CN111349588A

CN111349588A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN111349588A
Application number: CN202010353675.XA
Authority: CN
Inventors: 缪伏荣; 陈鑫珠; 刘景�; 董志岩; 李忠荣
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2040-04-29
Also published as: CN111349588B

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，经过富集培养、初筛、复筛等获得Fb菌株，属贝莱斯芽孢杆菌，革兰氏阳性。该菌株形态特征为：菌体呈杆状，0.4‑0.6μm×0.9‑4.0μm，单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大。经检测，该贝莱斯芽孢杆菌Fb可以耐受55℃的高温，且最适生长温度为45℃，最适生长pH值为3.0‑7.6。本发明菌株能高效降解茶渣，提高茶渣蛋白、氨基酸等，降低茶渣水分和纤维素等，发酵处理后的茶渣可作为饲料原料；可实现无烟、无臭、无污水排放，又能实现有机废弃物的循环利用，从而减少茶渣对环境造成的污染，是一个符合绿色环保的技术。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及工业微生物领域，更具体的说，是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）是芽孢杆菌属的一个新种，因其对病原菌的抑制作用作为农业生产上的生物防治调节剂，该菌能产生具有广谱抗菌活性的次生代谢产物，是用来增加作物产量、维护生态环境和农业生态***的首选生物药剂。国内外未见贝莱斯芽孢杆菌在降解工农业副产物上的应用研究报道。茶渣是茶叶用于生产速溶茶或提取茶多酚后的副产物。我国作为世界上主要的茶叶生产国之一，每年的茶渣产量有数十万吨。分析表明，茶渣中含17%～23%的粗蛋白(crude protein, CP)，1.5%～4.5%的粗脂肪(etherextract， EE)， 3.3%～5.3%的灰分(Ash)，是个较好蛋白饲料资源，具有一定的饲用价值。饲喂茶渣可以减少鸡腹部脂肪堆积，增强奶牛血浆抗氧化能力，提高育肥猪的生长性能和肉品质。茶渣中非水溶性茶叶蛋白是一种既具有营养功能又具有防辐射和降血脂的蛋白质。此外，茶叶蛋白还能改善肉制品品质和风味。

目前大部分茶渣都被丢弃，不仅造成资源浪费，而且还会对生态环境造成污染。因此筛选能高效降解茶渣的微生物具有极大意义。

发明内容

本发明的目的是要提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

为实现上述目的，采用以下技术方案：

所述菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb ，已于2020年2月28日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号为CGMCC No.19438，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述菌株在降解茶渣中的应用。

具体方法如下：

培养基：

(1) LB培养液(L) ：酵母浸粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，NaCl10g，pH6.0，加蒸馏水定容至1L制成，121℃灭菌30min。

（2）纯化固体培养基：LB培养液中加入20g/L琼脂粉，121℃灭菌30min。

（3）分离固体培养基：取新鲜茶渣50g加蒸馏水500ml蒸煮30min，过滤后的茶渣液加入20g琼脂粉，121℃灭菌30min。

（3）液体发酵培养基：酵母浸粉10g，蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，NaCl10g，pH6.0，加蒸馏水定容至1L制成，121℃灭菌30min。

分离筛选方法：

(1) 富集培养：从长年堆积的茶渣处取样品10g，加入盛有50mLLB培养基的250mL锥形瓶中，在45℃、120r/min 条件下富集培养24h，取1mL经富集培养后的培养物接种到新鲜的LB培养基，以相同的条件进行培养。如此重复3 次。

（2）初筛：富集培养物在分离固体培养基上划线培养，45℃培养24h。挑取生长明显的菌落进行复筛。

(3) 复筛：将初筛菌落在纯化固体培养基上划线分离3次，以获得纯培养物，并依据菌种在分离固体培养基的生长情况，挑选生长旺盛的菌株。

（4）菌落形态和菌株形态观察

筛选获得的菌株，平板划线45℃分别培养16h，在自然光下观察菌落形态；革兰氏染色后，观察菌株形态。

（5）菌株的生长条件的测定：在容积为250mL的锥形瓶中，加入LB培养液50mL，接种0.5mL约8*10⁶cfu/ml(OD =1)浓度的菌悬液，在150r/min条件下，分别进行不同的初始pH和温度的培养，测定其最佳的生长条件。

