CN105339499A - 不具有信号肽的天然分泌多肽的表达 - Google Patents

不具有信号肽的天然分泌多肽的表达 Download PDF

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Abstract

本发明涉及重组生产天然分泌多肽的多种方法，这些方法包括以下步骤：提供一种微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸；在有益于该多肽表达的条件下培养该微生物宿主细胞，并且可任选地，回收该多肽，连同微生物、某些多核苷酸、表达构建体和蛋白酶取代变体。

Description

不具有信号肽的天然分泌多肽的表达
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过引用结合在此。
发明领域
本发明涉及重组生产天然分泌多肽的多种方法，这些方法包括以下步骤：提供一种微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸；在有益于该多肽表达的条件下培养该微生物宿主细胞，并且可任选地，回收该多肽，连同微生物、某些多核苷酸、表达构建体和蛋白酶取代变体。
发明背景
一种被表示为PfuS的热稳定的分泌蛋白酶分离自强烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)，并且先前已经使用包括分泌信号的表达DNA构建体生产，但PfuS蛋白酶的产率是相当低的(EP0994191A1；宝生物公司(Takara)，日本)。感兴趣的是为了可在工业上采用该酶，增加来自强烈火球菌的热稳定的PfuS蛋白酶的表达产率，使得它可以足够的量和可接受的生产经济产生。
从嗜热网团菌(Dictyoglomusthermophilum)中鉴定并克隆了一种被表示为XynB的热稳定的分泌木聚糖酶，使该酶重组表达于大肠杆菌中。XynB的成熟N末端定位在23-氨基酸前导肽的下游，如由SignalP信号肽分析软件预测的，并且受以其他细菌家族11种木聚糖酶执行的多序列分析结果的支持。该XynB前导肽使得该酶对大肠杆菌具有毒性。该XynB酶表达于大肠杆菌中(不具有前导肽)，并且通过细胞裂解回收(莫里斯(Morris)DD等人1998，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)64(5):1759-65)。该XynB酶还重组表达于枯草芽孢杆菌宿主中，具有其天然分泌信号，但仅以非常低的产率(张(Zhang)等人；应用生物化学与生物技术(ApplBiochemBiotechnol)(2010)160:1484-1495)。感兴趣的是为了可在工业上采用该酶，增加来自嗜热网团菌的热稳定的XynB木聚糖酶的表达产率，使得它可以足够的量和可接受的生产经济产生。
芽孢杆菌属宿主细胞已经被表征为工业制造各种感兴趣多肽的主力，主要是因为它们主动分泌具有所谓信号肽的多肽。信号肽是一种小多肽，典型的是约20-30个氨基酸，该小多肽以与待分泌多肽的N-末端的转录和翻译融合体表达。它指导该融合的多肽进入适当配备的宿主细胞的分泌机构中，于是该融合的多肽裂解，这时不具有其信号肽的现已成熟的感兴趣多肽被分泌进入周围培养液中，该信号肽保留在细胞中并且被降解。
芽孢杆菌属中重组生产的感兴趣多肽的分泌能够使得不用必须进行细胞裂解步骤而直接从培养液中比较容易地回收多肽。在芽孢杆菌属中，只有肯定会从细胞输出至生长培养基中的多肽是天然具有信号肽的。
细胞中大多数的多肽不是肯定会输出的，而是相反原本在细胞内、周质、膜结合的等等。此类天然非分泌多肽通常被认为是难以产生的，因为它们需要从宿主细胞内回收，这通常需要麻烦的细胞裂解步骤，导致回收过程具有挑战性，这进而是天然分泌酶对于工业制造是优选的原因。
发明概述
为了研究该PfuS蛋白酶和该XynB木聚糖酶(无天然C-末端纤维素结合结构域)在芽孢杆菌属中的表达水平，这两种酶被表达为具有众所周知的有效的芽抱杆菌属信号肽的翻译N-末端融合多肽。然而，无论用什么实验方法这些酶在芽孢杆菌属宿主中还是在没有任何信号肽的情况下表达。
与预期相反，当这些酶在没有任何分泌信号肽的情况下表达时，我们发现这两种酶在上清液中的产率比较高，如在此的实例中证明的。这是一个高度令人惊讶的结果并且具有经济意义，因为它证明PfuS样蛋白酶和XynB样木聚糖酶可以在芽孢杆菌属中产生(不具有信号肽)，并且相比于采用了信号肽的情况具有更高的产率。这些酶可以成功地从培养液中直接回收而不需要昂贵的细胞裂解步骤。
因此，在第一方面，本发明涉及重组生产天然分泌多肽的多种方法，这些方法包括以下步骤：
a)提供一种微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸；
b)在有益于该多肽表达的条件下培养该微生物宿主细胞，并且可任选地，
回收该多肽。
在第二方面，本发明涉及一种重组微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸。
本发明的第三方面涉及编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种分离的合成多核苷酸，其中所述多肽是具有如下氨基酸序列的一种蛋白酶，该氨基酸序列与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同；或是具有如下氨基酸序列的一种木聚糖酶，该氨基酸序列与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
在第四方面，本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求11至14中任一项所定义的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至提供其在所选择的宿主细胞中的表达的控制序列。
本发明的第五方面涉及一种分离的合成多肽，所述多肽是：
a)一种蛋白酶，该蛋白酶具有、包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:6的位置1至413所示的蛋白酶至少80％相同，优选与SEQIDNO:6的位置1至413所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同，其中该蛋白酶在对应于SEQIDNO:6的位置369的位置处包括一个氨基酸取代；优选地在对应于SEQIDNO:6的位置369的位置处的甘氨酸被取代为天冬氨酸：G369D；或
b)一种木聚糖酶，该木聚糖酶具有、包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:15的位置1至204所示的蛋白酶至少80％相同，优选与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同，并且包括一个甲硫氨酸作为其第一N-末端氨基酸。
本发明的第六方面涉及一种分离的合成多肽，所述多肽是：
a)一种蛋白酶，该蛋白酶具有如下氨基酸序列或者包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列示于SEQIDNO:8的位置1至413；或
b)一种木聚糖酶，该木聚糖酶具有如下氨基酸序列或者包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列示于SEQIDNO:15的位置1至204，并且包括一个甲硫氨酸作为其第一N-末端氨基酸。
最终方面涉及一种组合物，该组合物包括如第五或第六方面定义的一种蛋白酶多肽。
附图简述
图1显示来自实例4的pJA4156质粒的质粒图。
图2显示来自实例4的pHyGe396质粒的质粒图。
定义
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种可替代形式中的任一种。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由一个开放阅读框架决定，该开放阅读框架从一个起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以一个终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是一种基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码一种多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意指线性或环状DNA分子，该分子包括编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列相连接。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不出现的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然发生的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然发生的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过增加该物质相对于与其天然相关的其他组分的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组体产量；编码该物质的基因的多拷贝；以及使用比编码该物质的基因天然相关的启动子强的启动子)。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短等之后处于其最终形式的多肽。本领域已知，一个宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达一种多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生一种不同的成熟多肽(例如，具有一个不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的一种核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以一种本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
全长多肽：术语“全长多肽”在此被定义为具有生物学活性的多肽的前体形式，其中该前体包含信号肽，并且可替代地还包含前肽，其中在从细胞分泌时，该信号肽被裂解，并且可替代地该前肽也被裂解，从而产生具有生物学活性的多肽。
