CN114958701A - 一种高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌及构建方法 - Google Patents
一种高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌及构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产γ‑环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌及构建方法，属于微生物工程技术领域。本发明提供了一种含有SEQ ID NO.1序列的γ‑环糊精葡萄糖基转移酶，并且成功的采用食品安全菌株枯草芽孢杆菌其进行异源表达，本发明的方法安全、高效，可应用于食品、药品的生产中。并且，采用本发明的方法，对枯草芽孢杆菌表达***进行优化后，显著提高了该酶的胞外表达水平，胞外酶活可达30.18U/mL，较原始表达***提高了7.4倍；本发明的γ‑环糊精葡萄糖基转移酶可直接作用于淀粉底物，在不添加络合剂的条件下转化率可达约34％，γ‑环糊精占比最高可达56％，具有工业生产潜力。
Description
技术领域
本发明涉及一种高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌及构建方法，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
环糊精是一类由D-吡喃葡萄糖单元通过α-1,4-糖苷键连接而成的环状低聚物，其空间结构呈中空圆筒形结构，因此兼具亲水的表面和疏水的空腔结构，是一种具有广泛应用前景的包埋材料，已被用于医药、食品、化妆品、材料等领域。根据构成环糊精的葡萄糖单元数目不同，可将环糊精进行分类，常见的由6、7、8个葡萄糖单元构成的环糊精分别被命名为α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精。
γ-环糊精相比于α-环糊精和β-环糊精，其溶解性最好，空腔最大，在体内可被α-淀粉酶基本完全分解，在胃肠道内即可被迅速降解吸收，代谢排出，因此γ-环糊精毒性最低，目前没有最低每日摄入量的限制，在食品、医药等领域有广泛的应用前景，主要表现为：1)由于γ-环糊精独特的空腔结构和优越的溶解性，是一种理想的包合载体，其较大的空腔结构可包合α-环糊精与β-环糊精所无法包合的大分子物质，被广泛应用于溶解度差的药物和食品添加剂的包合。2)由于γ-环糊精在体内可迅速代谢排出，其作为包合载体可以显著提高客体分子的生物利用度和稳定性，达到缓释的目的，常用于作为药物、香料、甜味剂或色素等的稳定剂以降低其刺激性，或掩盖苦涩味。3)γ-环糊精独特的空间结构，使得其作为一种有机金属骨架材料被广泛研究，以γ-环糊精作为骨架的有机金属骨架材料可用于气体吸附、物质的分离纯化、捕捉高活性中间体等，作为一种新型材料有广泛的应用前景。4)通过对γ-环糊精的结构修饰与改造，使得其被广泛应用于合成材料，可制得一系列具有高附加值的衍生物材料，可用于液晶、电子等高新技术领域。
目前全球环糊精产业市场规模达到了13亿元，且主要以β-环糊精为主，而γ-环糊精的产量仅占全球环糊精产量的5％左右，且其价格高昂，约为β-环糊精的80倍。我国国内环糊精工业起步较晚，集中于β-环糊精生产工业发展，目前尚未有成熟的γ-环糊精工业生产体系。γ-环糊精生产主要面临的问题有两方面：第一，缺少产物特异性强、稳定性高、催化效率好的γ-环糊精葡萄糖基转移酶；第二，缺少成熟高效的γ-环糊精分离纯化技术。
国内外研究者一直在尝试寻找产物特异性好，催化效率高的γ-环糊精葡萄糖基转移酶，并进行异源表达，以期大幅提高其产量，突破天然酶的分泌限制，而目前已报道的γ-环糊精葡萄糖基转移酶的来源十分有限，且普遍存在酶活低、稳定性差的问题，现有的研究大多采用大肠杆菌进行克隆表达，不利于酶在食品、医药等领域中的应用。即使是在枯草芽孢杆菌中分泌表达，分泌量也相对较低，因此，有必要建立安全、高效、高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶的食品级枯草芽孢杆菌分泌表达体系。
发明内容
为了解决当前γ-环糊精葡萄糖基转移酶表达量低、稳定性差等问题，本发明提供了一种γ-环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌***构建方法，提高γ-环糊精葡萄糖基转移酶在枯草芽孢杆菌中的表达量。
本发明提供了一种γ-环糊精葡萄糖基转移酶，编码所述γ-环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述γ-环糊精葡萄糖基转移酶是在去除编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-环糊精葡萄糖基转移酶亲本酶的信号肽序列，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种携带上述γ-环糊精葡萄糖基转移酶的基因的重组载体及含有重组载体的重组细胞。