本发明分离筛选得到的Fb菌株在LB培养基45℃培养16h，菌落浅黄色，圆形，表面干燥，不透明，边缘不整齐。

本发明分离筛选得到的Fb菌株，属贝莱斯芽孢杆菌，革兰氏阳性，该菌株形态特征为：菌体呈杆状，0.4-0.6μm×0.9-4.0μm，单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大。经检测，该贝莱斯芽孢杆菌可以耐受55℃的高温，且最适生长温度为45℃，最适生长pH值为3.0-7.6。

本发明的优点在于：由于该贝莱斯芽孢杆菌可以耐受55℃的高温，因而可以很方便地通过控制温度进而控制氧浓度，降低生产工艺和设备要求；可以在很简单的发酵设备（如无防杂菌污染装置）中，利用茶渣作为碳氮源生长；降低设备投入及发酵底物成本；还可以通过提高温度杀死其他非耐高温细菌，从而保证目标菌体单一性。本发明菌株能高效降解茶渣，提高茶渣蛋白、氨基酸等，降低茶渣水分和纤维素等，发酵处理后的茶渣可作为饲料原料；可实现无烟、无臭、无污水排放，又能实现有机废弃物的循环利用，从而减少茶渣对环境造成的污染，是一个符合绿色环保的技术。

附图说明

图1 菌落自然光下形态图。

图2 电镜下菌株形态图。

图3 Fb菌株与相关种的16S rDNA序列***发育树。

图4 Fb菌株与相关种的gyrB基因序列***发育树。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明详细说明。

实施例1

工艺流程：

采集样品→样品预处理→富集培养→选定耐高温菌株→生长性能的测定→最佳生长pH 值的测定→最佳生长温度的测定→细菌的形态观察→获得贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb。

培养基：

本发明贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb的分离筛选方法，是采用高温特殊生境分离方法筛选得到的，其方法包括如下步骤：

采集样品：采集长年堆积的茶渣处取品；

(1) 富集培养：从长年堆积的茶渣处取样品10g，加入盛有50mLLB培养基的250mL锥形瓶中，在45℃、120r/min 条件下富集培养24h。取1mL经富集培养后的培养物接种到新鲜的LB培养基，以相同的条件进行培养。如此重复3次。

(3) 复筛：将初筛菌落在纯化固体培养基上划线分离3次，以获得纯培养物，并依据菌种在分离固体培养基的生长情况，挑选生长旺盛的菌株；挑取有不同形态特征的单菌落，于45℃LB培养基上分别扩繁后，加入终体积分数为20%甘油混匀，于-80℃条件下保存；

（4）菌落形态和菌株形态观察

（5）菌株的生长条件的测定：将活化培养好的菌株调成约8*10⁶cfu/ml(OD =1)浓度的菌悬液，吸取0.5mL加入盛有50mLLB培养液的250mL的锥形瓶中，在150r/min条件下，分别进行不同的初始pH和温度的培养，测定其最佳的生长条件。

最佳生长pH 值的测定：配制不同pH值的LB培养液，各取50mL分装到容积250mL的6个锥形瓶中，接种0.5mL菌悬液，45℃、120r/min条件下培养16h，以LB培养液作空白，在波长630nm处测定菌悬液的光密度。

最佳生长温度的测定：将pH6.0 的LB培养液50ml 置于250mL锥形瓶中，接种0.5mL菌悬液，分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃和60℃条件下培养16h，每个温度梯度6个重复；在波长630nm 处测定其光密度值。

所述的培养震荡的震荡频率为120r/min。

实施例2

通过实施例1所述分离筛选方法获得一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb。对其鉴定结果如下：

（1）观察Fb的菌落形态和菌株形态，Fb菌株在LB培养基45℃培养16h，菌落形态特征为菌体呈杆状，0.4-0.6μm×0.9-4.0μm，单个或成对排列，芽胞近圆形，近端生，孢囊膨大，属贝莱斯芽孢杆菌，革兰氏阳性，具体见图1-2。

