CN112708567B

CN112708567B - 一种果糖基转移酶及其高产菌株

Info

Publication number: CN112708567B
Application number: CN202110103848.7A
Authority: CN
Inventors: 王正祥; 路福平; 牛丹丹; 田康明
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Senda (Tianjin) Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2022-06-07
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112708567A

Abstract

本发明属于微生物发酵和酶工程领域，具体涉及一种果糖基转移酶、其高产菌株的构建和果糖基转移酶的高效发酵制备。本发明分离获得一株具有较好合成果糖基转移酶的黑曲霉菌株，确定其果糖基转移酶及其编码基因；进一步通过无痕基因交换方法，用黑曲霉自身的果糖基转移酶编码基因替换其自身的果糖基水解酶编码基因，获得果糖基转移酶黑曲霉新菌种，并建立果糖基转移酶的发酵生产技术，进行低聚果糖的酶法制备的应用性能分析。

Description

一种果糖基转移酶及其高产菌株

技术领域：

本发明属于微生物发酵和酶工程领域，具体涉及一种果糖基转移酶、其高产菌株的构建和果糖基转移酶的高效发酵制备。

背景技术：

低聚果糖(Fructo-oligosaccharides，FOS)，是功能性低聚糖的重要组成，在食品、饲料、日化、土壤改良、配方奶粉、乳制品、功能性产品等中具有重要应用价值。以蔗糖为原料，在果糖基转移酶的催化下生产低聚果糖，是目前工业规模下生产FOS的主要方法。

果糖基转移酶隶属于糖苷水解酶家族GH32，其酶分子成员包含细菌、真菌和植物等来源的外切果聚糖水解酶、内切果聚糖水解酶、果聚糖酶、蔗糖酶、果糖苷酶等。其中部分生物来源的果糖苷酶在水解蔗糖分子的同时，会将果糖基转移到另一个蔗糖分子果糖基上，形成以蔗糖分子为基础的低聚糖，这一酶分子又被称为果糖基转移酶，工业上以蔗糖为原料酶法生产FOS，也正是基于这一原理。因此，获得具有高转苷活性的果糖基转移酶，是FOS工业生产的重要环节。

具有工业应用价值的果糖基转移酶多数来源于米曲霉或黑曲霉，我国企业生产FOS的主要酶源为通过黑曲霉发酵自行制备获得。黑曲霉生产的果糖基转移酶多为胞内表达，并且含有较高水平的蔗糖水解酶，需要在发酵结束后通过细胞破碎释放果糖基转移酶、并需要进一步纯化或固定化，才能满足FOS的工业生产(如：中国专利：ZL01128345.9)；也有利用菌体或全发酵液为催化剂在厌氧发酵条件下作用蔗糖用于低聚果糖制备(如：中国专利：ZL200910018453.6)。上述方法获得的酶制剂皆含有较高比例的水解酶活，会对底物蔗糖和产物低聚果糖产生水解作用，形成不利于低聚果糖产品生产的葡萄糖和果糖，会降低蔗糖到FOS的转化率，也会增加了后续FOS产品的分离纯化的复杂性和产品的收得率。

通过对黑曲霉CBS 513.88基因组分析与功能鉴定，Yuan等(Yuan XL,etal.Database mining and transcriptional analysis of genes encoding inulin-modifying enzymes of Aspergillus niger.Microbiology,2006,152:3061-73)发现，此黑曲霉菌株中包含5个与果糖基水解相关的酶分子，其中经过实验确认功能的酶分子分别是蔗糖酶(SucA)、外切菊粉酶(InuE)和内切菊粉酶(InuA/InuB)，另外两个酶分子(SucB和SucC)未能确定其功能，也未能解析出黑曲霉中相关的果糖基转移酶。此研究结果从另一个侧面进一步说明了采用野生型黑曲霉制备的酶制剂会含有蔗糖酶和菊粉酶酶活，影响蔗糖为原料生产低聚果糖的转化率和低聚果糖的组成。

本发明采用自基因克隆和无痕基因替换等技术，在明确黑曲霉中果糖基转移酶及其编码基因后，进一步将催化属性最优的黑曲霉果糖基转移酶编码基因通过基因定点整合，替代黑曲霉基因组中的果糖基水解活性酶编码基因，构建获得高产高转苷活性果糖基转移酶的黑曲霉新菌种，并通过发酵工艺建立与优化获得了果糖基转移酶高效制备方法。上述发明未见报道。

发明内容：

本发明的目的是，获得一株具有较高单一果糖基转移酶活性的黑曲霉生产菌株，用于果糖基转移酶的高效制备并应用于低聚果糖的酶法制备，由此显著提高果糖基转移酶的发酵制备水平和酶制剂的质量并显著提高果糖基转移酶在低聚果糖生产中的转化率和低聚果糖的产品质量。

为了实现上述目的，本发明分离获得一株具有较好合成果糖基转移酶的黑曲霉菌株，确定其果糖基转移酶及其编码基因；进一步通过无痕基因交换方法，用黑曲霉自身的果糖基转移酶编码基因替换其自身的果糖基水解酶编码基因，获得果糖基转移酶黑曲霉新菌种，并建立果糖基转移酶的发酵生产技术，进行低聚果糖的酶法制备的应用性能分析。

本发明提供的技术方案之一，是一株具有能够较好合成果糖基转移酶的黑曲霉(Aspergillus niger)An-F308，是通过自然分离培养与鉴定获得，具有合成果糖基转移酶的能力，该菌株已于2020年11月26日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号为CGMCC NO.21028；

本发明提供的技术方案之二，是由黑曲霉An-F308合成的果糖基转移酶，该酶具有SEQID NO.2所示的氨基酸序列；

进一步地，所述果糖基转移酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

本发明提供的技术方案之三，是一株果糖基转移酶高产黑曲霉An-fru3III，所述菌株是在黑曲霉An-F308的基础上，采用SEQ ID NO.1所示的果糖基转移酶替换基因组中的2个果糖基水解酶编码基因(inuA和inuE)获得的；

进一步地，采用无痕替换技术进行替换；

进一步地，所述inuA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

进一步地，所述inuE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明提供的技术方案之四，是黑曲霉An-fru3III在生产果糖基转移酶中的应用，特别是采用发酵发生产果糖基转移酶的方法，具体如下：

所述的发酵工艺为：按1-10％的接种量，发酵温度25～36℃，发酵过程中维持溶氧为5～60％，发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为4～6，发酵时间为60～150h；