本发明还提供了一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌表达了来源于Bacillus sp.G-825-6的γ-环糊精葡萄糖基转移酶，编码所述γ-环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillus subtilisWB600、Bacillus subtilis WB800或Bacillus subtilis 168为表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以pST质粒、pHT43质粒或pP43NMK质粒为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillus subtilisWB600为表达宿主，以pP43NMK质粒为表达载体。
本发明还提供了一种提高γ-环糊精葡萄糖基转移酶在重组枯草芽孢杆菌的表达量的方法，所述方法为去除编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-环糊精葡萄糖基转移酶亲本酶的信号肽序列，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillus subtilisWB600为表达宿主，以pP43NMK质粒为表达载体。
本发明还提供了一种酶法制备γ-环糊精的方法，所述方法为，将上述重组枯草芽孢杆菌发酵制备得到γ-环糊精葡萄糖基转移酶，添加至含有可溶性淀粉的反应体系中进行反应，制备得到γ-环糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述γ-环糊精葡萄糖基转移酶的添加量至少为：2U/g(以淀粉干基质量计)。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的反应条件为：底物浓度为5～10％(w/w)，pH 8.0～9.0，反应温度为45～55℃，搅拌速度200～300rpm，反应时间10～12h。
在本发明的一种实施方式中，所述反应底物可为：玉米淀粉、可溶性马铃薯淀粉、麦芽糊精等。
在本发明的一种实施方式中，利用发酵所得的γ-环糊精葡萄糖基转移酶或经纯化后得到的纯酶于55℃作用于5％(w/w)的可溶性淀粉制备γ-环糊精。
本发明还提供了一种全细胞制备γ-环糊精的方法，所述方法为，将上述重组枯草芽孢杆菌添加至含有可溶性淀粉的反应体系中进行反应，制备得到γ-环糊精。
在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的添加量至少为：湿菌体终浓度20g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中的反应条件为：底物浓度为5～10％(w/w)，pH 8.0～9.0，反应温度为30～40℃，水浴摇床速度200～300rpm，反应时间10～12h。
在本发明的一种实施方式中，所述反应底物可为：玉米淀粉、可溶性马铃薯淀粉、麦芽糊精等。
本发明还提供了上述重组枯草芽孢杆菌，或上述方法制备含有γ-环糊精的产品中的应用。
本发明还提供了一种制备γ-环糊精葡萄糖基转移酶的方法，所述方法为：将重组细胞或重组枯草芽孢杆菌接种至种子培养基中，制备得到种子液，将种子液按照2％～4％(v/v)的比例接种至发酵培养基中，在30℃下培养60～72h，将发酵液离心取上清液，即得γ-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液。
有益效果
(1)本发明提供了一种高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌，将来源于Bacillus sp.G-825-6的γ-环糊精葡萄糖基转移酶的表达量较原始表达***提高了7.43倍，采用枯草芽孢杆菌表达***安全、高效，可应用于食品、药品的生产中，所表达的γ-环糊精葡萄糖基转移酶粗酶液的催化活力可高达30.18U/mL，显著高于目前已报道的其他γ-环糊精葡萄糖基转移酶的异源表达水平，为γ-环糊精的工业化生产提供了可靠的酶的来源。
(2)本发明提供的γ-环糊精葡萄糖基转移酶可作用于各种淀粉及麦芽糊精为底物，且在作用于淀粉时转化率更高，直接作用于淀粉不仅解除了小分子糖对γ-环糊精生成的抑制作用，且降低了环糊精的生产成本，在不添加有机溶剂作为络合剂的条件下，转化率可达34％左右，γ-环糊精最高比例可达56％，提供了一种高转化率、低成本的γ-环糊精的生产方法，为γ-环糊精的工业生产提供指导。
(3)利用本发明提供的枯草芽孢杆菌基因工程菌作用于淀粉进行全细胞转化制备γ-环糊精，相比于优化前的枯草芽孢杆菌，其转化率与产物比例均显著提高，总转化率提高了10.32％，γ-环糊精最高占比可达61％。
附图说明
图1：携带含有γ-环糊葡萄糖基转移酶精基因序列的重组质粒的构建流程。