经检测，该贝莱斯芽孢杆菌可以耐受55℃的高温，且最适生长温度为45℃，最适生长pH值为3.0-7.6。

（2）菌株生理生化特性：

（3）菌株的分子鉴定

经测序结果表明，菌株Fb的16S rDNA序列长为1440 bp。利用NCBI数据库中的Blast程序分析结果表明，菌株与Bacillus siamensis KCTC 13613T (AJVF01000043)和 Bacillusamyloliquefaciens DSM 7T (FN597644) 菌株的同源性最高, 相似性达到99.93％。采用MEGA5.0软件，邻位链接法显示Fb菌株与相关种的16S rDNA序列***发育树 (图3)。菌株Fb的gyrB测序分析表明，序列长1 176 bp。MEGA5.0软件分析结果表明，其与Bacillus velezensis BCRC 17467^T (DQ903176)的同源性较高，相似性达到100％。用同样的方法将该菌株与其他种属明确的10株菌的gyrB基因构建***发育树(图4)。

结合菌株形态、生理生化特性以及保守基因的序列比较分析，将该菌株Fb鉴定为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb菌粉的制备方法

（1）菌种活化：

将4℃斜面保存的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb活化，将其分别划线于相应固体培养基上，45℃、培养16h ；

菌种来源：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb，自行筛选获得，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.19438；

（2）种子培养：

挑取活化的菌落，将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb接种于种子培养基进行种子培养，在45℃、150r/min摇床培养16h ；

上述种子培养基中按质量浓度包括以下组分：

酵母浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉浸粉5g/L，NaCl 10g/L，PH6.0 ；

（3）上罐发酵培养：

将上一步骤中取得的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb种子液按照10% 接种量接入发酵罐中，发酵培养基为与上述种子培养基相同，通风比1:1.05，45℃，180r/min，培养16h 后收集菌液；

（4）喷雾干燥：

将菌液利用喷雾干燥，采用5% 脱脂奶粉作为保护剂干燥得粉末，喷雾干燥条件为：进风口温度150℃，出风口温度90℃，进料速度为15ml/min。

所述的菌液经喷雾干燥成为菌粉后采用无菌密封袋包装防止吸潮。

实施例4：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb菌粉的应用

包括以下步骤：

（1）新鲜茶渣预处理，对刚排出的茶渣放凉至50℃。

（2）茶渣堆肥发酵：按茶渣质量的1%加入Fb菌粉，混合均匀，以厚度80cm堆积在有挡雨的硬化地板，0-5d每24h翻堆一次，之后不翻堆再经2-3d堆肥自然蒸发水分，当水份在30%以内即可作为饲料原料。周期约为7-8天。

从茶渣常规营养成分看出，茶渣经发酵后的粗蛋白提高14.88%，粗纤维下降9.69%，均存在显著差异；见表1。

表1 茶渣常规营养成分（干基,n=9,%）

注：同列数据肩注相同字母表示差异不显著（P>0.05），肩注相邻或相隔字母分别表示差异显著（P＜0.05）或差异极显著（P＜0.01）。表2同。

从茶渣纤维成分的比较看出，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和木质素分别下降10.72%、4.47%和11.37%，均存在显著差异；见表2。

表2　茶渣纤维成分的比较(干基，n=9，%)

从茶渣氨基酸的组分和含量可以看出，除胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸发酵前后无差异外，两组均为谷氨酸含量最高，其次天冬氨酸；发酵后谷氨酸和天冬氨酸的含量分别提高了6.88%和7.01%；其它各种氨基酸含量变化亦然。氨基酸总量的变化趋势与粗蛋白的变化一致，其含量提高5.98%，均为差异显著，见表3。

表3 茶渣处理前后营养成分对比（干基,n=9,%）

注：同行数据肩注相同字母表示差异不显著（P>0.05），肩注相邻或相隔字母分别表示差异显著（P＜0.05）或差异极显著（P＜0.01）。

以上结果表明本发明Fb菌株能高效降解茶渣，提高茶渣蛋白、氨基酸等，降低茶渣水分和纤维素等，发酵处理后的茶渣可作为饲料原料。可实现无烟、无臭、无污水排放，又能实现有机废弃物的循环利用，从而减少茶渣对环境造成的污染，是一个符合绿色环保的技术。具有广阔的应用前景。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一株贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Fb ，已于2020年2月28日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏号为CGMCC No.19438。

2. 如权利要求1 所述的贝莱斯芽孢杆菌在降解茶渣中的应用。