发酵培养基组成为：3～20％淀粉糊精，1～8％豆饼粉，0～5％玉米浆，0～3％硫酸铵，0.01～2％氯化钙，其余为水；

在此条件下，菌种An-fru3III的果糖基转移酶的产酶水平达4218-4588U/mL(果糖基转移酶酶活)，发酵酶液中仅含有极微量(3-10U/mL)的果糖基水解酶活。

本发明提供的技术方案之五，是SEQ ID NO.2所示的果糖基转移酶在生产低聚果糖中的应用；

当蔗糖浓度400～1200g/L，pH 4.5-6.5，反应温度55～75℃，加酶量3～30U/g蔗糖，反应时间8～36h时所制得的低聚果糖的糖浆中，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的转化率可达到65％以上。

有益效果：

1、本发明所构建的黑曲霉果糖基转移酶生产菌株，摇瓶条件下的产酶水平较出发菌种提高了1.4倍，并且仅产生极微量(3-10U/mL)的果糖基水解酶活；

2、本发明提供的果糖基转移酶具有较高的果糖基转移酶活性，仅含有极微量的果糖基水解酶活，能极大的提高以蔗糖为原料生产低聚果糖的转化率和低聚果糖的组成；

3、运用本发明获得的果糖基转移酶，所制备的低聚果糖的糖浆中，蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖的转化率可高达65％，并且可以大幅简化低聚果糖的后期脱色、纯化、精制与浓缩工序，大幅节约FOS的生产成本。

附图说明：

图1果糖基转移酶Fru3催化蔗糖形成低聚果糖的糖谱特征；

图2重组质粒pAUR-kan的物理图谱；

图3重组质粒pA::cfru3的物理图谱；

图4重组质粒pE::cfru3的物理图谱；

图5黑曲霉An-fru3III发酵生产果糖基转移酶的产酶进程。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

如无特别说明，本发明所涉及的主要实验方法如下：

(1)产果糖基转移酶菌株的筛选与鉴定

按照实验室常规方法进行(诸葛健王正祥.工业微生物实验技术手册，1994)。自然样本为从广西等地甘蔗种植园、果园采集获得的土样。将土样用无菌生理盐水适当稀释后，涂布YPD(1％酵母膏、2％葡萄糖、2％蛋白胨)平板(补加200mg/L青霉素)，28℃培养2～3天，生长出的菌落在YPS培养基(1％酵母膏、2％蔗糖、2％蛋白胨)中培养1～2天，取发酵上清用HPLC法测定其中低聚果糖的组成与含量(HPLC检测方法见下)，将获得具有较高生成低聚果糖的菌株进行保藏并采用分子鉴定方法(陈源源.基于分子标识的工业微生物资源快捷分类与鉴定,江南大学博士学位论文，2012)进行鉴定。

(2)黑曲霉总RNA的分离纯化

黑曲霉An-F308接种于YPD培养基(2％酵母膏、2％葡萄糖、2％蛋白胨)中，32℃培养16h，收集菌体在-70℃下冻结后，于干冰中研磨，再采用Thermofisher公司的

PlusRNA纯化试剂盒回收总RNA。

(3)果糖基转移酶及其相关酶的基因克隆

将纯化获得的黑曲霉总RNA，采用逆转录酶试剂盒

ReverseTranscriptase AssayKit合成cDNA，以此为模板，分别使用Fru1F/Fru1R；Fru2F/Fru2R；Fru3F/Fru3R；Fru4F/Fru4R和Fru5F/Fru5R引物(表1)，对果糖基酶的cDNA进行特异性扩增，获得相应的产物。

表1本发明所用引物的核苷酸序列

(4)果糖基转移酶及其相关酶表达与功能鉴定

按照Pichia操作手册，将上述获得的果糖基转移酶及其相关酶的编码基因克隆入pPIC9k获得相应的重组质粒，将重组质粒线性化后电击转化的方式在毕赤酵母GS115中获得重组菌，按1％接种量分别接入50mL BMGY，30℃，180r/min培养至OD₆₀₀＝2-6(约16-18h)离心，用1/5-1/10原培养基体积的BMMY重悬使菌体的OD₆₀₀＝1进行培养，0.5％甲醇诱导酶的表达，对所制备获得的酶液进行酶活测定与分析。

(5)果糖基转移酶酶活测定

酶活定义为：以酶促反应后体系中生成的蔗果三糖不超过总糖含量的10％为准，在上述反应条件下，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需的酶量定义为一个酶活力单位。

按国标GB/T 23528-2009低聚果糖中描述的果糖基转移酶活力测定方法进行。基本方法是：将不同稀释度的酶液，加入到100g/L蔗糖溶液(溶于0.2mol/L醋酸缓冲液，pH5.5)中，45℃下振荡反应60min，沸水浴放置10min终止反应；离心取上清，用HPLC法进行糖谱分析。

(6)果糖基水解酶活测定

一个果糖基水解酶单位定义为，在检测条件下(pH 4.5，温度50℃)，每分钟水解产生1μmol葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活力单位(U)。将底物由蔗糖替换为低聚果糖、果聚糖(菊粉)，相同条件下检测待测酶的果糖基水解活性(也即底物为蔗糖，和/或低聚果糖，和/或果聚糖(菊粉))。

将800μL 6.75％(w/v)蔗糖或低聚果糖或果聚糖(菊粉)液置于50℃条件下预热5min，取200μL酶液加入其中，50℃下准确反应30min，85℃加热10min灭活酶，冷却至室温。使用生物传感仪测定葡萄糖含量。

(7)果糖基转移酶高产菌株的构建

分子克隆、DNA连接、转化、核苷酸序列测定、限制性图谱、黑曲霉基因组的制备、PCR基因扩增等按实验室常规方法进行。黑曲霉的遗传转化，按课题组前期建立的方法用电转化方法进行(李松,王正祥.黑曲霉电转化条件的研究.微生物学杂志，2010,30(1):11-15)。

重组质粒pAUR-kan的构建，采用如下步骤进行。用EcoRI和PstI酶切质粒pRS305K(Taxis C,KnopM.System of centromeric,episomal,and integrative vectors basedon drug resistance markers for Saccharomyces cerevisiae.Biotechniques,2006:40,73-78)和用PfuDNA聚合酶补平，胶回收1.25kb的Kan(G418)抗性编码基因的序列片段，然后与用PstI酶切去除金担子素(Aba)抗性编码基因并补平的质粒pAUR135(日本TaKaRa公司)进行连接，获得重组质粒pAUR-kan。