图2：携带含有γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因序列的不同载体的枯草芽孢杆菌粗酶液的SDS-PAGE分析，其中，M：Marker；泳道1：pST-cgt；泳道2：pHT43-cgt；泳道3：pP43NMK-cgt；泳道4：ΔSP-cgt。
图3：γ-环糊精葡萄糖基转移酶的纯酶的SDS-PAGE分析，M：Marker；泳道1：粗酶液；泳道2：两步纯化纯酶。
图4：重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶作用于5％(w/w)可溶性淀粉不同时间所得产物HPLC图谱；其中，(A)2h；(B)4h；(C)8h；(D)12h。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的载体pST公开于“直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及其酶学性质与产物合成研究，潘思惠，江南大学”中。
下述实施例中所涉及的培养基如下：
LB液体培养基：1％(w/v)胰蛋白胨，0.5％(w/v)酵母提取物，1％(w/v)氯化钠，pH7.0。
LB固体培养基：在LB液体培养基的基础上添加1.5(w/v)琼脂。
TB液体培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，KH2PO4 2.32g/L，K2HPO4·3H2O16.43g/L，甘油5g/L，pH 7.0。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶酶活测定方法如下：
(1)γ-环化活力的测定方法
γ-环化活力采用溴甲酚绿(BCG)法进行测定。取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.9mL预先用pH 9.0、20mM Tris-HCl缓冲液配制的1％麦芽糊精(DE＝4)的离心管中，预热5min后在55℃下反应10min，加入100μL 1.0M盐酸溶液终止反应，随后加入2mL 0.2M、pH4.2的柠檬酸缓冲液和100μL 5mM溴甲酚绿溶液(BCG)，室温下显色20min，于波长630nm下测定吸光值。以失活酶液作为空白。
一个酶活单位定义为在上述条件下每分钟生成1μmolγ-环糊精所需的酶量。
(2)水解活力的测定方法
水解活力采用碘法进行测定。取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有0.5mL预先用pH9.0、20mM Tris-HCl缓冲液配制的1.0％可溶性淀粉的离心管中，置于55℃反应10min后，沸水浴30min灭酶。取0.1mL灭酶后的反应液，加入5mL碘液(0.005％I2+0.05％KI)避光显色15min后，于660nm处测定吸光值。已失活酶液作为空白对照。
一个酶活单位定义为在上述条件下，相比于对照吸光值每分钟降低10％为一个酶活力单位。
(3)反应产物分析方法
环糊精的检测方法采用高效液相色谱法：将反应液沸水浴30min灭酶，离心(10,000×g，10min)、取上清液过0.22μm水系滤膜后采用高效液相色谱(HPLC)分析产物。HPLC条件为：Waters 600HPLC***(配示差折光检测器)，色谱柱Hypersil GOLDTM Amino HPLC(4.6mm×250mm)，柱温为30℃，流动相为70％(v/v)的乙腈水溶液，流速为1mL/min。
实施例1：重组枯草芽孢杆菌分泌表达***的构建
具体步骤如下：
(1)化学合成如SEQ ID NO.1所示的γ-环糊精葡萄糖基转移酶亲本酶的核苷酸序列。
(2)以SEQ ID NO.1序列为模板，进行PCR扩增，其中用于pST载体质粒的目的基因扩增引物为表1中P1/P2，用于pHT43载体质粒引物为表1中P3/P4，用于pP43NMK载体质粒为表1中P5/P6。
表1枯草芽孢杆菌表达***构建所需引物
PCR体系为：Taq Buffer(Mg2+Plus)10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Taq DNA Polymerase(1.25U/μL)1μL，加入双蒸水至50μL。PCR扩增条件为：98℃预变性3min；再进行30个循环(98℃10s，60℃15s，68℃2min)；最后68℃保温10min。
(3)使用同源重组方法将步骤(2)获得γ-环糊精葡萄糖基转移酶亲本酶的基因分别和相应的质粒载体(pST载体、pHT43载体、pP43NMK载体)连接。连接体系为：纯化的γ-环糊精葡萄糖基转移酶PCR片段(50ng/μL)1μL，纯化的质粒载体PCR片段(50ng/μL)2μL，5×CEⅡBuffer 4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O 11μL。同源重组条件为：37℃孵育30min；之后转化大肠杆菌E.coli JM109，涂布具有10μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基，挑取转化子进行测序验证，获取含有γ-环糊精葡萄糖基转移酶亲本酶基因的重组载体：pST-cgt、pHT43-cgt、pP43NMK-cgt；
