CN114196588B - 一种嗜热厌氧琥珀酸梭菌株及其利用木质纤维素产琥珀酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于生产琥珀酸的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株（Pseudoclostridium thermosuccinogenes）PT‑GD‑2。所述菌株PT‑GD‑2能够在高温条件下高产琥珀酸，消耗100克葡萄糖可以生产琥珀酸近70克，与现有的琥珀酸梭菌株相比，实现了高温条件下琥珀酸产量的显著提升。此外，所述菌株PT‑GD‑2具有较宽的最适pH条件，在pH6.2‑8.0的条件下均能获得较高的生物量。基于该最适pH条件与热纤梭菌的最适pH条件（中性）相错，本申请提供了所述菌株PT‑GD‑2与热纤梭菌偶联“一锅法”生产琥珀酸的方法。该方法以木质纤维素为底物，不但操作简单、降低了生产成本，而且最大程度上提高了琥珀酸的产量，而且降低副产物的生成，具备重要的实际应用价值。

Description

一种嗜热厌氧琥珀酸梭菌株及其利用木质纤维素产琥珀酸的 方法

技术领域

本发明属于生物学领域，具体涉及一株生产琥珀酸的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株(Pseudoclostridium thermosuccinogenes)以及采用所述菌株偶联热纤梭菌以木质纤维素为底物生产琥珀酸的方法。

背景技术

琥珀酸(Succinic acid，又称丁二酸)是一种重要的“C4平台化合物”，可以衍生出许多日用品和专用化学品，广泛应用于食品、医药、农业领域。其中，在食品领域主要用于液体调味品及炼制品的风味改良，在医药领域主要用于琥乙红霉素等药品，在农业领域主要用于生产植物生长调节剂、杀虫剂等。除此之外，琥珀酸还是重要的基础化工原料，作为中间产物和专业化学制品，可用于合成1,4-丁二醇、四氢呋喃以及可降解生物高分子材料聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)等。近年来。随着应用领域的不断拓展，国际市场对琥珀酸的需求猛增。目前，琥珀酸已经是公认的最有应用前景的从碳水化合物通过生物法或化学法生产的生物基化学品。

相较于化学法的高温高压反应条件，生物发酵法制备琥珀酸具有条件温和、能耗小、环境友好的优势。现有的琥珀酸生产菌株主要是放线菌、曼海姆菌、谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等选育菌株或者代谢工程菌株。但上述生物发酵制备琥珀酸法均采用淀粉来源的葡萄糖为碳源，不仅成本高昂，而且存在与人争粮、与粮争地的问题。

为解决这一问题，研究人员开发了木质纤维素原料到糖的转化方法，并采用木质纤维素基可发酵糖(通常是五碳糖和六碳糖的混合糖)为碳源，培养菌株来生产琥珀酸。但采用真菌来源的商业化纤维素酶、半纤维素酶水解秸秆等木质纤维素原料后，的水解液作为糖源进行琥珀酸生产菌株的发酵培养也存在诸多问题。最主要的是，采用真菌来源的酶制剂成本高昂，使得木质纤维素来源的可发酵糖与淀粉糖相比，并不具备明显的市场竞争力，进而导致木质纤维素来源琥珀酸制备技术难以真正实现实际应用。除此之外，产率也不甚理想。Bukhari,N.A.等(Industrial Crops and Products 2021,171)报道了采用预处理后的油棕生物质为原料，添加纤维素酶水解获得含糖水解液，然后以水解液为碳源培养产琥珀酸放线菌生产琥珀酸。然而，琥珀酸产量仅为17.5克每100克油棕底物，其中主要的问题在于从底物中获得可发酵糖的得率仅为45％(质量比)。

发明专利201810939329.2、201810939479.3提出了不依赖于游离酶的木质纤维素糖化方法，主要利用热纤梭菌等高温纤维素降解菌为全菌催化剂。发明专利201810939294.2、201810939182.7、201810939517.5、201810939181.2、201810939518.X等进一步明确了这种木质纤维素糖化方法可以与下游的发酵技术配合使用。然而，已知的琥珀酸生产菌株均为中温条件生长的细菌，与基于高温纤维素降解菌的体系存在培养条件不统一的问题，如强行匹配，那么在实际生产中则必须经历升温、降温等过程，导致耗能成本高。因此，用于木质纤维素产琥珀酸的菌株以及相关应用技术十分缺乏。