基因无痕替换重组质粒的构建，按照如下方法进行。以黑曲霉An-F308基因组DNA为模板，PinuA-1/PinuA-2为引物PCR扩增出inuA的启动子区(PinuA)，TinuA-1/TinuA-2为引物扩增出终止子及其下游序列(TiunA)，再通过PCR扩增技术将所获得的PinuA和TiunA片段与BoxA-1/BoxA-2为引物扩增获得的cfru3(SEQ ID NO.1所示)进行融合，采用引物为PinuA-1/TinuA-2，获得PinuA-cfru3-TiunA片段，将此片段克隆入pAUR-kan的SmaI位点，获得重组质粒pA::cfru3。同理获得inuE基因的替换重组质粒pE::cfru3。

重组表达质粒对黑曲霉的转化和阳性转化子筛选，按照TaKaRa公司pAUR135使用说明进行。将所构建的重组质粒pA::cfru3和pE::cfru3依次转化入黑曲霉An-F308菌株中并进行筛选，筛选先在含0.5g/L G418平板上进行，再在含有1％半乳糖的平板上进行，获得cfru3依次替换黑曲霉基因组中inuA和inuE的重组菌种。新菌株的产酶水平采用摇瓶发酵和15L发酵罐中进行发酵评价。

(8)果糖基转移酶发酵生产试验

摇瓶发酵：在250mL三角瓶中进行，装液量为25～50mL，培养基为PDA(200g马铃薯，20g葡萄糖，1000mL水)，起始pH4.5～5.5，发酵温度为28～32℃，转速为180～250r/min。

发酵罐发酵：发酵培养基组成为：3～20％淀粉糊精，1～8％豆饼粉，0～5％玉米浆，0～3％硫酸铵，0.01～2％氯化钙，其余为水；1-10％的接种量，发酵温度25～36℃，通风0.1～1.2vvm，发酵过程中维持溶氧为5～60％，发酵过程中用硫酸或氨水控制pH为4～6，发酵时间为60～150h。发酵定时取样检测分析酶活水平，发酵结束后，离心/过滤除去菌体即为果糖基转移酶酶液。

(9)低聚果糖的制备与分析

在30L反应罐中进行。蔗糖浓度400～1200g/L，pH 4.5-6.5，反应温度55～75℃，加酶量3～30U/g蔗糖，反应时间8～36h；反应物的糖谱分析采用HPLC进行，以葡萄糖、果糖、蔗糖(Sigma公司产品)、蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖(Wako公司)为标准参照。HPLC色谱条件是：Agilent 1200高效液相色谱仪(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)，分析柱为Prevail^TM Carbohydrate ES 5u糖柱(5.0μm,250×4.6mm)，柱温30℃；检测器为AlltechELSD 2000s(Grace Davison Discovery Sciences，Deerfield，IL，USA)，漂移管温度90℃，气体流量2.2L/min；流动相为：乙腈:水＝65:35(v/v)，流速为1mL/min。依据国标GB/T23528-2009要求，计算低聚果糖质量中的核心指标蔗果三糖(GF2)、蔗果四糖(GF3)和蔗果五糖(GF4)占总糖质量的百分含量(％)。

以下结合实施例进一步说明本发明的内容。

实施例1：产果糖基转移酶黑曲霉菌株的分离与鉴定

从广西等甘蔗种植园、果园等采集的土壤样本中，分离出一株具有作用于蔗糖形成低聚果糖能力的丝状真菌，经过鉴定为黑曲霉，命名为黑曲霉An-F308。

进一步采用cDNA克隆术，采用引物(表1)从黑曲霉An-F308的cDNA中克隆出果糖基酶活相关的基因cfru1，cfru2，cfru3，cfru4和cfru5；将此克隆入pPIC9k，并遗传转化入P.pastoris GS115，获得相应的重组酵母PP-fru1，PP-fru2，PP-fru3，PP-fru4和PP-fru5；进一步采用摇瓶发酵方法，用上述5株重组酵母进行酶液制备，并以蔗糖或果聚糖(菊粉)为底物测定酶活，从中鉴定出cfru3基因(核苷酸序列SEQ ID NO:1)的编码产物Fru3(氨基酸序列SEQ ID NO:2)主要表现为果糖基转苷活性，几乎无蔗糖和果聚糖水解活性(水解活性大约是转苷活性的0.1％)。黑曲霉果糖基转移酶Fru3催化蔗糖生成低聚果糖的糖谱特征用HPLC法分析后，典型的糖谱如图1所示。

实施例2：果糖基转移酶高产菌株的构建

用EcoRI和PstI酶切质粒pRS305K和用Pfu DNA聚合酶补平，胶回收1.25kb的Kan(G418)抗性编码基因的序列片段，然后与用PstI酶切去除金担子素(Aba)抗性编码基因并补平的质粒pAUR135进行连接，获得重组质粒pAUR-kan(图2)。进一步从黑曲霉cDNA中，采用表1所列引物，运用PCR技术，扩增出inuA的启动子区(PinuA)(采用引物PinuA-1、PinuA-2)和终止子及其下游序列(TiunA)(采用引物TinuA-1、TinuA-2)；采用引物BoxA-1和BoxA-2，PCR扩增出带有接头的cfru3；再通过PCR扩增技术将所获得的PinuA、cfru3、TiunA片段进行融合(采用引物PinuA-1、TinuA-2)，获得体外重组的突变/表达盒PinuA-cfru3-TiunA(核苷酸序列SEQ ID NO:5)，将此片段克隆入pAUR-kan的SmaI位点，获得重组质粒pA::cfru3(图3)。

同理，进一步从黑曲霉cDNA中，通过PCR技术，扩增出inuE的启动子区(PinuE)(采用引物PinuE-1、PinuE-2)和终止子及其下游序列(TiunE)(采用引物TinuE-1、TinuE-2)；采用引物；BoxE-1和BoxE-2，PCR扩增出带有接头的cfru3；再通过PCR扩增技术将所获得的PinuE、cfru3、TiunE片段进行融合(采用引物PinuE-1、TinuE-2)，获得体外重组的突变/表达盒PinuE-cfru3-TiunE(核苷酸序列SEQ ID NO:6)，将此片段克隆入pAUR-kan的SmaI位点，获得重组质粒pE::cfru3(图4)。