将重组载体转化B.subtilis WB600，分别得到基因工程菌B.subtilis WB600/pST-cgt、B.subtilis WB600/pHT43-cgt和B.subtilis WB600/pP43NMK-cgt。
实施例2：重组枯草芽孢杆菌分泌表达***的筛选
具体步骤如下：
(1)分别将实施例1制备得到的基因工程菌B.subtilis WB600/pST-cgt、B.subtilis WB600/pHT43-cgt和B.subtilis WB600/pP43NMK-cgt单菌落接种于50mL含有5μg/mL卡那霉素或10μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养8～12h，分别制备得到种子液；
分别将上述制备得到的种子液按4％(v/v)的接种量转接至50mL含有5μg/mL卡那霉素或10μg/mL氯霉素的TB液体培养基中，30℃、200rpm下摇瓶培养60～72h，制备得到发酵液；所得发酵液在4℃、10000rpm下离心10min，取上清液，即为胞外粗酶液(如图2所示)。
(2)γ-环糊精葡萄糖基转移酶活力的测定，分别检测菌株发酵后粗酶液酶活，结果如表2所示：
表2：不同枯草芽孢杆菌表达***酶活比较
由表2可知，携带不同载体的菌株均可成功表达γ-环糊精葡萄糖基转移酶，且表达水平差异不大，采用pP43NMK作为表达载体，以B.subtilis WB600作为表达宿主，发酵制备得到的重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶活力最高，因此后续用该表达***继续优化。
实施例3：重组枯草芽孢杆菌分泌表达***的优化改造
具体步骤如下：
(1)合成γ-环糊精葡萄糖基转移酶ΔSP-cgt。
以核苷酸序列如SEQ ID NO.1的γ-环糊精葡萄糖基转移酶亲本酶序列为模板，去除信号肽片段SEQ ID NO.2，得到核苷酸序列如SEQ ID NO.3的γ-环糊精葡萄糖基转移酶ΔSP-cgt。
(2)以步骤(1)合成的γ-环糊精葡萄糖基转移酶ΔSP-cgt序列为模板，进行PCR扩增，引物为表3中P7/P8。PCR条件同实施例1。
表3：枯草芽孢杆菌表达***优化所需引物
(3)使用同源重组方法将步骤(2)得到的PCR片段与载体pP43NMK连接，具体步骤同实施例1，获取含有γ-环糊精葡萄糖基转移酶ΔSP-cgt基因的重组载体：pP43NMK-ΔSP-cgt(构建方法如图1所示)。
将重组载体转化B.subtilis WB600，最终得到基因工程菌B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔSP-cgt。
实施例4：重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶ΔSP-cgt的表达水平的测定
具体步骤如下：
(1)将实施例3制备得到的B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔSP-cgt单菌落接种于50mL含有5μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm下摇瓶培养8～12h，制备得到种子液；
将上述制备得到的种子液按4％(v/v)的接种量转接至50mL含有5μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中，30℃、200rpm下摇瓶培养60～72h，制备得到发酵液；所得发酵液在4℃、10000rpm下离心10min，取上清液，即为胞外粗酶液(如图2所示)。
(2)γ-环糊精葡萄糖基转移酶活力的测定，检测B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔSP-cgt菌株发酵后粗酶液酶活，结果显示：γ-环糊精葡萄糖基转移酶ΔSP-cgt的环化活力为30.18±0.20U/mL，水解活力为522.83±1.06U/mL。
可见经优化后的B.subtilis WB600/ΔSP-cgt菌株表达水平显著增加，粗酶活γ-环化活力为优化前对照组(B.subtilis WB600/pP43NMK-cgt)的7.4倍，粗酶活水解活力为优化前对照组(B.subtilis WB600/pP43NMK-cgt)的3.95倍。
(3)采用两步纯化法对步骤(1)制得的γ-环糊精葡萄糖基转移酶ΔSP-cgt胞外粗酶液进行纯化：
第一步：Q-HP柱阴离子交换层析
平衡液(A液，pH 7.0)为20mM Tris-HCl缓冲液，洗脱液(B液，pH 7.0)为1M NaCl+20mM Tris-HCl缓冲液。将粗酶液调节pH至7.0后，采用梯度洗脱，流速1mL/min，收集40％-70％B液洗脱液进行下一步疏水柱纯化。
