CN113999795B - 一株具有除臭功能的洋葱伯克氏菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株具有除臭功能的洋葱伯克氏菌及其应用，属于微生物技术领域。该菌株是从城市河道污水中分离纯化获得，已于2021年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.22231，分类学命名为洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)。本发明洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)发酵提取液中含有大量除臭菌,对除臭和空气净化有较为明显的作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一株具有除臭功能的洋葱伯克氏菌及其应用。
背景技术
洋葱伯克氏菌是一种广泛存在于水、土壤、植物和人体的革兰氏阴性杆菌，该菌中的一些菌株在生物防治、净化污水方面有巨大的经济和生态价值。人们又发现其中有些菌株可降解农药和除草剂中的有毒和具有致癌作用的化学成分。欧美一些国家也曾因其部分菌株是条件致病菌，从而放弃或者限制该菌作为生物农药的使用,但是目前仍有不少国家在生产和使用以该菌种为原料制成的生物农药，从事农业生产和病虫害防治活动。我国也于1996年允许注册了该类产品。
近年来,洋葱伯克氏菌在农业生产上已经展示出良好的应用前景目前。但是，国内对洋葱伯克氏菌的应用，大多都只停留在农业上，而其在净水方面的研究却几乎没有。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一株具有除臭功能的洋葱伯克氏菌，该洋葱伯克氏菌已于2021年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.22231，分类学命名为洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)。
本发明的目的之二在于提供洋葱伯克氏菌的发酵方法，该发酵方法使用的种子培养基为NA培养基：0.5％蛋白胨，0.3％牛肉膏，0.5％氯化钠，蒸馏水，pH调至7.0。
优选地，洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)发酵时使用的液体发酵培养基为：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO39g,(NH4)2SO41.5g,K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaC10.1g，水1000ml，pH调至7.5。
本发明的目的之三在于提供一种微生物菌剂，该菌剂含有洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)。
本发明的目的之四在于提供利用上述洋葱伯克氏菌的发酵方法获得的发酵液。
本发明的目的之五在于提供该洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)或含有该菌的微生物菌剂在污水除氨中的应用。
本发明的目的之六在于提供该洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)或含有该菌的微生物菌剂在除醛中的应用。
本发明的目的之七在于提供上述洋葱伯克氏菌的发酵方法在污水除氨中的应用。
本发明的目的之八在于提供上述洋葱伯克氏菌的发酵方法在污水除醛中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明成功分离出了一株除臭净化菌种，并且充分利用菌株的这一特性，研发了一款微生物裂解提取液应用于环境除臭和大气异味清除的除味产品。通过微生物发酵过程中产生的生物酶类物质，彻底分解臭气臭味，净化空气，美化环境。
生物保藏说明:
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
保藏编号：CGMCC NO.22231；
保藏日期：2021年04月23日；
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
分类学命名：洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)。
附图说明
图1为本发明洋葱伯克氏菌BBC-1的***发育树。
具体实施方式
实施例1
洋葱伯克氏菌的分离纯化方法：
(1)从保定污水处理厂取20份水样并配置LB固体培养基。
LB固体培养基：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，氯化钠1％，琼脂1.8％，蒸馏水，pH调至7.2。
将20份水样进行平板划线培养，37℃，24h培养。
(2)挑取单菌落，进行摇瓶培养。
①取4个250ml锥形瓶，分别倒入30ml胰酪大豆胨液体培养基，根据平板上细菌的形态和状态，选择性的挑取菌落，分别接入装有培养基的锥形瓶中，100rpm/min，36℃，摇床培养16h后，测量OD值，pH值，涂片显微镜观察。
②配制含多粘菌素B、庆大霉素的BCSA琼脂。
琼脂高压灭菌后，降温至50℃左右，加入2.4ml过滤后的多粘菌素B，1ml过滤后的庆大霉素，摇匀后倒入平皿。分别取培养好的摇瓶培养的菌液进行接种，36℃培养24h后观察菌落生长状态。经镜检观察没有杂菌污染，摇瓶生长良好。