将重组质粒pA::cfru3电转化入黑曲霉An-F308菌株中，获得重组子，再在含半乳糖的培养基中进行复筛去除质粒骨架，所获得的重组子经过摇瓶进行果糖基转移酶的酶活测定，获得了重组菌黑曲霉An-fru3II，其特征性基因型为fru3，inuA1::fru3。摇瓶条件下产果糖基转移酶酶活达到186U/mL，较出发菌株提高了85％。进一步将重组质粒pE::cfru3电转化入黑曲霉An-fru3II，同上筛选与摇瓶酶活测定，获得了新菌株An-fru3III，其特征性基因型为fru3，inuA::fru3，inuE::fru3，此菌株在摇瓶条件下的果糖基转移酶合成水平达到243U/mL，较出发菌株提高了1.4倍，并且仅伴随生产微量果糖基水解酶活(表2)。

表2黑曲霉An-fru3III果糖基转移酶摇瓶酶活

实施例3：黑曲霉An-fru3III发酵生产果糖基转移酶

在15L全自动发酵罐中进行发酵制备。接种量5％，发酵培养基组成为：1％玉米浆、5％淀粉糊精、3％豆饼粉、1％硫酸铵、0.5％氯化钙，起始pH5.0，发酵温度28℃，通风1vvm，维持溶氧5-60％，定时取样检测分析果糖基转移酶酶活水平，发酵结束后，离心/过滤除去菌体即为果糖基转移酶酶液。

黑曲霉An-fru3III发酵110h达到最高产酶水平(图5)，果糖基转移酶酶活达4588U/mL，果糖基水解酶活为8.2U/mL。

实施例4：果糖基转移酶用于低聚果糖的生产

在30L反应罐中进行，使用1050g/L的蔗糖溶液，按6U/g蔗糖添加上述实施例3制备的果糖基转移酶，pH 6，65℃保温24h。反应结束后，用HPLC分析其糖分组成，低聚果糖占比最高达到65.36％(表3)。

表3酶法合成低聚果糖糖液中低聚果糖的含量

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一种果糖基转移酶及其高产菌株

<130> 1

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1806

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）An-F308

<400> 1

atgcccaacc gtggcagcag acctggtcat cctacggtcc acatcaccgc accgcattgg 60

attaatgacc cctgcgctcc aggctatgat ccaaggactg gcctctatca tcttttctac 120

caatgtaatc catggggatg cgaatggggt aacatgtcat ggggacatgc aacgagtgaa 180

gacctcctcc actggaccgt tccgtcaaac cagccagttc tggaaccaga tcatgactat 240

gacagggatg gtgtgtttac gggatgcttt cttcctgtca taagccatcc agacaatgag 300

cagctcacag tgttttactc atctgttcgg cagctcccct tccattggag caccccaccc 360

tatccccgga acgcagccgg tttatccatg gccaacagca tcgacggagg aaagacatgg 420

aacaagtcaa atagaaatcc gatcgtccaa ggtgagccag agagcattcg ggtaaccgga 480

ttccgcgacc cgtacatcgc gccctggccg gagatggata aacttcgagg gcaacgatct 540

ctctatggca taatctctgg cggtattcaa gacgcaggac cgactgcctt cctttatgcc 600

gtacagtggc acgagccttt cgactggcaa tatctggggc agcttgtcga tttcccactc 660

cgatttcagc cgtcgaagaa atggtgtggc aactacggga tcaattggga gtgcgccaac 720

tttatgaatc tagagtccga gagcgcatcg gctacgcgta catgtctgat acttggtgct 780

gagggtgatg ttgaacgtgc tcatatcgaa aatcatcagc gaccggtgac cgtgccggca 840

cggacagtaa ggtccctgct gtggatgttt ggagacttgg ctggaagcaa tcatcaaacg 900

gataacctga aatgcagatt caaacatgga gggtaccttg accatggttc tttatatgcg 960

gccagcacat ttaatgatcc aatatctgga agacgaattt tgtatggatg gatccccgag 1020

gaagacatta caggaggcca tgcacgtgag aaaggctgga atggctctct gtgtctccca 1080

agacagctat tcctactctc gcttcgcaac gttaccaggg cggtccgcag caagttgggc 1140

gaaattccca gcattgagat ggtaatagaa gccgacggtt ccaccactct ttattcgtta 1200

ggcatccgcc ctgtatccga aatcacccag ttgcggacca agtgtattca agcccatgaa 1260

gcacggccct tttctctccc tcagtctact cacaacgaat cacgcatttg ccgcacttca 1320

acgtcgtgtt gggagcttga agctaccgtc tcgcttggtg ttagctgcga gactgttggg 1380

ttacgcattc gatgcgcggg ggaagagccc gtccagtggg tcatagtctt ctctcttgtg 1440

gatgagacga ttactattga tcggtcccgt tccagtaccc gttctgacgt gaatacctgt 1500

ccagagaaag gtccatttac cctattttat gtcacagatg gaacacgtac agaaaaatta 1560

gaaagatttc atctccgggt tatcgttgac gcagatattg tcgagatcta cgccaacgac 1620

cgatttgccc tcgcaacgat gatgtaccct ggaagtcaca aggccgaaag ggagatagtc 1680

gcgttcgcta caggtgataa tgagagcgcc agatttgagc aggtcaaaat atgggacgga 1740

ctaaacggaa tggaagctct ggtcagagat gaaggaactg cgaagccaga taatcaaagc 1800

ctatga 1806

<210> 2

<211> 601

<212> PRT

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）An-F308

<400> 2

Met Pro Asn Arg Gly Ser Arg Pro Gly His Pro Thr Val His Ile Thr

1 5 10 15

Ala Pro His Trp Ile Asn Asp Pro Cys Ala Pro Gly Tyr Asp Pro Arg

20 25 30

Thr Gly Leu Tyr His Leu Phe Tyr Gln Cys Asn Pro Trp Gly Cys Glu

35 40 45

Trp Gly Asn Met Ser Trp Gly His Ala Thr Ser Glu Asp Leu Leu His

50 55 60

Trp Thr Val Pro Ser Asn Gln Pro Val Leu Glu Pro Asp His Asp Tyr

65 70 75 80

Asp Arg Asp Gly Val Phe Thr Gly Cys Phe Leu Pro Val Ile Ser His

85 90 95

Pro Asp Asn Glu Gln Leu Thr Val Phe Tyr Ser Ser Val Arg Gln Leu

100 105 110

Pro Phe His Trp Ser Thr Pro Pro Tyr Pro Arg Asn Ala Ala Gly Leu

115 120 125

Ser Met Ala Asn Ser Ile Asp Gly Gly Lys Thr Trp Asn Lys Ser Asn

130 135 140

Arg Asn Pro Ile Val Gln Gly Glu Pro Glu Ser Ile Arg Val Thr Gly

145 150 155 160

Phe Arg Asp Pro Tyr Ile Ala Pro Trp Pro Glu Met Asp Lys Leu Arg

165 170 175

Gly Gln Arg Ser Leu Tyr Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ile Gln Asp Ala