发明内容

针对现有技术中以木质纤维素为原料生产琥珀酸所存在的问题，本发明提供了一种用于生产琥珀酸的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株(Pseudoclostridium thermosuccinogenes)PT-GD-2。同时，本申请提供了所述菌株PT-GD-2以木质纤维素为底物，与纤维素降解高温菌热纤梭菌联合发酵生产琥珀酸的方法，具有重要的实际应用价值。

本发明的技术方案：

发明人从广东省茂名市农田中筛选得到一株可高产琥珀酸的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株(Pseudoclostridium thermosuccinogenes)，所述嗜热厌氧琥珀酸梭菌株命名为嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.23684，保藏日期为2021年10月28日。所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2，具有较宽的最适pH条件，在pH6.2-8.0的条件下均能获得较高的生物量；且该最适pH条件与热纤梭菌的最适pH条件(中性)相错，为二者的偶联提供了可能性。这是因为，在pH6.2时热纤梭菌的生长受到抑制，而热纤梭菌生产的纤维素降解酶系——纤维小体在该条件下则具有更高的活性，能够实现木质纤维素底物的降解，从而为PT-GD-2菌株的生长提供碳源。

一种包含所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2的菌剂。

如前所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2的应用，将所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株用于发酵生产琥珀酸。具体为：将所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株接入发酵培养基进行发酵生长，发酵完成后，从发酵液中分离得到琥珀酸；所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖、果糖、纤维二糖或木糖。其中，所述的碳源浓度为10-20g/L；所述的发酵生长的温度为55-65℃；所述发酵生长的pH为6.2-8。所述发酵培养基的组份为：碳源10-20g/L，磷酸氢二钾2.9g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，尿素2.1g/L，氯化钙150mg/L，氯化镁1.0g/L，硫酸亚铁1.25mg/L，半胱氨酸1.0g/L，刃天青1.0mg/L，酵母提取物6.0g/L。

优选的是，所述的碳源为葡萄糖和木糖中的一种或者两种。

如前所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2的应用，将所述嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2与热纤梭菌偶联进行“一锅法”生产琥珀酸，具体包括以下步骤：

(1)木质纤维素糖化：向发酵罐中添加GS-2培养基和预处理后的木质纤维素底物，混合均匀；接种热纤梭菌菌株在pH＝6.2-8.0进行糖化，得到木质纤维素发酵液。其中，所述的木质纤维素底物为秸秆和玉米芯；所述热纤梭菌的接种比例为5-10％。由于热纤梭菌的最适生长条件在pH中性，在pH6.2时细胞生长和代谢停滞；与此同时，其所生产的纤维素降解酶系——纤维小体在该条件下具有更高的活性，有利于木质纤维素糖化的进程。

(2)发酵生产琥珀酸：当木质纤维素发酵液中葡萄糖的浓度累积达到10-20g/L时，控制pH＝6.2-6.5，按照体积比1-10％接种嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2；当木质纤维素发酵液中葡萄糖浓度为零时，结束发酵，得到琥珀酸盐。其中，所述发酵生产琥珀酸的温度为55-65℃。

本发明的有益效果：

(1)本发明提供了一株嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2，所述菌株能够在高温条件下高产琥珀酸，不但副产物少，而且琥珀酸产量高，消耗100克葡萄糖可以生产琥珀酸近70克，与现有琥珀酸梭菌株相比，实现了高温条件下产量的显著提升。

(2)本发明所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2，具有较宽的最适pH条件，在pH6.2-8.0的条件下均能获得较高的生物量；且该最适pH条件与热纤梭菌的最适pH条件相错，为二者的偶联提供了可能性。

(3)本发明提供了所述的嗜热厌氧琥珀酸梭菌株PT-GD-2与热纤梭菌偶联“一锅法”生产琥珀酸的方法，利用热纤梭菌与PT-GD-2最适pH条件相错的特点，通过pH的控制，实现了以木质纤维素为底物琥珀酸的生产，不但操作简单、降低了生产成本，而且最大程度上提高了琥珀酸的产量，而且降低副产物的生成，具备重要的实际应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1.菌株PT-GD-2的分离筛选

1)初筛：

在超净工作台中，取2克土壤加入48mL无菌水中充分振荡混匀，然后取5mL悬液加入20mL筛选培养基(每升磷酸氢二钾2.9g，磷酸二氢钾1.5g，尿素2.1g，氯化钙150mg，氯化镁1.0g，硫酸亚铁1.25mg，半胱氨酸1g，刃天青1.0mg，盐酸吡哆胺2g，生物素0.2g，对氨基苯甲酸0.4g，维生素B12 0.2g，葡萄糖5g，pH 6.2)中充分振荡混匀，获得土壤悬液。用筛选培养基将土壤悬液梯度稀释10²-10⁵倍，均匀涂布于0.8％质量体积比琼脂的筛选培养基平板上。将平板正置于厌氧盒中，放于60℃恒温培养箱厌氧条件培养10天。

