CN107090411B - 一株可降解烷基酚的球孢白僵菌HAr19菌株及其应用 - Google Patents

一株可降解烷基酚的球孢白僵菌HAr19菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了一株可降解烷基酚的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株及其应用。所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株于2017年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:60166。本发明提供的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株能够显著快速降解烷基酚污染物4‑壬基苯酚，7天后降解率高达97％。本发明提供的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株及其应用方法为所述菌株的实际应用提供技术基础。

Description

一株可降解烷基酚的球孢白僵菌HAr19菌株及其应用
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株可降解烷基酚的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株及其应用。
背景技术
烷基酚(APS)是烷基酚聚氧乙烯醚(APEs或APnEO)的降解产物，具有***效应。APnEO是全球第二大非离子表面活性剂，广泛用作乳化剂、分散剂，是合成洗涤剂主要原料，在工业清洗、纺织印染、造纸、皮革化工、化纤油剂、油田助剂、农药、乳液聚合等工业领域有着广泛的应用，其在环境中被微生物最终降解为APs。4-壬基苯酚是烷基酚类主要污染物。据统计，全球每年有大量的4-壬基苯酚进入土壤或水体中(欧洲73500吨，美国154200吨，中国16000吨，日本16500吨)。4-壬基苯酚在环境中化学性质稳定，不易被降解；脂溶性强易被机体吸收，不易被机体排出；可通过食物链在生态***内进行生物富集而蓄积，对生态造成危害；具有亲脂性，易蓄积于脂肪组织中，即使排放的浓度很低，也极具危害性。
4-壬基苯酚作为环境激素直到20世纪90年代才逐步引发人类重视，防控手段主要集中在易降解替代材料的应用和开发，直到近几年微生物降解4-壬基苯酚的潜力才逐步被人类所认识。4-壬基苯酚结构上的苯环和它的长链烷基造成了4-壬基苯酚的难降解性，但微生物可以使苯酚途径的苯环开环和烷基苯途径的壬烷基断链，且不会产生新污染物，不会造成高成本。因此，具有降解4-壬基苯酚的微生物是非常具有研究价值和开发潜力的。
已有研究表明丝状真菌具有降解烷基酚的潜力。球孢白僵菌是一种丝状虫生真菌，隶属于半知菌亚门(Deteromycotina)、丝孢纲(Hyphomycetes)、丝孢目(Hyphomycetales)、丛梗孢科(Moniliaceac)、白僵菌属(Beauveria)，寄主范围极广，已记载的包括15目、149科的700余种昆虫及蜱螨目的6科、10余种螨和蜱，目前主要应用于农林领域病虫害的生物防治。此前从未发现球孢白僵菌有降解烷基酚类化合物的能力，并在环境污染物生物处理技术领域有应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有烷基酚生物处理的技术不足，提供一株可降解烷基酚的球孢白僵菌HAr19菌株及其应用。
本发明通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株可降解烷基苯酚的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株。所述球孢白僵菌HAr19菌株于2017年4月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCC No.60166，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
球孢白僵菌HAr19菌株属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、白僵菌属。
本发明的HAr19菌株是从广东省广州市白云区蚌湖镇农田地表下15cm的土壤中分离筛选纯化获得的，经形态和分子鉴定为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)。