180 185 190

Gly Pro Thr Ala Phe Leu Tyr Ala Val Gln Trp His Glu Pro Phe Asp

195 200 205

Trp Gln Tyr Leu Gly Gln Leu Val Asp Phe Pro Leu Arg Phe Gln Pro

210 215 220

Ser Lys Lys Trp Cys Gly Asn Tyr Gly Ile Asn Trp Glu Cys Ala Asn

225 230 235 240

Phe Met Asn Leu Glu Ser Glu Ser Ala Ser Ala Thr Arg Thr Cys Leu

245 250 255

Ile Leu Gly Ala Glu Gly Asp Val Glu Arg Ala His Ile Glu Asn His

260 265 270

Gln Arg Pro Val Thr Val Pro Ala Arg Thr Val Arg Ser Leu Leu Trp

275 280 285

Met Phe Gly Asp Leu Ala Gly Ser Asn His Gln Thr Asp Asn Leu Lys

290 295 300

Cys Arg Phe Lys His Gly Gly Tyr Leu Asp His Gly Ser Leu Tyr Ala

305 310 315 320

Ala Ser Thr Phe Asn Asp Pro Ile Ser Gly Arg Arg Ile Leu Tyr Gly

325 330 335

Trp Ile Pro Glu Glu Asp Ile Thr Gly Gly His Ala Arg Glu Lys Gly

340 345 350

Trp Asn Gly Ser Leu Cys Leu Pro Arg Gln Leu Phe Leu Leu Ser Leu

355 360 365

Arg Asn Val Thr Arg Ala Val Arg Ser Lys Leu Gly Glu Ile Pro Ser

370 375 380

Ile Glu Met Val Ile Glu Ala Asp Gly Ser Thr Thr Leu Tyr Ser Leu

385 390 395 400

Gly Ile Arg Pro Val Ser Glu Ile Thr Gln Leu Arg Thr Lys Cys Ile

405 410 415

Gln Ala His Glu Ala Arg Pro Phe Ser Leu Pro Gln Ser Thr His Asn

420 425 430

Glu Ser Arg Ile Cys Arg Thr Ser Thr Ser Cys Trp Glu Leu Glu Ala

435 440 445

Thr Val Ser Leu Gly Val Ser Cys Glu Thr Val Gly Leu Arg Ile Arg

450 455 460

Cys Ala Gly Glu Glu Pro Val Gln Trp Val Ile Val Phe Ser Leu Val

465 470 475 480

Asp Glu Thr Ile Thr Ile Asp Arg Ser Arg Ser Ser Thr Arg Ser Asp

485 490 495

Val Asn Thr Cys Pro Glu Lys Gly Pro Phe Thr Leu Phe Tyr Val Thr

500 505 510

Asp Gly Thr Arg Thr Glu Lys Leu Glu Arg Phe His Leu Arg Val Ile

515 520 525

Val Asp Ala Asp Ile Val Glu Ile Tyr Ala Asn Asp Arg Phe Ala Leu

530 535 540

Ala Thr Met Met Tyr Pro Gly Ser His Lys Ala Glu Arg Glu Ile Val

545 550 555 560

Ala Phe Ala Thr Gly Asp Asn Glu Ser Ala Arg Phe Glu Gln Val Lys

565 570 575

Ile Trp Asp Gly Leu Asn Gly Met Glu Ala Leu Val Arg Asp Glu Gly

580 585 590

Thr Ala Lys Pro Asp Asn Gln Ser Leu

595 600

<210> 3

<211> 2640

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）An-F308

<400> 3

agctgcttga caactcccga tcccgtgaat atagcaatcc actctcggta cccggaatct 60

caccttgcat ctccaccatt ttaccaatcg cgttcgctcg ttcgactcct cacattcctt 120

gagtgagaaa ttagtgatct ctccgatgat tagtgatctc tccggatgaa tcggtcttgt 180

ttgtccacca ctaccgttcg atagaagtct cggcctcacg ctctccctga cacggatcgc 240

gttgtccttc cctttataaa aacctgcagg ggcgagcaaa catcacttcg gtataggcat 300

acctctatta actgtgaagg tcttatatga cggacaagga tgcgggagaa atttcgggga 360

aagtcaacgc tgggcatgcg actatcagtt tggggaaatg aaaggcgtct tggccatgat 420

atttatatag ctcgctttcc cgtgccagta gacggcttta cttttctgcc actcacaggt 480

ctctcagaga agtggacttc aagaatacca aattgttcgt tttgctttgt tactccaaga 540

tgttgaatcc gaaggttgcc tacatggtct ggatgacgtg cctgggttta acgttgccca 600

gccaggcgca gtctaatgat taccgtcctt cataccactt cacaccggac cagtactgga 660

tgaacgagcc aaacggcctg attaagatcg gatccacctg gcacctgttc tttcaacaca 720

atccgacggc caatgtatgg ggcaacatat gctgggggca cgctacgagc accgatctga 780

tgcactgggc acacaaaccc actgccattg cggatgagaa cggagtcgaa gcgtttaccg 840

gtacagccta ttatgatcca aacaatgcct ctggccttgg ggattcggca aacccaccct 900

acctggcctg gttcacaggt tataccgttt caagccaaac acaggaccag cgcctggctt 960

tcagtgtcga taacggggcg acgtggacca aatttcaagg caaccccatc atatcaacaa 1020

gccaggaagc accacatgat ataacgggcg gcctcgagag tcgggatcca aaggtattct 1080

tccatcgcca atcggggaac tggatcatgg ttctcgccca tggcgggcag gacaagctgt 1140

ctttctggac gtctgcagac accataaact ggacatggca gagtgacctg aagtccacct 1200

cgatcaacgg cctatcgtcc gatattacag ggtgggaagt ccccgacatg tttgaactcc 1260

cggttgaagg cactgaggag accacgtggg tggtgatgat gacgccggct gaaggatccc 1320

ctgccggtgg taacggggtc ttagctatca ccggttcttt tgacgggaaa agttttacgg 1380

cagatcccgt cgatgcttcg accatgtggc tggacaatgg gcgtgatttc gatggcgctc 1440

tgagctgggt gaacgtgcct gcgtccgatg gacggcggat tatcgccgcc gtcatgaata 1500

gctacggttc caacccgcct acagccacct ggaaagggat gctctccttt ccccggacac 1560

tgtcgctcaa gaaagttggg acgcagcagc actttgttca acagccgatc acagagttgg 1620

acataattag taccagtctg caaacactag aaaaccagac cattacccct ggccaaacat 1680