2)复筛：

挑取较大的菌落在5mL筛选培养基中扩大培养，60℃下170rpm水平振荡培养24小时，之后取0.05mL培养物再接种到5mL筛选培养基中传代，同样在60℃下170rpm水平振荡培养24小时，然后分析不同培养物的OD600，同时用HPLC分析上清液中的有机酸种类和含量。

实施例2.菌株的鉴定

选择生物量(OD600)较大且上清液中有琥珀酸产生的菌株，提取基因组DNA，进行以27F/1492R为引物对的16S rRNA基因扩增。其中一株菌的16S rRNA基因序列，通过NCBI的Blast序列比对，与琥珀酸梭菌Pseudoclostridium thermosuccinogenes DSM 5809菌株(Genbank序列号：NR_119284.1)的同源性大于99％，因此判定该菌株属于琥珀酸梭菌，菌株名称为PT-GD-2。该菌株已保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.23684，保藏日期2021年10月28日。

实施例3.菌株PT-GD-2的生理生化性质

对菌株PT-GD-2的最适生长条件进行了分析，确定该菌可以在葡萄糖、果糖、纤维二糖和木糖中生长，其中最适碳源类型为木糖和葡萄糖，且可以两种糖共利用，不存在碳阻遏现象，最适生长温度为55-65℃、最适生长pH为6.2-8。pH低于5.5时，菌株不能生长。以木糖或葡萄糖为碳源进行批次发酵，最适初始碳源浓度为10-20g/L。

以10g/L葡萄糖为初始碳源，接种量为1％(体积比)，温度为60℃条件下，在发酵培养基(每升磷酸氢二钾2.9g，磷酸二氢钾1.5g，尿素2.1g，氯化钙150mg，氯化镁1.0g，硫酸亚铁1.25mg，半胱氨酸1g，刃天青1.0mg，酵母提取物6.0g，pH＝7.4)条件下，将菌株PT-GD-2培养到30小时，pH降到5.5，但OD600超过2.5且一直到60小时生物量均较为稳定，说明该菌株具有发酵鲁棒性。

在初始pH＝6.5条件下，接种量为10％(体积比)，温度为60℃条件下，以葡萄糖为初始碳源开展批次发酵，通过添加20克每升的碳酸镁作为pH缓冲剂。当初始葡萄糖浓度为20g/L时，琥珀酸产量为7.6克每升，其中由于发酵过程pH降低到5.5造成菌株生长停滞，因此葡萄糖剩余5g/L，琥珀酸得率为50.6克每100克葡萄糖，约0.84摩尔琥珀酸每摩尔葡萄糖。

实施例4.菌株PT-GD-2的琥珀酸发酵性能优化(控制pH，批次发酵)

在初始pH＝7.0、条件下，接种量为1％(体积比)，温度为60℃条件下，以20g/L葡萄糖为初始碳源开展批次发酵；在添加7.5克每升的碳酸镁的基础上，通过向1L发酵罐中流加碳酸钠将pH控制在7.0。经过36小时发酵，葡萄糖完全消耗后获得11.8g/L琥珀酸盐，得率为59.2克每100克葡萄糖。说明，该菌株在控制pH的条件下，可以实现葡萄糖的完全消耗，同时，琥珀酸盐的产量也有明显提升。与不控制pH相比，琥珀酸盐的产量提升了8.6g每100克葡萄糖，提升了约17％。

实施例5.菌株PT-GD-2的琥珀酸发酵性能优化(补料，连续发酵)

与实施例4不同的是，在初始pH7.4条件下，接种量为5％(体积比)，温度为55℃条件下，在1L发酵罐中开展连续补料实验，使葡萄糖浓度控制在10g/L。发酵36小时后，将温度提高到65℃。经过72小时发酵，产生琥珀酸盐55.4g/L，得率为69.6克每100克葡萄糖。说明，控制碳源浓度的条件下，该菌株生产得到的琥珀酸盐的浓度得到了显著的提升。与不控制碳源浓度相比，琥珀酸盐的产量提升了19.0g每100克葡萄糖，提升了约38％。