胰酪大豆胨液体培养基为通用型增菌培养基，含多粘菌素B、庆大霉素的BCSA琼脂(含多粘菌素B 60000U/100ml，庆大霉素1mg/100ml)为洋葱伯克氏菌的选择性培养基，对其它微生物有抑制作用(参考文献：高业成,郁晓艺,倪庆桂.食品中的洋葱伯克霍尔德检测方法[J].2014年广东省食品学会年会论文集,2014,251-255.)，通过观察，平皿上菌落生长良好，所以命名为洋葱伯克氏菌BBC-1。
经观察洋葱伯克氏菌BBC-1的菌种形态：革兰氏阴性杆状细胞，具有多根极端鞭毛，在TSA培养基上菌落亮淡黄色，***，边缘整齐至不规则；在KMB培养基上的菌落淡黄绿色，无荧光，在培养基上产生浅黄绿色非荧光扩散色素。
该菌的16sRNA测序序列为：
SEQ ID NO.1：
TGGGGAATCTTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCCATGCCGCGTGAATGATGAAGGTCTTAGGATTGTAAAATTCTTTCACCGGGGACGATAATGACGGTACCCGGAGAAGAAGCCCCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGTGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATTACTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCGGACAGTTAAGTCGGGGGTGAAAGCCCGGGGCTCAACCTCGGAATTGCCTTCGATACTGGCTGTCTTGAGTACGGGAGAGGTGTGTGGGACTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGACACACTGGCCCGTTACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGA。
实施例2
实施例1中分离获得的洋葱伯克氏菌BBC-1的培养方法为：
(1)种子培养。
NA培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，Ph7.0。
将20μL菌种接入到30ml液体培养基中，30℃，200r/min，培养12h。取菌液，检测OD600，pH。
(2)摇瓶发酵。
初始产酶培养基：蛋白胨5g，K2HPO4：2g，MgSO4·7H2O：0.05g，蒸馏水1000ml，pH7.0。将种子菌液接入到上述初始产酶培养基中，接种量0.5％，30℃，200r/min，培养15h。
(3)碳源筛选。
改变初始产酶培养基的碳源，按表1配置5种培养基，接种量0.5％，30℃，200r/min，培养15h。
表1
取菌液，检测OD600，ph，根据菌浓检测筛选出最优碳源。
碳源筛选结果如表2所示。
表2
| 初培养基 | 葡萄糖5g | 葡萄糖7.5g | 淀粉2.5g | 淀粉10g | |
| 灭菌前Ph | 7.03 | 7.03 | 7.04 | 7.02 | 7.02 |
| 灭菌后Ph | 6.99 | 6.81 | 6.76 | 6.96 | 6.97 |
| OD | 1.0587 | 6.5412 | 1.7601 | 1.0069 | 0.7813 |
| 菌液ph | 7.78 | 4.85 | 4.06 | 7.72 | 7.65 |
(4)氮源筛选。
根据上述步骤筛选好的碳源，继续优化氮源。按表3配置6种不同培养基，接种量0.5％，30℃，200r/min，培养12h。
表3
取菌液，检测OD600，ph，根据菌浓检测筛选出最优氮源。
氮源筛选结果如表4所示。
表4
(5)无机盐筛选。
①种子培养。
NA培养基：蛋白胨5g，牛肉膏3g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，pH7.0。将20μL菌种接入到30ml液体培养基中，30℃，200r/min，培养12h。取菌液，检测OD600，pH。
②摇瓶发酵。
初始产酶培养基：葡萄糖2.5g，蛋白胨2g，K2HPO4：2g，MgSO4·7H2O：0.5g，蒸馏水1000ml，pH7.0。将种子菌液，接入到上述初始产酶培养基中，接种量0.5％，30℃，200r/min，培养12h。
③无机盐筛选。
改变初始产酶培养基的无机盐，按表5配置3种培养基，接种量0.5％，30℃，200r/min，培养12h。
表5
| 蛋白胨 | K2HPO4 | MgSO4·7H2O | 葡萄糖 | FeSO4 | |
| ① | 5g | 2g | 0.05％ | ||
| ② | 5g | 2g | 0.1％ | 2.5g | |
| ③ | 5g | 2g | 0.05％ | 2.5g | 0.016％ |
试验结果如表6所示。
表6
实施例3
微生物菌剂除臭试验：
(1)除氨测试。
液体培养采用NA培养基：0.5％蛋白胨，0.3％牛肉膏，0.5％氯化钠，蒸馏水，pH调至7.0。检测OD值，pH值，培养条件为30℃，200r/min。
种子罐液体发酵培养基配方：玉米粉15g，葡萄糖5g，酵母膏5g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO39g,(NH4)2SO41.5g,K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，NaC10.1g，水1000ml，pH调至7.5，接种量0.5％。
试验组：加入0.25％种子菌液(即采用种子罐液体发酵培养基培养菌株获得的菌液1g)，加入0.5g葡萄糖，150ml水，曝气0.3:1/min，5h后，补加水至800ml，继续发酵，对照组：取新FS球5粒，加入800ml纯化水，进行发酵试验。发酵结束后，发酵液参照《氨去除能力参照按照：HJ533-2009环境空气和废气氨的测定纳氏试剂分光光度法》检测，结果如表7所示。
表7
| 名称 | 喷洒前氨浓度 | 喷洒量 | 喷洒后氨浓度 | 效果mg/m3/g |