tgctatcatc gattcgggga actgctctcg atgttcgagt tgctttctac cctgatgctg 1740

gctcggttct gtccctcgcc gtccgaaagg gtgcttcgga gcaaacagtc attaagtaca 1800

cccagtcaga tgccacattg tcggttgatc gaacagagag tggagatacc tcgtatgacc 1860

cggccgcagg tggcgtccat accgccaagt tggaagagga cgacaccgga ctggtttcca 1920

tccgggtgtt ggtggatacg tgttctgtag aggtttttgg cggacaagga gaagccgtca 1980

tttccgacct catcttcccg agtgacagtt ctgatggcct ggccttggag gtaactggcg 2040

gaaatgcagt gctgcagtcg gtggacgtgc ggagtgtttc acttgaatga aggaggcgtg 2100

ggaggctgcc agacggggga aggggattaa gacagtgatt gaggggccta ggtaggaggg 2160

tgaggactgg atgttgaagt tgtactgtct gggctagaag tatactaata aaaatccatc 2220

tttcaagtgg aacgaataag ttggagatgc agagcaggca gggacccaat ccttgctcca 2280

acatggcatt cttttcgtac taagtagcta cctttccctg ctcaaaacct ttatgttgat 2340

aacccttcat aaatgctaac aggccacaca ttatatctcc cgcctaatcc ggacgcacgg 2400

gaatgatgag ggcgtagcac cggtctagca gtgaggctct ggatcatgaa gtgtctgcac 2460

tgtaggtaca cagtctccta ctaggatctt gttcaccggt taattgatgg aatgacagct 2520

tacagtgctt gacaagccta ggctggtggt ggctccgagt cacgctttcc agatcataat 2580

tccagggtaa tgcgagccaa gtgccattca tctcctggat gatcatgtaa cagacacgcc 2640

<210> 4

<211> 2737

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）An-F308

<400> 4

gagcagctat ccgctcaatc ccgaatgagg tccgtgttcg gtcgatgtca acaacacccc 60

acgcggggaa tgatacattg acgttggata accgcattcc ttcaaagacg caccccggat 120

ttgtaagaaa cacaaccggg gctgattgca caagtacaat tgagtcactc gatagcatat 180

atgtggacgg aaagggagag gaatttcaag ttcaagaaac aggaacttga agccagtgcg 240

tgtttacgga aaatatgggc cagatacgaa gatgaggcat taaacttcga tacggcgtca 300

aaacgtagaa gtttgtatat ctgggcgcat tattgcagac ccccaccccg ttgaacgaca 360

gacttggagt ccactggcgc acatataaac ccggtcatcc aatgtctcaa tcttcagaaa 420

tcatcttcag tcacagcacg atttctcaaa gggctcatta gcaatggctc gtcttttgaa 480

ggccgttact gtttgtgcgt tggcgggcat cgctcatgcc ttcaactatg accagcctta 540

ccgtggtcaa taccattttt caccccagaa gaactggatg aatgatccca atgggctttt 600

gtatcataat ggaacctacc atctattctt ccagtacaat cctggtggta tcgagtgggg 660

caacatatca tgggggcatg ctaccagtga ggaccttact cactgggagg agcagcccgt 720

tgcccttctg gcccgaggat acggcagcga tgtcaccgag atgtacttca gcggaagtgc 780

tgttgccgat gtcaataaca cgagtggctt cggaaaggac ggcaagacac ctctagttgc 840

catgtatact tcctatgtac ttgccccatc accgaaccat ctcctggagt gcatatcgct 900

aacagtaatt ccatagtacc ccgttgcaca gacattgccg agtggccaaa ccgtccaaga 960

ggaccagcaa tctcaatcca tcgcctacag tcttgatgac ggtctaacat ggacgacata 1020

cgatgccgcc aacccagtca tccccaaccc tccccagccc taccaagctc aataccagaa 1080

cttccgagac ccctttgtgt tctggcacga cgagtcccag aaatgggttg tcgttacaag 1140

tatagccgaa ctgcacaagc ttgcaattta tacatctgac aacctcaaag actggaagct 1200

agtgagcgaa ttcggtcctt acaatgcgca aggcggcgta tgggagtgcc ccggactttt 1260

caagctaccc cttgacgggg gaagctccac aaaatgggtt atcacgagcg gactgaaccc 1320

cggtggtcct ccaggcaccg tcggctctgg aacccagtac tttgtgggcg agttcgacgg 1380

aaccacattt acgcctgacg ccgatacggt atacccgggt aactcaaccg ccaactggat 1440

ggactggggc ccggacttct atgccgcggc tggctacaac ggcctctcaa ttaaagacca 1500

cgtccatatc ggctggatga acaactggca gtatggtgcg aacatcccca cctacccctg 1560

gcgcagcgcc atggccattc ctcgccacct ggctctgaag accatcaaca acaaaacaac 1620

gctagtccag cagccccagg aagcgtggtc ttccatctcg agcaagcatc cgctctattc 1680

gcgcacctac agtaccttct ctgaaggttc caccaacgca agcacgactg gagaaacgtt 1740

cagggtagat ctgagcttct ctgctacgtc gaaagcctca acatttgcaa tcgccctccg 1800

agcctccgcc aactttaccg agcagaccct tgctggctat gacttcgcca agcagcaaat 1860

cttcctcgac cggaccaagt caggggatgt gtcatttgat aacaccttcg cgagcgtcta 1920

tcatggaccc ttggtgccgg atagcactgg catggtgagg ttgagtatct tcgtcgacag 1980

gtccagcgtc gaggtattcg gaggccaagg tgagacgacc ttgacggctc agatctttcc 2040

tagcaatgat gcggttcacg cccgcctggt gtctactggt ggagctactg aggacgtccg 2100

cgttgatgtt cacaatatta cttcgacgtg gaattaacgt cttgttccta catgtggtag 2160

catcttgtgt ctgttggttt tactatttga ggttaagcgg tagatatact ctaaatcgaa 2220

ttgatatttc ttccacatgg tcattgaata aactagttac cttgcatcaa ggtaccggtg 2280

gccatgacgt cagccgcaat cccatatcgg gtaatgatca ggatcccgag gcatggctgg 2340

ttcacgtgcc ggctgcatga ggtacaagtc tatccgtgag ggggctgatt atagagttac 2400