第二步：Phenyl HP柱疏水层析
平衡液(A液，pH 7.0)为含30％(w/v)NH4(SO4)2的20mM Tris-HCl缓冲液，洗脱液(B液，pH 7.0)为20mM Tris-HCl缓冲液，取第一步收集的洗脱液稀释到合适浓度，流速1mL/min，采用梯度洗脱，收集70％B液洗脱液，浓缩后即为纯酶。
(4)通过SDS-PAGE蛋白电泳(结果如图3所示)和酶活测定进行鉴定，并对蛋白浓度进行测定，计算纯化效率，结果如表4所示。
表4：γ-环糊精葡萄糖基转移酶的纯化鉴定
据报道，重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶的分子量为78kDa，与SDS-PAGE估算分子量相符。
检测纯酶液的酶活，结果显示，纯化后的γ-环糊精葡萄糖基转移酶的环化反应的酶活为：67.92U/mg，水解反应的酶活为：1176.37U/mg。
实施例5：γ-环糊精的制备
以可溶性马铃薯淀粉作为底物，利用实施例4中所得纯酶(添加量以环化反应的酶活进行添加)进行γ-环糊精的生产，具体步骤如下：
(1)用pH 9.0的20mM Tris-HCl缓冲液配制质量分数为5％(w/w)的可溶性淀粉溶液100g。
(2)将步骤(1)得到的可溶性淀粉溶液倒入四口烧瓶置于55℃水浴锅中预热15min，搅拌头转速为200～300rpm，得到反应体系；
向反应体系中添加实施例4制备得到的γ-环糊精葡萄糖基转移酶纯酶液；添加量为5U/g(干基淀粉)，在55℃水浴锅中反应，分别于反应时间2h、4h、8h、12h取样，反应12h后，转移至沸水中灭酶20min，以终止反应；
其中，用等量的Tris-HCl缓冲液替换酶液，作为空白对照。
(3)待灭酶处理后，分别将取得的样品于10000rpm条件下离心10min，分别取上清液过0.22μm的水系膜去除杂质后，即可用高效液相色谱分析反应液中环糊精产物的种类和浓度。结果如表5所示，色谱分析结果如图4所示。
表5：γ-环糊精生产体系结果
nd：not detected，未检测出结果。
结果显示，反应主产物为β-环糊精和γ-环糊精，在反应前期二者比例几乎维持在1:1，γ-环糊精在反应2～4h时产物比例最高，最高占比可达56.7％，在反应末期有少量α-环糊精生成，总转化率可达约34％，但由于反应过程中未添加有机溶剂进行络合，在反应末期受产物抑制影响，γ-环糊精的比例有所下降。
实施例6：全细胞转化制备γ-环糊精
具体步骤如下：
反应体系：以pH 9.0的20mM Tris-HCl缓冲液配制质量分数为5％(w/w)的可溶性淀粉溶液100g作为底物，分别加入实施例1～3制备得到的重组枯草芽孢杆菌B.subtilisWB600/pP43NMK-cgt、B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔSP-cgt的湿菌体(湿菌体的终浓度为20g/L)，控制反应温度为30℃，反应时间12h，反应结束后离心取上清液，即为含有γ-环糊精的反应产物。
结果显示，与优化前的枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pP43NMK-cgt相比，优化后的菌体全细胞B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔSP-cgt转化率与产物比例均显著提高。
采用枯草芽孢杆菌B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔSP-cgt全细胞转化制备γ-环糊精，总转化率提高了10.32％，γ-环糊精最高占比可达61％。
但由于全细胞转化需考虑细胞状态，故反应温度并不是γ-环糊精葡萄糖基转移酶的最适反应温度，因此转化率整体低于直接用酶液反应，但从结果可以看出，优化后的B.subtilis WB600/ΔSP-cgt菌株明显有更好的γ-环糊精生产潜力。
对比例1：
具体实施方式同实施例1～2，区别在于，调整宿主菌为枯草芽孢杆菌WB800和BS168，即：采用pP43NMK为表达载体，采用枯草芽孢杆菌WB800和BS168表达重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，检测不同的宿主得到的重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶的环化反应的酶活。
结果显示，以枯草芽孢杆菌WB800为宿主时制备得到的重组γ-环糊精葡萄糖基转移酶的粗酶液酶活可达3.99U/mL，以枯草芽孢杆菌BS168为宿主时粗酶液最高酶活可达3.86U/mL。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种高产γ-环糊精葡萄糖基转移酶基因工程菌及构建方法
<130> BAA220562A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2100