| 试验组 | 95.78 | 2.01g | 13.85 | 40.76 |
| 对照组 | 95.92 | 2.31g | 20.50 | 32.65 |
(2)除醛测试。
实验室液体培养采用NA培养基：0.5％蛋白胨，0.3％牛肉膏，0.5％氯化钠，蒸馏水，pH调至7.0。检测OD值，pH值，培养条件为30℃，200r/min。
种子罐液体发酵培养基，配方：玉米粉15g,葡萄糖4g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO39g,(NH4)2SO41.5g,K2HPO40.5g,MgSO4·7H2O 0.1g,NaC10.1g,水1000ml,pH调至7.5。
试验组：加入0.25％菌液(即采用种子罐液体发酵培养基培养菌株获得的菌液1g)，加入0.5g葡萄糖，150ml水，曝气0.3:1/min，5h后，补加水至800ml，继续发酵，对照组：取新FS球5粒，加入800ml纯化水，进行发酵试验。发酵结束后，发酵液参照《Q/BT 2761-2006室内空气净化产品净化效果测定方法》，《GB/T15516-1995空气质量甲醛的测定乙酰丙酮法》，结果如表8所示。
表8
| 名称 | 喷洒前醛浓度mg/m3 | 喷洒量/g | 喷洒后醛浓度mg/m3 | 1g去除效果mg/m3 |
| 试验组 | 114.41 | 2.17g | 18.94 | 44.00 |
| 对照组 | 114.67 | 2.13g | 39.14 | 35.42 |
实验表明：本发明的洋葱伯克氏菌发酵液中含有大量除臭菌，对水体净化，臭气去除有明显效果，其所具有的分解功能在污水净化、空气净化方面有积极意义。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 河北雄安福赛生物环境科技发展有限公司
<120> 一株具有除臭功能的洋葱伯克氏菌及其应用
<130> 2021.10.21
<141> 2021-11-12
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 405
<212> DNA
<213> 洋葱伯克氏菌(Burkholderia cepacia)
<400> 1
tggggaatct tgcgcaatgg gcgaaagcct gacgcagcca tgccgcgtga atgatgaagg 60
tcttaggatt gtaaaattct ttcaccgggg acgataatga cggtacccgg agaagaagcc 120
ccggctaact tcgtgccagc agccgtggta atacgaaggg ggctagcgtt gctcggaatt 180
actgggcgta aagggcgcgt aggcggacag ttaagtcggg ggtgaaagcc cggggctcaa 240
cctcggaatt gccttcgata ctggctgtct tgagtacggg agaggtgtgt gggactccga 300
gtgtagaggt gaaattcgta gatattcgga agaacaccag tggcgaaggc gacacactgg 360
cccgttactg acgctgaggc gcgaaagcgt ggggagcaaa cagga 405
Claims (10)
1.一株具有除臭功能的洋葱伯克氏菌，其特征在于，所述洋葱伯克氏菌于2021年04月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.22231，分类学命名为洋葱伯克氏菌（Burkholderia cepacia）。
2.如权利要求1所述的洋葱伯克氏菌的发酵方法，其特征在于，发酵时使用的种子培养基为NA培养基：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%氯化钠，蒸馏水，pH调至7.0。
3.如权利要求2所述的洋葱伯克氏菌的发酵方法，其特征在于，发酵时使用的液体发酵培养基为：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO3 9g, (NH4)2SO4 1.5g, K2HPO40.5g，MgSO4•7H2O 0.1g，NaC1 0.1g，水1000ml，pH调至7.5。
4.如权利要求3所述的洋葱伯克氏菌的发酵方法，其特征在于，发酵培养基中的接种量为0.5%。
5.一种微生物菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1中所述的洋葱伯克氏菌。
6.利用如权利要求2-4中任一项所述的发酵方法获得的发酵液。
7.如权利要求1所述的洋葱伯克氏菌或权利要求5所述的微生物菌剂在污水除氨中的应用。
8.如权利要求1所述的洋葱伯克氏菌或权利要求5所述的微生物菌剂在污水除甲醛中的应用。
9.如权利要求2-4中任一项所述的洋葱伯克氏菌的发酵方法在污水除氨中的应用。
10.如权利要求2-4中任一项所述的洋葱伯克氏菌的发酵方法在污水除甲醛中的应用。
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| KR101489865B1 (ko) * | 2013-08-29 | 2015-02-16 | 경북대학교 산학협력단 | 식물병원성 진균에 대해 항진균 활성을 가지는 벌크홀데리아 세파시아 jbk9 균주, 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식물병원성 진균 방제용 조성물 |
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