实施例6.热纤梭菌的木质纤维素全菌催化糖化

利用表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌菌株进行碱预处理木质纤维素底物的全菌糖化，具体操作为：在初始pH7.4条件下，将表达葡萄糖苷酶的热纤梭菌重组菌株预先在以5克每升微晶纤维素为碳源的GS-2培养基中培养至对数中期，然后按照10％(体积比)的接种量接种到80克每升干重的预处理秸秆或木糖渣(木糖渣为酸水解提取木糖后的玉米芯废弃物)作为碳源的GS-2培养基中，在60℃、170r/min的摇床中进行培养，直到水解液中的还原糖浓度不再变化。以秸秆为底物，总糖含量为69％，水解液中还原糖浓度为50.1克每升，糖得率为90.6％，其中葡萄糖38.1克每升，木糖12克每升。以木糖渣为底物，总糖含量为78％，水解液中还原糖浓度为55.5克每升，糖得率为89％，其中葡萄糖52克每升，木糖3.5克每升。(详见参考文献。)

实施例7.热纤梭菌秸秆糖化偶联PT-GD-2批次发酵产琥珀酸

将实施例6获得的水解液根据葡萄糖的浓度进行稀释，直到葡萄糖浓度为20克每升，以稀释后的水解液作为培养基进行如实施例4所述的批次发酵实验，葡萄糖和木糖均完全消耗并获得10.9g/L琥珀酸盐，得率为54.5克每100克葡萄糖。由此可知，本申请所述的菌株PT-GD-2采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源，在相同条件下得到琥珀酸的产量与实施例4相比，产量仅略有降低。这说明，该菌株在控制pH的条件下，采用木质纤维素来源的葡萄糖为碳源发酵生产琥珀酸是可行的。

实施例8.热纤梭菌秸秆糖化偶联PT-GD-2连续发酵产琥珀酸

将实施例6获得的水解液进行旋蒸浓缩，使糖浓度提高到200克每升。按照实施例5所述的连续补料发酵实验，在控制pH＝6.5的情况下，向1L发酵体系中补加浓缩后的水解液，使葡萄糖浓度控制在10g/L，发酵72小时后共消耗85克葡萄糖，获得46.3克琥珀酸盐，得率为53.8克每100克葡萄糖。由此可知，本申请所述的菌株PT-GD-2采用木质纤维素来源的葡萄糖和木糖为碳源，在相同条件下得到琥珀酸的产量与实施例5相比，产量有所降低，但仍然不低于实施例3的产量。这说明，该菌株在控制葡萄糖浓度的条件下，采用木质纤维素来源的葡萄糖和木糖为碳源发酵生产琥珀酸是可行的。

实施例9.热纤梭菌偶联PT-GD-2一锅法生产琥珀酸

在2L发酵罐中添加GS-2培养基(成分：每升磷酸氢二钾2.9g，磷酸二氢钾1.5g，尿素2.1g，氯化钙150mg，氯化镁1.0g，硫酸亚铁1.25mg，半胱氨酸1g，柠檬酸钠3g，酵母提取物6.0g，刃天青1.0mg)，同时添加质量体积比为10％的碱预处理木糖渣为底物(木糖渣为酸水解提取木糖后的玉米芯废弃物)，在60℃无氧条件下空培12小时，搅拌桨转速150转每分钟，使底物充分混合，起始pH为7.4。然后按照体积比5％接种实施例5所述的热纤梭菌菌株培养，当葡萄糖积累浓度达到20克每升时，按照10％体积比接种PT-GD-2，pH控制在6.2-6.5，此条件下PT-GD-2可正常生长而热纤梭菌生长抑制，同时热纤梭菌所生产的纤维素降解酶系——纤维小体仍可正常发挥作用，从而实现纤维素底物降解和琥珀酸发酵生产同步实现。当发酵液中葡萄糖浓度为零，而琥珀酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终琥珀酸盐的产量为42.1克每升，木糖渣底物中含有总糖约78％，按照木质纤维素原料计算，琥珀酸得率为42克每100克木糖渣干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，琥珀酸得 率为59.9克每100克葡萄糖。

实施例10.热纤梭菌偶联PT-GD-2一锅法生产琥珀酸

与实施例9不同的是，在2L发酵罐中添加GS-2培养基和质量体积比为4％的碱预处理秸秆为底物，在60℃下使底物充分混合，起始pH为7.4。然后按照体积比10％接种实施例5所述的热纤梭菌菌株培养，当葡萄糖积累浓度达到10克每升时，按照5％体积比接种PT-GD-2，温度调至65℃，pH控制在6.2-6.5，当发酵液中葡萄糖浓度为零而琥珀酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终琥珀酸盐的产量为13.2克每升，按照木质纤维素原料计算，琥珀酸得率为33.1克每100克预处理秸秆干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，琥珀酸得率为53.3克每100克葡萄糖。