信号肽：术语“信号肽”在此被定义为以符合阅读框的方式连接(融合)至具有生物学活性的多肽的氨基末端且指导该多肽进入细胞的分泌途径的肽。前肽可以存在于信号肽与多肽氨基末端之间(参见下文前原肽定义)。
前肽：术语“前肽”是以符合阅读框的方式连接(融合)至多肽的氨基末端的氨基酸序列，其中生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化裂解或自身催化裂解来自多肽原的前肽而转化为成熟的活性多肽。
前原肽：术语“前原肽”在此被定义为存在于多肽的氨基末端的信号肽和前肽，其中前肽以符合阅读框的方式连接(或融合)至多肽的氨基末端，而信号肽区以符合阅读框的方式连接(或融合)至前肽区的氨基末端。
信号肽编码序列：术语“信号肽编码序列”在此被定义为编码信号肽的多核苷酸。
前肽编码序列：术语“前肽编码序列”在此被定义为编码前肽的多核苷酸。
前原肽编码序列：术语“前原肽编码序列”在此被定义为编码前原肽的多核苷酸。
野生型信号肽：术语“野生型信号肽”表示由天然存在的微生物(如在自然界中发现的酵母或丝状真菌)表达的信号肽。
亲本信号肽：如在此使用的术语“亲本信号肽”意指将要进行修饰(例如，一处或多处取代、一处或多处***、一处或多处缺失和/或一处或多处截短)以产生本发明的信号肽变体的信号肽。该术语还指变体与之进行比较和比对的信号肽。亲本可以是天然存在的(野生型)信号肽，或者它甚至可以是其通过任何合适手段制备的变体。例如，亲本信号肽可以是天然存在的信号肽的变体，其氨基酸序列已被修饰或改变。亲本信号肽也可以是等位基因变体，即由占据相同染色体基因座的多核苷酸序列的两种或更多种可替代形式中的任一种所编码的信号肽。
野生型前原肽：术语“野生型前原肽”表示由天然存在的微生物(如在自然界中发现的酵母或丝状真菌)表达的前原肽。
亲本前原肽：如在此使用的术语“亲本前原肽”意指将要进行修饰(例如，一处或多处取代、一处或多处***、一处或多处缺失和/或一处或多处截短)以产生本发明的前原肽变体的前原肽。该术语还指变体与之进行比较和比对的前原肽。亲本可以是天然存在的(野生型)前原肽，或者它甚至可以是其通过任何合适手段制备的变体。例如，亲本前原肽可以是天然存在的前原肽的变体，其氨基酸序列已被修饰或改变。亲本前原肽也可以是等位基因变体，即由占据相同染色体基因座的多核苷酸序列的两种或更多种可替代形式中的任一种所编码的前原肽。
变体：术语“变体”在此被定义为包含一处或多处(若干处)改变(如在肽或多肽的一个或多个(若干个)特定位置处包含一个或多个(若干个)特定氨基酸残基的取代、***、缺失和/或截短)的肽或多肽。
变体信号肽：术语“变体信号肽”在此被定义为亲本信号肽的如下信号肽，其中变体信号肽包含一处或多处(若干处)改变，如在信号肽的一个或多个(若干个)特定位置处包含一个或多个(若干个)特定氨基酸残基的取代、***、缺失和/或截短。
变体前原肽：术语“变体前原肽”在此被定义为亲本前原肽的如下前原肽，其中变体前原肽包含一处或多处(若干处)改变，如在前原肽的一个或多个(若干个)特定位置处包含一个或多个(若干个)特定氨基酸残基的取代、***、缺失和/或截短。可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列一致性”来描述。出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(TheEuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite)，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(TrendsGenet.)16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，见上文)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，见上文)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且计算如下：
(一致的脱氧核糖核酸核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：术语“变体”意指具有酶活性的且相比于其亲本野生型或参照的氨基酸序列在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即取代、***、和/或缺失)的多肽。取代意指用一个不同氨基酸置换占用一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且***意指在邻接并且紧随占据一个位置的氨基酸之后添加一个氨基酸。
成熟多肽的变体可以在一个或多个(例如，若干个)位置处包括取代、缺失和/或***。引入成熟多肽中的氨基酸取代、缺失和/或***的数目可以多达10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。这些氨基酸变化可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；小缺失，典型地为1-30个氨基酸；小的氨基-末端的或羧基末端的延伸，例如氨基-末端甲硫氨酸残基；高达20-25个残基的小连接肽；或通过改变净电荷或另一功能，例如聚组氨酸段、抗原表位或结合域，有利于纯化的小的延伸。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变特异性活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979在蛋白质(TheProteins)，学术出版社(AcademicPress)，纽约中描述。常见的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、以及Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH，等等。
可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(坎宁汉(Cunningham)和威尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如，德弗斯(deVos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生化学会联合会快报(FEBSLett.)309:59-64。还可以从与相关多肽的比对推断鉴定必需氨基酸。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或***并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO95/17413；或WO95/22625披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，洛曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO92/06204)以及区域定向诱变(德比什尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；内尔(Ner)等人，1988，DNA7:127)。
可以结合诱变/改组方法与高通量自动化筛选方法来检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(内斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(NatureBiotechnology)17:893-896)。编码活性多肽的诱变的DNA分子可以回收自宿主细胞，并且使用本领域的标准方法对其进行迅速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
融合多肽：感兴趣多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一多肽的多核苷酸融合到本发明的多核苷酸而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，并包括连接编码多肽的编码序列，这样使得它们在框内并且使得融合多肽的表达处于相同的一个或多个启动子和终止子的控制下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBOJ.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以在两个多肽之间进一步包括一个裂解位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被裂解，从而释放出这两个多肽。裂解位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工业微生物与生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯维特娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯穆森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-拉西(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure，Function，andGenetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，药物发现世界(DrugDiscoveryWorld)4:35-48。
发明详述
多核苷酸
本发明涉及分离的合成多核苷酸，这些多核苷酸编码不具有分泌信号的天然分泌蛋白酶或木聚糖酶，所述多肽是一种蛋白酶，该蛋白酶具有、包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同；优选与SEQIDNO:8的位置1至413所示的蛋白酶至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同；或所述多肽是一种木聚糖酶，该木聚糖酶具有、包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同；优选与SEQIDNO:15的位置1至204所示的蛋白酶至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