cttttgctgt cagcatctgt tctttcatgt aaaaatactg aaatcgaaag gcattattaa 2460

atatttacac acgcaatatg tcggagaact acggcgacta tcagactgag atctatggcc 2520

gaggagcatt gacaggcgtc ctgcctaatg tcactaccga ccctcgctta cttgaaaaac 2580

aggcaacgaa ggccttgggc gctcgtagct tccactatgt ggctggcggt gctggagaga 2640

aggctacaat ggatagcaat cgactggctt ttcgacaatg gaagctgtga gttgagtcgt 2700

ttccgccgcg atattgcgat gtagagtcgg aagactg 2737

<210> 5

<211> 2895

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agctgcttga caactcccga tcccgtgaat atagcaaacc actctcggta cccggaatct 60

caccttgcat ctccaccttt ttaccaatcg cgttcgctcg ttcgactcct cacattcctt 120

gagtgagaaa ttagtgatct ctccgatgat tagtgatctc tccggatgaa tcggtcttgt 180

ttgtccacca ctacccttcg atagaagtct cggcctcacg ctctccctga cacggatcgc 240

gttgtccttc cctttataaa gacctgcagg ggcgagcaaa catcacttcg gtataggcat 300

acctctatta actgtgaagg gcttatatga cggacaagga tccgggagaa atttcgggga 360

aagtcaacgc tgggcatgcg actatcagtt tggggaaatg aaaggcgtct tggccatgat 420

atttatatag ctcgcttttc cgtgccagta gacggcttta cttttctgcc actcacaggt 480

ctctcagaga agtggaattc aagaatacca aattgttcgt tttgctttgt tactccaaga 540

tgcccaaccg tggcagcaga cctggtcatc ctacggtcca catcaccgca ccgcattgga 600

ttaatgaccc ctgcgctcca ggctatgatc caaggactgg cctctatcat cttttctacc 660

aatgtaatcc atggggatgc gaatggggta acatgtcatg gggacatgca acgagtgaag 720

acctcctcca ctggaccgtt ccgtcaaacc agccagttct ggaaccagat catgactatg 780

acagggatgg tgtgtttacg ggatgctttc ttcctgtcat aagccatcca gacaatgagc 840

agctcacagt gttttactca tctgttcggc agctcccctt ccattggagc accccaccct 900

atccccggaa cgcagccggt ttatccatgg ccaacagcat cgacggagga aagacatgga 960

acaagtcaaa tagaaatccg atcgtccaag gtgagccaga gagcattcgg gtaaccggat 1020

tccgcgaccc gtacatcgcg ccctggccgg agatggataa acttcgaggg caacgatctc 1080

tctatggcat aatctctggc ggtattcaag acgcaggacc gactgccttc ctttatgccg 1140

tacagtggca cgagcctttc gactggcaat atctggggca gcttgtcgat ttcccactcc 1200

gatttcagcc gtcgaagaaa tggtgtggca actacgggat caattgggag tgcgccaact 1260

ttatgaatct agagtccgag agcgcatcgg ctacgcgtac atgtctgata cttggtgctg 1320

agggtgatgt tgaacgtgct catatcgaaa atcatcagcg accggtgacc gtgccggcac 1380

ggacagtaag gtccctgctg tggatgtttg gagacttggc tggaagcaat catcaaacgg 1440

ataacctgaa atgcagattc aaacatggag ggtaccttga ccatggttct ttatatgcgg 1500

ccagcacatt taatgatcca atatctggaa gacgaatttt gtatggatgg atccccgagg 1560

aagacattac aggaggccat gcacgtgaga aaggctggaa tggctctctg tgtctcccaa 1620

gacagctatt cctactctcg cttcgcaacg ttaccagggc ggtccgcagc aagttgggcg 1680

aaattcccag cattgagatg gtaatagaag ccgacggttc caccactctt tattcgttag 1740

gcatccgccc tgtatccgaa atcacccagt tgcggaccaa gtgtattcaa gcccatgaag 1800

cacggccctt ttctctccct cagtctactc acaacgaatc acgcatttgc cgcacttcaa 1860

cgtcgtgttg ggagcttgaa gctaccgtct cgcttggtgt tagctgcgag actgttgggt 1920

tacgcattcg atgcgcgggg gaagagcccg tccagtgggt catagtcttc tctcttgtgg 1980

atgagacgat tactattgat cggtcccgtt ccagtacccg ttctgacgtg aatacctgtc 2040

cagagaaagg tccatttacc ctattttatg tcacagatgg aacacgtaca gaaaaattag 2100

aaagatttca tctccgggtt atcgttgacg cagatattgt cgagatctac gccaacgacc 2160

gatttgccct cgcaacgatg atgtaccctg gaagtcacaa ggccgaaagg gagatagtcg 2220

cgttcgctac aggtgataat gagagcgcca gatttgagca ggtcaaaata tgggacggac 2280

taaacggaat ggaagctctg gtcagagatg aaggaactgc gaagccagat aatcaaagcc 2340

tatgaaggag gcgtgggagg ctgccagacg ggggaagggg attaagacag tgattgaggg 2400

gcctaggtag gagggtgagg actggatgtt gaagttgtac tgtctgggct agaagtatac 2460

taataaaaat ccatctttca agtggaacga ataagttgga gatgcagagc aggcagggac 2520

ccaatccttg ctccaacatg gcattctttt cgtactaagt agctaccttt ccctgctcaa 2580

aacctttatg ttgataaccc ctcataaatg ctaacaggcc acacattata tctcccgcct 2640

aatccggacg cacgggaatg atgagggcgt agcaccgggc tagcagtgag gctctggatc 2700

atgaagtgtc tgcactgtag ggacacagtc tcctactagg atcttgttca ccgggtaatt 2760

gatggaatga cagcttacag tgcttgacaa gcccaggctg gtggtggctc cgagtcacgc 2820

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tgtaacagac acgcc 2895

<210> 6

<211> 3019

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagcagctat ccgctcaatc ccgaatgagg tccgtgttcg gtcgatgtca acaacacccc 60