实施例11.热纤梭菌偶联PT-GD-2一锅法生产琥珀酸

与实施例10不同的是，在1L发酵罐中添加GS-2培养基和质量体积比为8％的碱预处理秸秆为底物，在60℃下使底物充分混合，起始pH为7.4。然后按照体积比10％接种实施例5所述的热纤梭菌菌株培养，当葡萄糖积累浓度达到15克每升时，按照1％体积比接种PT-GD-2，pH控制在6.2-6.5，当发酵液中葡萄糖浓度为零而琥珀酸浓度连续2小时不再升高时，结束发酵。最终琥珀酸盐的产量为30.1克每升，按照木质纤维素原料计算，琥珀酸得率为37.6克每100克预处理秸秆干重。按照糖得率为90％情况下的葡萄糖当量计算，琥珀酸得率 为60.5克每100克葡萄糖。

综上可知，本申请所述的琥珀酸梭菌株PT-GD-2最适生长温度为55-65℃，而且在合适的pH和葡萄糖浓度条件下，其发酵生产琥珀酸的产量可达近70g每100克葡萄糖。与现有中温琥珀酸梭菌株相比，本申请所述的琥珀酸梭菌株PT-GD-2实现了高温条件下产量的显著提升，具有重要的实际应用价值。此外，基于菌株PT-GD-2的高温特性以及其最适pH与热纤梭菌最适pH相错的特点，本申请提供了菌株PT-GD-2与热纤梭菌偶联生产琥珀酸的方法，仅通过控制pH就实现了以木质纤维素为底物“一锅法”生产琥珀酸，整个过程中无需升温或降温、更无需更换生产装置，因此操作简单、降低了生产成本，还降低副产物的生成。同时，所述方法采用木质纤维素为底物，进一步降低了生产成本，具备重要的实际应用价值。

Claims (10)

1.一株产琥珀酸的嗜热厌氧梭菌株，其特征在于：所述嗜热厌氧梭菌株命名为嗜热厌氧梭菌株PT-GD-2（Pseudoclostridium thermosuccinogenes），保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCCNo. 23684，保藏日期为2021年10月28日。

2.一种包含权利要求 1 所述的嗜热厌氧梭菌株的菌剂。

3.如权利要求1所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：将所述的嗜热厌氧梭菌株用于发酵生产琥珀酸。

4.根据权利要求3所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：将权利要求1所述的嗜热厌氧梭菌株接入发酵培养基进行发酵生长，发酵完成后，从发酵液中分离得到琥珀酸；所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖、果糖、纤维二糖或木糖。

5.根据权利要求4所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：所述的碳源为葡萄糖和木糖中的一种或者两种。

6.根据权利要求5所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：所述的碳源浓度为10-20g/L；所述的发酵生长的温度为55-65℃；所述发酵生长的pH为6.2-8。

7.根据权利要求4-6中任意一项所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养基的组份为：碳源10-20g/L，磷酸氢二钾2.9 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，尿素 2.1 g/L，氯化钙150 mg/L，氯化镁1.0 g/L，硫酸亚铁1.25 mg/L，半胱氨酸1.0 g/L，刃天青1.0 mg/L，酵母提取物 6.0 g/L。

8.根据权利要求3所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：将所述嗜热厌氧梭菌株PT-GD-2与热纤梭菌偶联进行“一锅法”生产琥珀酸，具体包括以下步骤：

（1）木质纤维素糖化：向发酵罐中添加GS-2培养基和预处理后的木质纤维素底物，混合均匀；接种热纤梭菌菌株进行糖化，得到木质纤维素发酵液；

（2）发酵生产琥珀酸：当木质纤维素发酵液中葡萄糖的浓度累积达到10-20g/L时，在pH=6.2-6.5的条件下，按照体积比1-10%接种嗜热厌氧梭菌株PT-GD-2；当木质纤维素发酵液中葡萄糖浓度为零时，结束发酵，得到琥珀酸盐。

9.根据权利要求8所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：步骤（2）所述发酵生产琥珀酸的温度为55-65℃。

10.根据权利要求8所述的嗜热厌氧梭菌株的应用，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素底物为秸秆和玉米芯；所述热纤梭菌的接种比例为5-10%。