在一个优选的实施例中，本发明的多核苷酸具有、包括如下核苷酸序列或由其组成，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同；优选与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同；更优选地，本发明的多核苷酸具有、包括如下核苷酸序列或由其组成，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同；仍更优选地与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
在另一个优选的实施例中，本发明的多核苷酸具有、包括如下核苷酸序列或由其组成，该核苷酸序列与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA，或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:AGuidetoMethodsandApplication)，学术出版社(AcademicPress)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。这些多核苷酸可以由火球菌属菌株或相关有机体克隆，并且因此，例如可以是该多核苷酸的多肽编码区的等位基因或种变体。
编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成实质上类似于该多肽的多肽可能是必需的。术语“实质上类似”于该多肽是指该多肽的非天然存在的形式。这些多肽可能以某种工程化方式而不同于从其天然来源分离的多肽，例如在比活性、热稳定性、最适pH等方面不同的变体。这些变体可以基于以SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列(例如其子序列)形式呈现的多核苷酸，和/或通过引入不会改变该多肽的氨基酸序列，但对应于预定用于产生该酶的宿主生物体的密码子使用的核苷酸取代，或通过引入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸取代来构建。对于核苷酸取代的一般描述，参见例如福德(Ford)等人，1991，蛋白表达与纯化(ProteinExpressionandPurification)2:95-107。
多核苷酸的来源
编码本发明的蛋白酶的多核苷酸可获得自任何属的微生物。出于本发明的目的，如在此结合给定来源使用的术语“从……获得”应当指，由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由已经***了来自该来源的多核苷酸的一种菌株产生的。
该多核苷酸可以是细菌多核苷酸。例如，该多核苷酸可以是编码具有蛋白酶活性的分泌多肽的***多核苷酸，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、或链霉菌属(Streptomyces)多核苷酸；或革兰氏阴性细菌多核苷酸，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)多核苷酸。
在一个方面，本发明的多核苷酸来自一种极端嗜热生物厌氧细菌，如来自网团菌门，包括嗜热网团菌。
在另一个方面，该多核苷酸是嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillusfirmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacilluslautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)多核苷酸。
在另一个方面，该多核苷酸是似马链球菌(Streptococcusequisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、***链球菌(Streptococcusuberis)、或马链球菌兽瘟亚种(Streptococcusequisubsp.Zooepidemicus)多核苷酸。
在另一个方面，该多核苷酸是不产色链霉菌(Streptomycesachromogenes)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomycescoelicolor)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)或浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)多核苷酸。
在另一个方面，该多核苷酸是火球菌属多核苷酸；优选强烈火球菌多核苷酸。
该多核苷酸可以是真菌多核苷酸。例如，该多核苷酸可以是酵母多核苷酸，如假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)多肽；或一种丝状真菌多肽，例如枝顶孢属(Acremonium)、伞菌属(Agaricus)、链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、葡萄座腔菌属(Botryospaeria)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、毛喙壳属(Chaetomidium)、金孢子菌属(Chrysosporium)、麦角菌属(Claviceps)、旋孢腔菌属(Cochliobolus)、鬼伞属(Coprinopsis)、乳白蚁属(Coptotermes)、棒囊壳属(Corynascus)、隐丛赤壳菌属(Cryphonectria)、隐球菌属(Cryptococcus)、色二孢属(Diplodia)、黑耳属(Exidia)、线黑粉酵母属(Filibasidium)、镰孢属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、全鞭毛虫属(Holomastigotoides)、腐质霉属(Humicola)、耙齿菌属(Irpex)、香菇属(Lentinula)、小腔球菌属(Leptospaeria)、梨孢菌属(Magnaporthe)、黑果菌属(Melanocarpus)、亚灰树花菌属(Meripilus)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉菌属(Penicillium)、平革菌属(Phanerochaete)、瘤胃壶菌属(Piromyces)、Poitrasia、假黑盘菌属(Pseudoplectania)、假披发虫属(Pseudotrichonympha)、根毛霉菌属(Rhizomucor)、裂褶菌属(Schizophyllum)、柱顶孢属(Scytalidium)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳霉属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、木霉属(Trichoderma)、长毛盘菌属(Trichophaea)、轮枝孢属(Verticillium)、小包脚菇属(Volvariella)、或炭角菌属(Xylaria)多核苷酸。
在另一个方面，该多核苷酸是卡尔酵母(Saccharomycescarlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、糖化酵母(Saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomycesdouglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyceskluyveri)、诺地酵母(Saccharomycesnorbensis)、或卵形酵母(Saccharomycesoviformis)多核苷酸。
在另一个方面，该多核苷酸是解纤维枝顶孢霉(Acremoniumcellulolyticus)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)、黑曲霉(Aspergillusniger)、米曲霉(Aspergillusoryzae)、狭边金孢子菌(Chrysosporiuminops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporiumkeratinophilum)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporiummerdarium)、毡金孢子菌(Chrysosporiumpannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporiumtropicum)、带纹金孢子菌(Chrysosporiumzonatum)、杆孢状镰孢(Fusariumbactridioides)、禾谷镰孢(Fusariumcerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、黄色镰孢菌(Fusariumculmorum)、禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusariumgraminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusariumnegundi)、尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢菌(Fusariumroseum)、接骨木镰孢(Fusariumsambucinum)、肤色镰孢(Fusariumsarcochroum)、拟枝孢镰孢菌(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢菌(Fusariumsulphureum)、圆镰孢(Fusariumtorulosum)、拟丝孢镰孢菌(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢菌(Fusariumvenenatum)、灰腐质霉(Humicolagrisea)、特异腐质霉(Humicolainsolens)、疏棉状腐质霉(Humicolalanuginosa)、白囊耙齿菌(Irpexlacteus)、米黑毛霉(Mucormiehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)、粗糙脉孢菌(Neurosporacrassa)、绳状青霉菌(Penicilliumfuniculosum)、产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaetechrysosporium)、无色梭孢壳(Thielaviaachromatica)、成层梭孢壳菌(Thielaviaalbomyces)、白毛梭孢壳(Thielaviaalbopilosa)、澳洲梭孢壳(Thielaviaaustraleinsis)、粪梭孢壳(Thielaviafimeti)、小孢梭孢壳(Thielaviamicrospora)、卵孢梭孢壳(Thielaviaovispora)、秘鲁梭孢壳(Thielaviaperuviana)、毛梭孢壳(Thielaviasetosa)、瘤孢梭孢壳(Thielaviaspededonium)、耐热梭孢壳(Thielaviasubthermophila)、土生梭孢壳(Thielaviaterrestris)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、康宁木霉(Trichodermakoningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(Trichodermareesei)、或绿色木霉(Trichodermaviride)多核苷酸。