acgcggggaa tgatacattg acgttggata accgcatttc ttcaaagacg caccccggat 120

ttgtaagaaa cacaaccggg gctgattgca caagtacaat tgagtcactc gatagcatat 180

atgtggacgg aaagggagag gaaattcaag ttcaagaaac aggaacttga agccagtgcg 240

tgtttacgga aaatatgggc cagatacgaa gatgaggcat taaacttcga ttcggcgtca 300

aaacgtagaa gtttgtatat ctgggcgcat tattgcagac ccccaccccg ttgaacgaca 360

gacttggagt ccactggcgc acatataaac ccggtcatcc aatgtctcaa tcttcagaaa 420

tcatcttcag tcacagcacg atttctcaaa gggctcatta gcaatggctc gtcttttgaa 480

ggccgttact gtttgtgcgt tggcgggcat cgctcatgcc ttcaactatg accagcctta 540

ccgtggtcaa taccattttt caccccagaa gaactggatg aatgatccca atgcccaacc 600

gtggcagcag acctggtcat cctacggtcc acatcaccgc accgcattgg attaatgacc 660

cctgcgctcc aggctatgat ccaaggactg gcctctatca tcttttctac caatgtaatc 720

catggggatg cgaatggggt aacatgtcat ggggacatgc aacgagtgaa gacctcctcc 780

actggaccgt tccgtcaaac cagccagttc tggaaccaga tcatgactat gacagggatg 840

gtgtgtttac gggatgcttt cttcctgtca taagccatcc agacaatgag cagctcacag 900

tgttttactc atctgttcgg cagctcccct tccattggag caccccaccc tatccccgga 960

acgcagccgg tttatccatg gccaacagca tcgacggagg aaagacatgg aacaagtcaa 1020

atagaaatcc gatcgtccaa ggtgagccag agagcattcg ggtaaccgga ttccgcgacc 1080

cgtacatcgc gccctggccg gagatggata aacttcgagg gcaacgatct ctctatggca 1140

taatctctgg cggtattcaa gacgcaggac cgactgcctt cctttatgcc gtacagtggc 1200

acgagccttt cgactggcaa tatctggggc agcttgtcga tttcccactc cgatttcagc 1260

cgtcgaagaa atggtgtggc aactacggga tcaattggga gtgcgccaac tttatgaatc 1320

tagagtccga gagcgcatcg gctacgcgta catgtctgat acttggtgct gagggtgatg 1380

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ggtccctgct gtggatgttt ggagacttgg ctggaagcaa tcatcaaacg gataacctga 1500

aatgcagatt caaacatgga gggtaccttg accatggttc tttatatgcg gccagcacat 1560

ttaatgatcc aatatctgga agacgaattt tgtatggatg gatccccgag gaagacatta 1620

caggaggcca tgcacgtgag aaaggctgga atggctctct gtgtctccca agacagctat 1680

tcctactctc gcttcgcaac gttaccaggg cggtccgcag caagttgggc gaaattccca 1740

gcattgagat ggtaatagaa gccgacggtt ccaccactct ttattcgtta ggcatccgcc 1800

ctgtatccga aatcacccag ttgcggacca agtgtattca agcccatgaa gcacggccct 1860

tttctctccc tcagtctact cacaacgaat cacgcatttg ccgcacttca acgtcgtgtt 1920

gggagcttga agctaccgtc tcgcttggtg ttagctgcga gactgttggg ttacgcattc 1980

gatgcgcggg ggaagagccc gtccagtggg tcatagtctt ctctcttgtg gatgagacga 2040

ttactattga tcggtcccgt tccagtaccc gttctgacgt gaatacctgt ccagagaaag 2100

gtccatttac cctattttat gtcacagatg gaacacgtac agaaaaatta gaaagatttc 2160

atctccgggt tatcgttgac gcagatattg tcgagatcta cgccaacgac cgatttgccc 2220

tcgcaacgat gatgtaccct ggaagtcaca aggccgaaag ggagatagtc gcgttcgcta 2280

caggtgataa tgagagcgcc agatttgagc aggtcaaaat atgggacgga ctaaacggaa 2340

tggaagctct ggtcagagat gaaggaactg cgaagccaga taatcaaagc ctatgacgtc 2400

ttgttcctac atgtggtagc atcttgtgtc tgttggtttt actatttgag gttaagcggt 2460

agatatactc taaatcgaat tgatatttct tccacatggt cattgaataa actagttacc 2520

ttgcatcaag gtaccggtgg ccatgacgtc agccgcaatc ccatatcggg taatgatcag 2580

gatcccgagg catggctggt tcacgtgccg gctgcatgag gtacaagtct atccgtgagg 2640

gggctgatta tagagttacc ttttgctgtc agcatctgtt ctttcatgta aaaatcctga 2700

aatcgaaagg cattattaaa tattttcaca cgcaatatgt cggagaacta cggcgactat 2760

cagactgaga tctatggccg aggagcattg acaggcgtcc tgcctaatgt cactaccgac 2820

cctcgcttac ttgaaaaaca ggcaaagaag gccttgggcg ctcgtagctt caactatgtg 2880

gctggcggtg ctggagagaa ggctacaatg gatagcaatc gactggcttt tcgacaatgg 2940

aagctgtgag ttgagtcgtt tccgccgcga tattgcgatg tagagtcgga agactgacgc 3000

gtataacgct tgatgaaat 3019

Claims

1.一株果糖基转移酶高产黑曲霉，其特征在于，所述黑曲霉具体为黑曲霉An-fru3III，是在黑曲霉(Aspergillus niger)An-F308的基础上，采用SEQ ID NO.1所示的果糖基转移酶替换基因组中的2个果糖基水解酶编码基因—inuA和inuE获得的；

所述黑曲霉(Aspergillus niger)An-F308，保藏号为CGMCC NO.21028；

所述inuA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述inuE的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1所述黑曲霉An-fru3III在生产果糖基转移酶中的应用。

3.权利要求2所述的应用，其特征在于，采用发酵生产果糖基转移酶的方法具体如下：

所述的发酵工艺为：按1-10％的接种量，发酵温度25～36℃，发酵过程中维持溶氧为5～60％，发酵过程中控制pH为4～6，发酵时间为60～150h。