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgattcgaa ggctttcttt ttcacttgtg gttttatttt tgattagctt tctagttatc 60
gttaacccag agtacacaga ggcaaatgaa aacttagaca atgttaatta tgcagaagag 120
attatttatc aaattgttac agatcgtttt tatgatggtg acccaactaa taatcctgag 180
ggagctttgt ttagtacagg ttgtctggat ttaaccaaat attgtggtgg ggactggcaa 240
gggattatcg aaaagatcga ggacgggtat ttaccggata tgggcataac ggctatttgg 300
atttcgccac caattgaaaa cgtaatggag cttcatccag gaggttttgc ttcttatcat 360
ggttattggg gcagagattt taaacgaaca aatcctgctt ttggtagttt ggcagatttt 420
tcgagattaa ttgaaacagc ccataactat gatataaaag taatcatcga ttttgttcct 480
aaccatacat ctcctgtcga tattgaggat ggagcgttat atgataatgg ccgtttagtt 540
ggtcattatt ccaatgataa tgaggattat ttttatacaa atggtggttc ggatttctcc 600
agttatgaag acagtattta tcgaaatctt tatgatttag ctagtctaaa ccagcaaaat 660
tcatttattg atcggtattt aaaagaagcg attcaaatgt ggttagattt aggaattgat 720
ggaattcgag tagatgcggt agcacatatg ccagtagggt ggcaaaagaa ttttgttagc 780
tcgatctatg attataatcc tgtctttaca tttggagaat ggtttacagg tgccagtgga 840
agtgatgagt atcattattt tattaataat agcgggatga gtgcactaga ttttcgttac 900
gcacaagtcg tccaagatgt gttaagaaat aacgatggaa cgatgtatga tttggaaaca 960
gtgttgcgag aaactgaaag cgtttacgat aaaccgcaag atcaagttac ctttatcgat 1020
aatcatgata ttgatcgttt ttctagaagt ggtcactcaa cgcgttcaac agatttaggg 1080
ttagcccttt tgttaacatc tcgaggagtc ccaacgattt attatggtac ggaaatttat 1140
atgacaggtg atggggaccc agataatcgg aaaatgatga atacatttga tcaatcgaca 1200
gttgcctatc aaatcattca acgcctttca tcactgcggc aagaaaatag ggcgattgct 1260
tatggggata cgacggaacg atggataaat gaagatgtat tcatttatga acgttcattt 1320
aatggagaat atgcacttat tgctgtgaac cgaaacttaa accgctctta tcagattagt 1380
agtttggtaa cggatatgcc ttctcaatta tatgaagatg agctgtcagg tcttttagac 1440
gggcaatcga taaccgtcgc acaagatggg tctgttcagc cctttttgtt agccccaggt 1500
gaagtaagtg tttggcaata ctcaaatggt cagaatgtag caccggaaat tggtcaaatt 1560
ggtcctccta ttgggaaacc aggagatgaa gtgaggatcg atggttcagg ttttggaaat 1620
agtatgggga atgtttcttt tgcgggttca actatgaatg tattgtcttg gaatgacgag 1680
acaattatag ccgaactacc tgtgcataat ggtggaaaaa atagtataac tgtaacgact 1740
aactcaggtg aaagcagtaa tggttatccg tttgaattat taactggttc acaaacatct 1800