将理解的是，对于以上提到的物种而言，本发明涵盖完全状态和不完全状态(perfectandimperfectstates)二者、以及其他分类学等效物，例如无性型，而不管它们已知的物种名称是什么。本领域的普通技术人员将容易地识别适当等效物的身份。
这些物种的菌株可以容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究菌种保藏中心北方地区研究中心(NRRL)。
可以从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等等)分离的微生物或直接从自然材料(例如，土壤、堆肥、水等等)获得的DNA样品鉴定和获得该多核苷酸。用于从自然生活环境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过在另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库中类似地进行筛选来获得一种多核苷酸。一旦检测到一种多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员已知的技术分离或克隆该多核苷酸(参见例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
核酸构建体
本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包括可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，这些控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。
该多核苷酸可以按各种方式操纵以提供该多肽的表达。取决于表达载体，在其***载体以前操纵多核苷酸可以是希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是一个启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的一种多核苷酸。该启动子包含转录控制序列，这些序列介导了该多肽的表达。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型及杂合型启动子，并且可以是由编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。在一些方面，该启动子是异源启动子。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(MolecularMicrobiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)、以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(ScientificAmerican)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Usefulproteinsfromrecombinantbacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文。串联启动子的实例披露在WO99/43835中。
控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的一种转录终止子。该终止子可操作地连接到编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在该宿主细胞中起作用的任何终止子都可以用于本发明中。
用于细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)以及大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)的基因获得。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(JournalofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端处的前肽的一个前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化裂解或自身催化裂解来自多肽原的前肽而转化为一种活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
还可能希望地是添加调节序列，这些调节序列相对于宿主细胞的生长来调节多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些序列。原核***中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子***。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。
表达载体
本发明还涉及包括本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生一个重组表达载体，这一重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处***或取代编码该变体的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列是位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其能够方便地进行重组DNA程序，并且能够引起多核苷酸的表达。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是一种线性的或闭合的环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样一种载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同含有待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的可选择性标记。选择性标记是一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。
载体优选含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合的元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝***到宿主细胞中以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含一个与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生，其中所述宿主细胞能够产生本发明的多肽。
将包括多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是细菌的，例如它可以是原核的，优选任何***或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属以及脲原体属。
原核宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
该宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
该宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(NucleicAcidsRes.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，凯特(Catt)和乔力克(Jollick)，1991，微生物学(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)65:3800-3804)、或者接合(参见例如，克莱威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
在本发明的第二方面的一个优选的实施例中，一种重组微生物宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸。
优选地，该微生物宿主细胞是原核宿主细胞，优选革兰氏阳性宿主细胞，更优选芽孢杆菌属宿主细胞，并且最优选地，该宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。
优选的是该多肽是同源或异源酶，优选地，该酶选自下组，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地，该酶是一种α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
此外，优选的是该多肽是：
a)一种蛋白酶多肽，该多肽包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同；或
b)一种木聚糖酶多肽，该多肽包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
仍然更优选地，该多肽是：
