～3％。
5.如权利要求1所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤2)中，含有纤维素的发酵培养基成分包括磷酸氢二钾、酵母粉、七水合硫酸镁、硫酸铵、柠檬酸、七水合硫酸亚铁、葡萄糖和纤维素。
6.如权利要求1所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤2)中，接种量为培养基总体积的8％～12％。
7.如权利要求1所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：步骤2)中，纤维素酶粗酶液的添加量为培养基总体积的3％～5％。
8.如权利要求1所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于所纤维素酶粗酶液的制取方法包括以下步骤：首先构建纤维素酶异源表达工程菌，然后在摇瓶中进行发酵后，通过细胞破碎操作获得胞内纤维素酶蛋白，对发酵液进行离心后，上清即为所述纤维素酶粗酶液；其中，纤维素酶基因表达来自枯草芽孢杆菌的纤维素酶Endo-1,4-beta-glucanase，将此外源基因整合到质粒载体后得到质粒pET28a-cel5-lysis；工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.如权利要求8所述的一种以纤维素为碳源补料分批发酵生产L-色氨酸的方法，其特征在于：所述细胞破碎操作选用基因工程法，优选为通过Ara诱导的lysis裂解回路。
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