gtaagatttg tcgtgaatca agccgaaacg tctgttggtg aaaatctgta cttagttggt 1860
aatgtacctg aattagggag ctgggatcct gataaagcaa ttggtcctat gtttaatcaa 1920
gttttatact catatcccac ttggtattat gatgtgagtg tacctgctaa tcaagatata 1980
gagtacaaat atattatgaa agatcaaaat ggaaatgtaa gctgggaaag tggaggcaac 2040
catatctata gaacaccaga aaattctact ggaatcgtag aagtgaatta caatcaataa 2100
<210> 2
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgattcgaa ggctttcttt ttcacttgtg gttttatttt tgattagctt tctagttatc 60
gttaacccag agtacacaga ggca 84
<210> 3
<211> 2016
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aatgaaaact tagacaatgt taattatgca gaagagatta tttatcaaat tgttacagat 60
cgtttttatg atggtgaccc aactaataat cctgagggag ctttgtttag tacaggttgt 120
ctggatttaa ccaaatattg tggtggggac tggcaaggga ttatcgaaaa gatcgaggac 180
gggtatttac cggatatggg cataacggct atttggattt cgccaccaat tgaaaacgta 240
atggagcttc atccaggagg ttttgcttct tatcatggtt attggggcag agattttaaa 300
cgaacaaatc ctgcttttgg tagtttggca gatttttcga gattaattga aacagcccat 360
aactatgata taaaagtaat catcgatttt gttcctaacc atacatctcc tgtcgatatt 420
gaggatggag cgttatatga taatggccgt ttagttggtc attattccaa tgataatgag 480
gattattttt atacaaatgg tggttcggat ttctccagtt atgaagacag tatttatcga 540
aatctttatg atttagctag tctaaaccag caaaattcat ttattgatcg gtatttaaaa 600
gaagcgattc aaatgtggtt agatttagga attgatggaa ttcgagtaga tgcggtagca 660
catatgccag tagggtggca aaagaatttt gttagctcga tctatgatta taatcctgtc 720
tttacatttg gagaatggtt tacaggtgcc agtggaagtg atgagtatca ttattttatt 780
aataatagcg ggatgagtgc actagatttt cgttacgcac aagtcgtcca agatgtgtta 840
agaaataacg atggaacgat gtatgatttg gaaacagtgt tgcgagaaac tgaaagcgtt 900
tacgataaac cgcaagatca agttaccttt atcgataatc atgatattga tcgtttttct 960
agaagtggtc actcaacgcg ttcaacagat ttagggttag cccttttgtt aacatctcga 1020
ggagtcccaa cgatttatta tggtacggaa atttatatga caggtgatgg ggacccagat 1080
aatcggaaaa tgatgaatac atttgatcaa tcgacagttg cctatcaaat cattcaacgc 1140
ctttcatcac tgcggcaaga aaatagggcg attgcttatg gggatacgac ggaacgatgg 1200
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tattatgatg tgagtgtacc tgctaatcaa gatatagagt acaaatatat tatgaaagat 1920
caaaatggaa atgtaagctg ggaaagtgga ggcaaccata tctatagaac accagaaaat 1980