a)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种蛋白酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同；或优选地与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同，或
b)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种木聚糖酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
生产方法
本发明还涉及重组生产天然分泌多肽的多种方法，这些方法包括以下步骤：
a)提供一种微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸；
b)在有益于该多肽表达的条件下培养该微生物宿主细胞，并且可任选地，
回收该多肽。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过在适合的培养基中和在允许表达和/或分离该多肽的条件下，进行摇瓶培养，或者在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续，分批，分批补料，或固态发酵)来培养细胞。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中直接回收多肽。如果多肽不分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对该多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一个方面，回收包括该多肽的发酵液。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化该多肽以获得基本上纯的多肽，这些程序包括但不限于：色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，蛋白质纯化(ProteinPurification)，詹森(Janson)和赖登(Ryden)编辑，VCH出版社(VCHPublishers)，纽约，1989)。
在一个替代性方面，没有回收该多肽，而是将表达该多肽的本发明的宿主细胞用作该多肽的来源。
优选地，该微生物是原核宿主细胞，优选革兰氏阳性宿主细胞，更优选芽孢杆菌属宿主细胞，并且最优选地，该宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。
优选的是该多肽是同源或异源酶，优选地，该酶选自下组，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地，该酶是一种α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
在第一方面的一种优选方法中，该多肽是：
a)一种蛋白酶多肽，该多肽包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同，或
b)一种木聚糖酶多肽，该多肽包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
在第一方面的另一个优选的实施例中，该多肽是：
a)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种蛋白酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同；或优选与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同；或
b)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种木聚糖酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少80％相同，优选与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同。
具有蛋白酶活性的多肽
在一个优选的实施例中，该分离的合成蛋白酶多肽具有、包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:6的位置1至413所示的蛋白酶至少80％相同，优选与SEQIDNO:6的位置1至413所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同，其中该蛋白酶在对应于SEQIDNO:6的位置369的位置处包括一个氨基酸取代；优选地在对应于SEQIDNO:6的位置369的位置处的甘氨酸被取代为天冬氨酸：G369D。
在一个实施例中，本发明涉及一种分离的合成蛋白酶多肽，该多肽具有、包括SEQIDNO:8的位置1至413所示的氨基酸序列或其具有蛋白酶活性的片段，或由其组成。
在一个优选的实施例中，本发明的分离的合成蛋白酶多肽是SEQIDNO:6的位置1至413所示的成熟PfuS蛋白酶的一种取代变体，其中在位置369处的甘氨酸被取代为天冬氨酸：G369D。
具有木聚糖酶活性的多肽
在一个优选的实施例中，本发明的分离的合成多肽是一种木聚糖酶，该木聚糖酶具有、包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列与SEQIDNO:15的位置1至204所示的蛋白酶至少80％相同，优选与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％相同，并且包括一个甲硫氨酸作为其第一N-末端氨基酸。
在一个实施例中，本发明涉及一种分离的合成木聚糖酶多肽，该多肽具有、包括SEQIDNO:15的位置1至204所示的氨基酸序列或其具有木聚糖酶活性的片段，或由其组成，并且包括一个甲硫氨酸作为其第一N-末端氨基酸。
在一个优选的实施例中，本发明的分离的合成蛋白酶多肽是SEQIDNO:6的位置1至413所示的成熟PfuS蛋白酶的一种取代变体，其中在位置369处的甘氨酸被取代为天冬氨酸：G369D。
酶组合物
本发明还涉及包括本发明的一种特定的蛋白酶多肽的组合物。优选地，这些组合物富含这种多肽。术语“富集”指示该组合物的蛋白酶活性已经增加，例如，以至少1.1的一个富集因子。
这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，这些组合物可以包括多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，若干种)酶，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地，该酶是一种α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
适合于本发明的蛋白酶的另外的组合物描述于WO2013/082486，将其内容通过引用结合在此。
这些组合物可根据本领域已知的方法制备并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法稳定这些组合物。
在一个优选的实施例中，本发明涉及一种组合物，该组合物包括如在以上命名为“具有蛋白酶活性的多肽”的部分中定义的一种蛋白酶多肽。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包括本发明的多肽的一种发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是含有一种或多种有机酸、杀死的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物生长至饱和，在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞进行酶的表达)并且分泌到细胞培养基中时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括一种第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及一种第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述酸中的两种或更多种的混合物。
在一个方面，该组合物包含一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀死的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀死的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含一种防腐剂和/或抗微生物(例如抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵终止时得到的发酵物质的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白质合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶、和杀死的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶组分，例如杀死的细胞、细胞碎片、培养基组分、和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
可以通过WO90/15861或WO2010/096673所述的方法产生本发明的全培养液配制品和细胞组合物。
通过说明提供了以下实例，并且并不旨在使限制本发明。
实例
实例1来自强烈火球菌ATCC43587/DSM3638的PfuS蛋白酶的克隆和表达
来自强烈火球菌的蛋白酶PfuS已描述为一种热稳定的蛋白酶(应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，56:1992-1998(1990)；FEMS微生物学通讯(FEMSMicrobiol.Letters)，71:17-20(1990)；普通微生物学杂志(J.Gen.Microbiol.)，137:1193-1199(1991))。PfuS蛋白酶的重组表达先前已在枯草芽孢杆菌宿主生物体中显示出，但表达水平非常低(EP0994191A1；宝生物公司(日本))。
在此我们描述了一种新的生产PfuS蛋白酶的方法，该方法使用一种缺乏PfuS天然信号肽或任何其他信号肽的重组克隆和表达构建体。当此构建体在芽孢杆菌属宿主细胞中表达时，获得了出人意料高的酶产率。
编码天然PfuS蛋白酶的DNA序列示于SEQIDNO:1并且该PfuS蛋白酶的氨基酸序列示于SEQIDNO:2(UNIPROT：Q8U0C9)。
基于PfuS的氨基酸序列设计了一个合成编码序列。优化该合成基因中密码子的使用以用于枯草芽孢杆菌表达，如之前在WO12025577中所述的。
在标准条件下使用以下引物对从合成DNA通过PCR进行DNA扩增：
正向引物：aaaggagaggataaagaatggcacctgagaagaaa(SEQIDNO:3)
反向引物：gcgtttttttattgattaacgcgtttatggtgatgagccaggc(SEQIDNO:4)
通过琼脂糖凝胶电泳判断，得到的PCR片段具有预期的1631bp大小。在第二PCR反应(PCR2)进行之前，将PCR片段进行纯化。在此PCR2反应中，PCR1片段的5’端融合并且可操作地连接到一种含有披露于WO9943835中的三启动子的DNA片段。一种编码氯霉素乙酰转移酶的DNA片段被融合到该PCR1产物的3’端。氯霉素乙酰转移酶基因被用作抗生素标记物(如描述于狄代丽柯森(Diderichsen)等人，1993，质粒(Plasmid)30:312-315中)。获得的预期的最终编码PfuS的DNA片段示于SEQIDNO:5并且预期编码氨基酸序列示于SEQIDNO:6。
对于上述PCR反应来说可替代地，包括所有调节元件的完整DNA片段可以通过商业供应商作为合成的DNA订购。
将SEQIDNO:5的表达构建体通过同源重组整合到枯草芽孢杆菌基因组，如描述于WO99/43835中的。表达宿主是一种枯草芽孢杆菌菌株，其具有以下表型：不形成孢子(spo-)、生物素营养缺陷型(biol-)、蛋白酶阴性(NprE-和AprE-)、α-淀粉酶阴性(AmyE-)、不产生表面活性素(SrfC-)。
在含有氯霉素作为选择标记的TB琼脂板上选择一个被表示为MTBO0411-1的枯草芽孢杆菌氯霉素抗性表达克隆。将该克隆在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyerflask)中的旋转摇床上的液体培养基中培养，每个锥形瓶包含补充有34mg/l氯霉素的100ml基于酪蛋白的培养基。
采用DNA测序来验证来自所选克隆的多核苷酸***并且在SEQIDNO:5的位置1463处鉴定一个随机突变，此处的序列已由G变为A(G1463A)。***在克隆MTBO0411-1中的多核苷酸表达构建体的实际DNA序列(包括在位置1463处的突变的核苷酸)示于SEQIDNO:7。推导的编码变体PfuS氨基酸序列示于SEQIDNO:8，包括由G1463A核苷酸突变导致的在成熟多肽的位置369处的单个氨基酸取代：G369D。
将该MTBO0411-1克隆在37℃下培养2至5天。用于随后的纯化或酶蛋白活性测量，将该无细胞培养上清液在70℃下热处理20分钟，随后离心以使来自该表达宿主的内源蛋白酶失活并且去除变性蛋白。通过SDS-PAGE分析确定PfuS蛋白酶的成功表达(参见实例2)。
为了比较我们还将PfuS蛋白表达构建体放在一起，该构建体包括一种功能性芽孢杆菌属分泌信号。包括一种氨基-末端信号肽的PfuS蛋白酶如以上概述的进行表达，除了使用以下引物对PCR扩增DNA片段之外：
正向引物：tcatcgatcgcatcggctgcacctgagaagaaagttg(SEQIDNO:9)
反向引物：ccaaggccggttttttatgttttatggtgatgagccaggc(SEQIDNO:10)
得到的表达载体构建体由与以上以符合阅读框的方式融合到编码克劳氏芽孢杆菌aprH蛋白酶信号肽的DNA相同的编码序列组成：
atgaaaaaaccgctggggaaaattgtcgcaagcaccgcactactcatttctgttgcttttagttcatcgatcgcatcggctgcacctagg(SEQIDNO:11)，
其中位置1-81的核苷酸编码AprH信号并且核苷酸82-90从克隆过程留下来)。
如上进行克隆和转化并且选择枯草芽孢杆菌表达克隆，其被表示为MTBO0411-2，携带SEQIDNO:12中所示的pfuS基因片段，该片段编码在SEQIDNO:13中所示的推导的氨基酸序列。
实例2.蛋白酶活性和酶产率的检测
通过在固化的卢里亚贝尔塔尼(LuriaBertani)琼脂培养基(包含1％的酪蛋白(溶解的脱脂奶粉))中打的孔中添加10μL经热处理的样品测量来自实例1的两个所选择克隆的原始培养液溶液连同培养液上清液的蛋白酶活性。在70℃下孵育18h之后，孔周围的透明区指示蛋白水解活性。
PfuS基因缺陷的枯草芽孢杆菌对照宿主菌株不产生透明区，而来自实例1a的携带不具有信号肽的PfuS构建体的枯草芽孢杆菌克隆在2天的发酵后已经显示10mm半径的明显透明区。在2天的发酵后，来自实例1的具有信号肽的PfuS基因构建体的透明区与对照枯草芽孢杆菌宿主菌株的情况相比没有显著不同(约1mm)。在摇瓶中仅发酵5天后，我们能够从表达具有AprH信号肽的PfuS蛋白酶的克隆检测到5mm的显著透明。
连同来自SDS-PAGE分析的结果，我们得出结论，在没有任何信号肽情况下的表达比有来自AprH蛋白酶的另外熟知且有效的信号肽(在发酵2天后不会导致任何显著表达)的情况下的表达实现了高得多的PfuS蛋白酶表达水平。
表1.透明区半径以mm计。
使用无细胞发酵培养上清液通过SDS-PAGE分析变体PfuS蛋白酶的成功表达。大约40kDa的明显蛋白条带指示PfuS成功表达到该培养基中。枯草芽孢杆菌细胞的裂解在发酵期间或之后未被积极诱导，这对于工业生产目的是有利的。
所有重组表达的PfuS酶样品的SDS-PAGE分析指示，在实例1中没有分泌信号的基因构建体的表达水平比先前报道的显著更高(参见例如，EP0994191A1；宝生物公司，日本)，并且也显著高于在以上实例1中有分泌信号的构建体的情况，这类似于先前在EP0994191A1(宝生物公司，日本)中报道的酶产率，即，在13mg-60mg/L培养物的范围内。
通过差示量热法，在50mM乙酸盐缓冲液(pH5)中，在200K/h的扫描速率下，重组纯化的变体PfuS蛋白酶(样品IDU43PS)显示出103℃的熔解温度。
重组PfuS的成熟氨基末端通过N-末端aa测序被确定为AELEGLD，并且所测量的完整质量是43066.4道尔顿，这是根据所描述的示于SEQIDNO:8的引入了点突变：G369D的PfuS的成熟变体肽预期的，该变体肽具有43,061Da的计算质量；与示于SEQIDNO:6的野生型成熟PfuS多肽的43,003道尔顿的计算质量截然不同。
还通过EP0994191A1(宝生物公司，日本)采用的方法，通过测量在使用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA(西格玛(Sigma))作为底物的酶水解反应中产生的对硝基苯胺的量，以光谱法确定蛋白酶PfuS的活性。简言之，将一种酶制剂适当地稀释以进行足够的测量(即用双蒸水500倍和1000倍的稀释无细胞培养上清液)。将50微升的在100mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)中的1mMSuc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA溶液添加到50微升的稀释样品溶液中。然后，允许该反应在95℃下发生30分钟。通过在冰上冷却而终止该反应后，测量405nm处的吸光度，以计算产生的对硝基苯胺的量。将一个单位的酶定义为在95℃下每分钟产生1微摩尔对硝基苯胺的酶量。基于所测量的酶活性计算在培养上清液或细胞中表达的酶蛋白的量，假定比活性为9.5U/mg蛋白酶PfuS蛋白，如US20040888588中说明的。在410nm，pH7.5下，对-NA的吸收系数是8800M-1cm-1，并且在本实例的反应中(在pH7.0下，在405nm处测量)我们使用同一系数。使用比尔-兰伯特(Beer-Lambert)定律，在1cm比色杯中吸收值1代表113,6微摩尔对-NA。
由来自500倍和1000倍样品稀释的吸收值计算的酶表达产率(表2中示出)与来自透明区半径测量的估计和通过SDS-PAGE的估计非常相关。具有AprH信号肽的构建体的表达产率在2mg-26mg/L的范围内并且不具有信号肽的构建体的表达产率要高>5倍(108至167mg/L)。
表2.遵循比尔-兰伯特定律测量的吸收值(来自3个独立实验的平均值)和计算的酶表达产率。
实例3.蛋白酶表征
Suc-AAPF-pNA蛋白酶活性测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mMHEPES，100mMCHES，100mMCABS，1mMCaCl2，150mMKCl，0.01％TritonX-100，pH9.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％TritonX-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μlpNA底物(50mg，溶解在1.0mlDMSO中，并进一步地用0.01％TritonX-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
蛋白酶纯化
将培养液离心(20000xg，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。上清液通过耐洁(Nalgene)0.2μm过滤装置过滤以便除去剩余芽孢杆菌宿主细胞。将固体(NH4)2SO4添加到0.2μm滤液中至0.85M终浓度，并且将经盐调节的滤液施加到苯基-琼脂糖FF(高取代(highsub))柱(来自GE医疗公司(GEHealthcare))上，该柱以100mMH3BO3、10mMMES、2mMCaCl2、0.9M(NH4)2SO4(pH6.0)平衡。在用平衡缓冲液洗涤柱之后，将蛋白酶用线性梯度在平衡缓冲液与100mMH3BO3、10mMMES、2mMCaCl2(pH6.0)+25％(v/v)2-丙醇之间经五个柱体积进行洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且合并峰级分。将来自苯基-琼脂糖FF柱的池转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗公司)上的10mMTris/HCl、1mMCaCl2(pH9.0)。将该G25滤液施加到Q-琼脂糖FF柱(来自GE医疗公司)上，该柱以10mMTris/HCl、1mMCaCl2(pH9.0)平衡。在将柱用平衡缓冲液洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)经五个柱体积进行洗脱。将来自柱的级分针对蛋白酶活性进行分析(使用在pH9下的Suc-AAPF-pNA测定法)，并且通过SDS-PAGE对活性级分进行分析。将级分(在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的仅见到一条带)合并为纯化的制剂并且用于另外的实验。