tctactggaa tcgtagaagt gaattacaat caataa 2016
Claims (10)
1.一种重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌表达了来源于Bacillus sp.G-825-6的γ-环糊精葡萄糖基转移酶，编码所述γ-环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillus subtilis WB600、Bacillus subtilis WB800或Bacillus subtilis 168为表达宿主。
3.如权利要求1或2所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以pST质粒、pHT43质粒或pP43NMK质粒为表达载体。
4.一种提高γ-环糊精葡萄糖基转移酶在重组枯草芽孢杆菌的表达量的方法，其特征在于，去除编码核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的γ-环糊精葡萄糖基转移酶亲本酶的信号肽序列，所述信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌以Bacillussubtilis WB600为表达宿主，以pP43NMK质粒为表达载体。
6.一种酶法制备γ-环糊精的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌发酵制备得到γ-环糊精葡萄糖基转移酶，添加至含有淀粉或麦芽糊精的反应体系中进行反应，制备得到γ-环糊精。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述γ-环糊精葡萄糖基转移酶的添加量至少为：2U/g(以干基质量计)。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述反应体系中的反应条件为：底物浓度为5～10％(w/w)，pH8.0～9.0，反应温度为45～55℃，搅拌速度200～300rpm，反应时间10～12h。
9.一种全细胞制备γ-环糊精的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌添加至含有可溶性淀粉或麦芽糊精的反应体系中进行反应，制备得到γ-环糊精。
10.权利要求1～3任一所述的重组枯草芽孢杆菌或权利要求6～9任一所述的方法制备含有γ-环糊精的产品中的应用。
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Publications (1)
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105324488A (zh) * | 2013-06-21 | 2016-02-10 | 诺维信公司 | 芽孢杆菌属中不具有分泌信号的多肽的生产 |
| CN105339499A (zh) * | 2013-06-25 | 2016-02-17 | 诺维信公司 | 不具有信号肽的天然分泌多肽的表达 |
| CN108728392A (zh) * | 2018-05-30 | 2018-11-02 | 江南大学 | 一种可高效表达角蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌工程菌 |
-
2022
- 2022-06-08 CN CN202210644053.1A patent/CN114958701A/zh active Pending
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| KYOKO HIRANO等: "Molecular cloning and characterization of a novel gamma-CGTase from alkalophilic Bacillus sp", 《 FULL TEXT LINKS FULL TEXT PROVIDER LOGO ACTIONS SHARE PAGE NAVIGATION TITLE & AUTHORS ABSTRACT SIMILAR ARTICLES CITED BY MESH TERMS SUBSTANCES ASSOCIATED DATA RELATED INFORMATION LINKOUT - MORE RESOURCES APPL * |
| YAMAGATA,Y.: "Bacillus sp. G-825-6 tpsS, cgtS genes for transposes, gammer-cyclomaltdextrin glucanotransferase, complete cds", 《GENBANK》 * |
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