通过埃德曼降解确定N-末端序列为：AELEGLD。如通过SDS-PAGE所确定的相对分子量大约是Mr＝41kDa。通过完整分子量分析所确定的分子量是43,062.4Da。这很好地对应基于SEQIDNO:8中所示的成熟序列计算的分子量43,061.3Da。
实例4.嗜热网团菌木聚糖酶的克隆和表达
地衣芽孢杆菌宿主菌株含有spoIIAC、apr-L、aprL、mprL、cypX、sacB、bprAB、epr、vpr以及wprA基因上的缺失，这些基因分别编码孢子形成转录因子σF、碱性蛋白酶、glu-特异性蛋白酶(C-组分)、细胞色素P450样酶CypX、果聚糖蔗糖酶、杆菌肽酶(bacillopeptidase)F(两个基因)、两种细胞外丝氨酸蛋白酶和细胞壁相关蛋白酶WprA。编码一种10kDa背景蛋白的forD基因的表达还通过其核糖体结合位点处的突变而被降低或消除。此外，归因于编码基因的失活或消除，地衣芽孢杆菌宿主菌株不能产生α-淀粉酶、纤维素酶以及β-半乳糖苷酶。
地衣芽孢杆菌菌株宿主已经通过将来自乳球菌(lactococcal)噬菌体TP901-1的人工启动子、标记基因和attB整合酶识别位点***在两个染色体基因座amyL和gntP中以充当表达盒的噬菌体整合酶辅助位点特异性整合中的整合位点而得到了进一步修饰(如披露于WO2006/042548)。
在此使用人工嗜热网团菌木聚糖酶表达盒的噬菌体整合酶辅助位点特异性整合构建两个菌株，其中该编码序列已经进行密码子优化以用于在地衣芽孢杆菌中表达。
编码成熟木聚糖酶xynDt(示于SEQIDNO:15)的密码子优化的基因(示于SEQIDNO:14)被克隆到一种适合的噬菌体整合酶辅助整合载体中，该载体下游侧翼为随后删掉的attP位点，并且上游侧翼为随后删掉的同源区，由此制成质粒pJA4156(参见图1；SEQIDNO:16)。将载体转化到宿主菌株中，并且在所得菌株JA4182中在如以上概述的两个基因座中建立木聚糖酶表达盒。
编码与来源于地衣芽孢杆菌amyL基因且已知在地衣芽孢杆菌中有效的人工信号肽(示于SEQIDNO:18)(SPamyL)翻译融合的成熟木聚糖酶xynDt的密码子优化的基因(示于SEQIDNO:17)被克隆到一种适合的噬菌体整合酶辅助整合载体中，该载体下游侧翼为随后删掉的attP位点，并且上游侧翼为随后删掉的同源区，由此制成质粒pHyGe396(参见图2；SEQIDNO:19)。将载体转化到宿主菌株中，并且在所得菌株HYGE435中在如以上概述的两个基因座中建立木聚糖酶表达盒。
整合到每个菌株中的这两个整合位点的表达盒仅编码天然二结构域嗜热网团菌木聚糖酶的成熟木聚糖酶部分，既不包括其天然C-末端纤维素结合结构域，也不包括其天然信号肽(或前导序列)。然而，整合到该HyGe435菌株中的木聚糖酶表达盒的确包含来源于地衣芽孢杆菌amyL基因且已知在地衣芽孢杆菌中有效的人工信号肽(SPamyL)，该信号肽与成熟木聚糖酶编码序列翻译融合。相比之下，整合到该JA4182菌株中的木聚糖酶表达盒没有信号肽编码序列；翻译起始密码子ATG简单地添加至该成熟木聚糖酶的编码序列的5’-端。
·JA4182(amyL::xynDt；gntP::xynDt)
·HYGE435(amyL::SPamyL_xynDt；gntP::SPamyL_xynDt；ipsA-；prsA+)
此外，该HyGe435菌株具有ispA细胞内蛋白酶编码基因的缺失并且它携带一种另外的整合prsA分子伴侣编码基因。ispA缺失和prsA基因两者都预期可稍微增加HyGe435菌株中的木聚糖酶产率。
实例5.用于嗜热网团菌木聚糖酶活性的活性测量的测定
该方法被用于测量在发酵样品中的木聚糖酶活性。该反应以两个步骤进行：
1)木聚糖酶水解小麦***糖基木聚糖(pH6.0，37℃)以释放还原碳水化合物。
2)通过添加一种碱性试剂终止反应，该试剂含有PAHBAH和铋(pH>10，37℃)，其与产生能够在405nM处测量的比色读数的还原糖复合。产生的颜色与存在于该样品中的木聚糖酶活性成比例。
对发酵样品进行称重、制备稀释物并且在分析机器人上进行该测定。在读板仪上测量样品，例如，集成型分子设备(MolecularDevice)SOFTMAX读板仪。
缓冲液和试剂
Aces缓冲液：
用NaOH将pH调节至6.0
2xMES缓冲液：
用NaOH将pH调节至6.0
PAHBAH：
1％w/v***糖：
***糖-MES底物缓冲液：
用2xMES缓冲液混合等份的1％***糖，其体积依据测定要求。
测定程序：
标准品的制备：
所使用的标准品是一种具有规定浓度(在以下测量中，它是4.03mg/ml)的木聚糖酶样品。将标准品在使用前解冻到环境温度。将标准品稀释至1μg/ml的起始稀释度。
将标准品如下稀释(一式四份地)。
ACES缓冲液(μl) 1μg/ml稀释的标准品(μl) 标准品浓度(μg/ml)
0 200 1
50 175 0.075
100 150 0.05
150 100 0.025
175 50 0.0125
200 0 0
所有测定步骤在具有集成型天平的定制(贝克曼库尔特(BeckmanCoulter))液体处理***、Span8移液***和(贝克曼库尔特)读板仪上进行。
样品制备：
1)如果该完全培养液样品是极厚且极粘的，则将样品通过在24孔板(具有钢珠轴承(6mm直径))中在900rpm下振荡15分钟进行初始制备。在此时间之后，使用宽孔移液管将它们转移到机器人天平并称重，以给出在ACES缓冲液中大约10倍的初始稀释(随后在最终计算中校正实际重量/初始稀释)。典型地，这个初始步骤是将200μl培养液添加至1800μlACES缓冲液中。如果样品被接收为上清液或可以顺畅地移液，则该初始稀释是作为简单的液体到液体移液步骤进行的。
2)然后将称重的样品一式三份地分配并且在96孔微量滴定板中根据其预测活性以ACES缓冲液分板稀释。根据其预测活性，最终的2个稀释板落入标准曲线内。
3)在如上所述的最终的2个稀释板中的每一个上产生标准曲线。
4)对于最终的2个稀释板中的每一个，转移20ul的每一样品和标准品到110ul的***糖-MES底物缓冲液中并且立即混合(900rpm持续30秒，机器人定轨振荡器)。
5)将板密封并在37℃下在封闭的孵育器中伴随振荡(600rpm，IKASchüttlerMTS4)孵育30分钟。
6)添加65ul的PAHBAH至这些板，在此时间之后，密封它们并且再在37℃下伴随振荡(600rpm，IKASchüttlerMTS4)孵育15分钟。
7)在读板仪上于405nM处测量这些板的吸光度并且从生成的所附标准曲线推测活性。
实例6.地衣芽孢杆菌菌株JA4182和HYGE435的分批补料发酵
地衣芽孢杆菌菌株JA4182和HYGE435的分批补料发酵依如下所述进行。通过标准方法对所有培养基进行灭菌。除非另外描述，使用自来水。在下面的配方中提及的成分浓度是任何接种之前的浓度。
第一接种物培养基：
SSB5琼脂：10g/l大豆蛋白胨；蔗糖10g/l；磷酸二氢钾2g/l；磷酸氢二钠，2H2O5g/l；维生素(二氯化硫胺11,4mg/l；核黄素0,97mg/l；烟酸7,7mg/l；D-泛酸钙9,5mg/l；盐酸吡哆醛1,9mg/l；D-生物素0,37mg/l；叶酸0,97mg/l)；微量金属(MnSO4，H2O9,8mg/l；FeSO4，7H2O39,25mg/l；CuSO4，5H2O3,9mg/l；ZnCl23,9mg/l)；25g/l琼脂，用4NNaOH调节至pH7,3-7,4。
转移缓冲液：
M-9缓冲液(去离子水被用于制备)：磷酸氢二钠，2H2O8.8g/l；磷酸二氢钾3g/l；氯化钠4g/l；硫酸镁，7H2O0.2g/l。
接种物摇瓶培养基(浓度是接种之前的浓度)：
PRK-50：110g/l大豆粒；磷酸氢二钠，2H2O5g/l；在灭菌之前，使用NaOH/H3PO4将pH调节至8.0。
组成培养基(浓度是接种之前的浓度)：
胰蛋白胨(来自Difco的酪蛋白水解物)30g/l；硫酸镁，7H2O4g/l；磷酸氢二钾7g/l；磷酸氢二钠，2H2O7g/l；硫酸二铵4g/l；柠檬酸0.78g/l；维生素(二氯化硫胺34.2mg/l；核黄素2,9mg/l；烟酸23mg/l；D-泛酸钙28,5mg/l；盐酸吡哆醛5.7mg/l；D-生物素1,1mg/l；叶酸2,9mg/l)；微量金属(MnSO4，H2O39.2mg/l；FeSO4，7H2O157mg/l；CuSO4，5H2O15.6mg/l；ZnCl215.6mg/l)；消泡剂(SB2121)1.25ml/l；在灭菌之前，使用NaOH/H3PO4将pH调节至6.0。
补料培养基：
蔗糖708g/l；
用于接种物步骤的程序：
首先，在37℃下，使菌株在SSB5琼脂斜面上生长1天。然后，使用M-9缓冲液洗涤琼脂，并且在650nm处测量所得细胞悬浮液的光密度(OD)。使用OD(650nm)xml细胞悬浮液＝0.1的接种物来接种接种物摇瓶(PRK-50)。将摇瓶在37℃下、在300rpm处培养20hr。
通过用来自该摇瓶的生长培养物接种主发酵罐来开始主发酵罐(发酵器)中的发酵。接种体积是组成培养基的11％(对于720ml组成培养基而言，是80ml)。
发酵罐：
使用配备以下项的标准实验室发酵罐：温度控制***，使用氨水和磷酸的pH控制，用于贯穿整个发酵过程测量>20％氧饱和度的溶氧电极。
发酵参数：
温度：41℃
使用氨水和磷酸将pH保持在6.8与7.2之间。
对照：6.8(氨水)；7.2磷酸。
通气：1.5升/min/kg培养液重量。
搅拌：1350rpm。
补料策略：
0hr。接种之后，0.05g/min/kg初始培养液
8hr。接种之后，0.156g/min/kg初始培养液
结束：接种之后，0.156g/min/kg初始培养液
实验设置：
发酵运行三天。
结果：
在第3天在上清液中测定相对木聚糖酶活性：
菌株 活性 注释
JA4182 446％ 无信号肽
HyGe435 100％ 信号肽
与预期相反，来自地衣芽孢杆菌宿主菌株JA4182的木聚糖酶产率高得多，无论如何在没有任何信号肽的情况下表达该酶。当在枯草芽孢杆菌中表达全长嗜热网团菌木聚糖酶编码序列(包括其天然信号)时，所观察到的产率比先前报道的高1000倍以上，其在回收后仅约1.4mg/l(参见张(Zhang)等人；应用生物化学与生物技术(ApplBiochemBiotechnol)(2010)160:1484-1495的表1)。
优选实施例
[1]一种分离的合成多核苷酸，该多核苷酸编码不具有分泌信号的蛋白酶多肽，所述蛋白酶多肽具有与SEQIDNO:8的位置1至413所示的蛋白酶至少80％相同的氨基酸序列。
[2]根据实施例1所述的多核苷酸，其中所编码的蛋白酶多肽包括与SEQIDNO:8的位置1至413所示的蛋白酶至少80％相同的氨基酸序列或由其组成。
[3]根据实施例1或2所述的多核苷酸，该多核苷酸具有如下核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同；优选与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同。
[4]根据实施例1-3中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸包括如下核苷酸序列或由其组成，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同；优选与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同。
[5]一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如实施例1至4中任一项所定义的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至提供其在所选择的宿主细胞中的表达的控制序列。
[6]一种原核宿主细胞，该原核宿主细胞被转化有或包括如实施例1至4所定义的多核苷酸、或如实施例5所定义的核酸构建体或表达载体，其中所述宿主细胞能够产生该蛋白酶多肽。
[7]如实施例6所述的宿主细胞，该宿主细胞为芽孢杆菌属宿主细胞。
[8]如实施例7所述的宿主细胞，其中该芽孢杆菌属宿主细胞选自以下各项的组：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。
[9]如实施例6至8中任一项所述的宿主细胞，其中该蛋白酶多肽包括与SEQIDNO:8的位置1至413所示的蛋白酶至少80％相同的氨基酸序列或由其组成。
[10]一种生产蛋白酶多肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)在有益于该蛋白酶多肽的表达的条件下培养如实施例6至9中任一项所定义的宿主细胞；并且，可任选地
b)回收该蛋白酶。
[11]一种分离的合成蛋白酶多肽，该多肽具有SEQIDNO:8的位置1至413所示的氨基酸序列。
[12]如实施例11所述的多肽，该多肽包括SEQIDNO:8的位置1至413所示的氨基酸序列或由其组成。
[13]如实施例11或12所述的多肽，该多肽是与SEQIDNO:6的位置1至413所示的蛋白酶具有至少80％序列一致性的一种分离的蛋白酶，其中该蛋白酶在位置369处包括一个取代。
[14]如实施例11或12所述的多肽，该多肽是SEQIDNO:6的位置1至413所示的成熟PfuS蛋白酶的一种取代变体，其中在位置369处的甘氨酸被取代为天冬氨酸：G369D。
[15]一种组合物，该组合物包括如实施例11至14中任一项所定义的蛋白酶多肽。

Claims (18)

1.一种重组生产天然分泌多肽的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供一种微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸；
b)在有益于该多肽表达的条件下培养该微生物宿主细胞并且，可任选地，
c)回收该多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中该微生物是原核宿主细胞，优选革兰氏阳性宿主细胞，更优选芽孢杆菌属宿主细胞，并且最优选地，该宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该多肽是一种同源或异源酶，优选地该酶选自下组，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地，该酶是一种α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该多肽是：
a)一种蛋白酶多肽，该多肽包括与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同的氨基酸序列或由其组成，或
b)一种木聚糖酶多肽，该多肽包括与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少80％相同的氨基酸序列或由其组成。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该多肽是：
a)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种蛋白酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同；优选与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同；或
b)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种木聚糖酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少80％相同。
6.一种重组微生物宿主细胞，该宿主细胞包括编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种外源多核苷酸。
7.根据权利要求6所述的微生物，该微生物是原核宿主细胞，优选革兰氏阳性宿主细胞，更优选芽孢杆菌属宿主细胞，并且最优选地，该宿主细胞选自下组，该组由以下各项组成：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌。
8.根据权利要求6或7所述的微生物，其中该多肽是一种同源或异源酶，优选地该酶选自下组，该组由以下各项组成：水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶；更优选地，该酶是一种α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、天冬酰胺酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、绿色荧光蛋白、葡聚糖转移酶、葡糖淀粉酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的微生物，其中该多肽是：
a)一种蛋白酶多肽，该多肽包括与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同的氨基酸序列或由其组成；或
b)一种木聚糖酶多肽，该多肽包括与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少80％相同的氨基酸序列或由其组成。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的微生物，其中该多肽是：
a)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种蛋白酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同；优选与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同，或
b)由包括如下核苷酸序列或由其组成的多核苷酸编码的一种木聚糖酶，该核苷酸序列与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少80％相同。
11.编码不具有翻译融合信号肽的天然分泌多肽的一种分离的合成多核苷酸，其中所述多肽是具有与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同的氨基酸序列的一种蛋白酶；或是具有与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少80％相同的氨基酸序列的一种木聚糖酶。
12.根据权利要求11所述的多核苷酸，其中所编码的多肽是包括与SEQIDNO:8的位置1至413所示的序列至少80％相同的氨基酸序列或由其组成的一种蛋白酶；或是包括与SEQIDNO:15的位置1至204所示的序列至少80％相同的氨基酸序列或由其组成的一种木聚糖酶。
13.根据权利要求11或12所述的多核苷酸，该多核苷酸具有如下核苷酸序列，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同；与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同；或与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少80％相同。
14.根据权利要求11-13中任一项所述的多核苷酸，该多核苷酸包括如下核苷酸序列或由其组成，该核苷酸序列与SEQIDNO:7的位置1至1569所示的序列至少80％相同；与SEQIDNO:7的位置331至1569所示的序列至少80％相同；或与SEQIDNO:14的位置1至612所示的序列至少80％相同。
15.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包括如权利要求11至14中任一项所定义的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至提供其在所选择的宿主细胞中的表达的控制序列。
16.一种分离的合成多肽，所述多肽是：
a)一种蛋白酶，该蛋白酶具有、包括与SEQIDNO:6的位置1至413所示的蛋白酶至少80％相同的氨基酸序列或由其组成，其中该蛋白酶在对应于SEQIDNO:6的位置369的位置处包括一个氨基酸取代；优选地在对应于SEQIDNO:6的位置369的位置处的甘氨酸被取代为天冬氨酸：G369D；或
b)一种木聚糖酶，该木聚糖酶具有、包括与SEQIDNO:15的位置1至204所示的蛋白酶至少80％相同的氨基酸序列或由其组成，并且包括一个甲硫氨酸作为其第一N末端-氨基酸。
17.一种分离的合成多肽，所述多肽是：
a)一种蛋白酶，该蛋白酶具有如下氨基酸序列或者包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列示于SEQIDNO:8的位置1至413；或
b)一种木聚糖酶，该木聚糖酶具有如下氨基酸序列或者包括如下氨基酸序列或由其组成，该氨基酸序列示于SEQIDNO:15的位置1至204，并且包括一个甲硫氨酸作为其第一N-末端氨基酸。
18.一种组合物，该组合物包括如在权利要求16或17中所定义的蛋白酶多肽。
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