进一步地，所述球孢白僵菌HAr19菌株能够降解烷基酚。
更进一步地，所述烷基酚为4-壬基苯酚。
本发明的球孢白僵菌HAr19菌株在无碳源培养基中可以快速降解烷基酚类化合物4-壬基苯酚，7天可完全降解率可达到97％，显示了较强的降解效果。
采用本发明的球孢白僵菌HAr19菌株降解烷基酚的其中一种方法为：
S1：将所述球孢白僵菌HAr19菌株进行培养，得到种子液；
S2：将含有烷基酚的待处理样品加入到MS培养基中，将球孢白僵菌HAr19菌株种子液加入到含烷基酚培养基中，调节pH值，150rmp培养降解。
优选地S1所述的培养基为MS培养基：K2HPO44.36g/L,KH2PO41.7g/L,NH4Cl 2.1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO40.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2·2H2O 0.03g/L,葡萄糖20g/L,dH2O补足至1000mL。
优选地S1所述的培养温度为26±2℃，所述的培养时间为24h。
优选地S2中球孢白僵菌HAr19菌株种子液与培养基的体积比为0.5-1.8:9。
更为优选地S2中球孢白僵菌HAr19菌株种子液与培养基的体积比为1:9。
优选地步骤S2培养基中烷基酚的浓度为25-100mg/L。
更为优选地步骤S2培养基中烷基酚的浓度为50mg/L。
优选地所述烷基酚为4-壬基苯酚。
优选地步骤S2中所述的pH值为3-9。
更为优选地步骤S2中所述的pH值为7。
优选地步骤S2中的降解温度为20-45℃，降解天数为4-7天。
更为优选地S2中的降解温度为25℃，降解天数为7天。
本发明还提供含有球孢白僵菌HAr19菌株的组合物，以有效量球孢白僵菌HAr19菌株、球孢白僵菌HAr19菌株的发酵培养物、该菌株发酵培养物离心所得的培养液或其干燥物，该菌株发酵培养物离心所得的培养液或其干燥物为有效成分，加入辅料制成的，应用于降解环境中残存的烷基酚污染物。
有益效果：
本发明提供了一株可降解烷基酚的球孢白僵菌HAr19菌株，这是白僵菌首次应用于环境污染物生物降解领域。所述菌株能够显著降解烷基酚类化合物4-壬基苯酚，7天后降解率高达97％，在生物降解土壤和水体污染物领域有较好的应用前景。本发明提供了球孢白僵菌HAr19菌株降解烷基酚4-壬基苯酚的应用方法，为球孢白僵菌HAr19菌株的实际应用提供技术基础。
附图说明
图1为外加碳源下球孢白僵菌HAr19菌株对4-壬基苯酚的降解曲线图；
图2为不同pH值下球孢白僵菌HAr19菌株对4-壬基苯酚的降解曲线图；
图3为不同温度下球孢白僵菌HAr19菌株对4-壬基苯酚的降解曲线图；
图4为最适条件下球孢白僵菌HAr19菌株对4-壬基苯酚的降解曲线图；
图5为48h实验组和对照组4-壬基苯酚降解物的色谱图,其中a为实验组，b为对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来对本发明进行进一步的说明，但本发明并不局限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，本发明所用的试剂和材料均为市购。
实施例1：球孢白僵菌HAr19菌株的分离、培养与鉴定
1、菌株分离与培养
(1)收集菌株：将新鲜的土壤样品过筛去掉较大石粒和杂物，取净土10g悬浮于90mL0.05％的吐温-80溶液中，摇匀，静置15min，取其上清液2mL稀释于8mL 0.05％吐温-80中。
(2)驯化：吸取上述菌液至含有50mg/L 4-壬基苯酚的MS培养基中(K2HPO44.36g/L,KH2PO41.7g/L,NH4Cl 2.1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO40.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2·2H2O 0.03g/L,dH2O补足至1000mL)进行驯化，菌液与培养基的体积比为1:9，26±2℃，150rmp下培养7天，7天后吸取0.5mL菌液接入新的4-壬基苯酚-MS培养基中，重复10次，得到菌群HR50。4-壬基苯酚贮备液是将4-壬基苯酚用酒精混合溶解，制成1000mg/L贮备液。
(3)纯化：将菌群HR50涂板，做三个重复处理，26±2℃下，恒温培养5d，得到单菌落，选取其中生长状况最好的单菌落，经过进一步涂板纯化后，得到一株纯菌株，命名HAr19，然后用接种环于单菌落上挑取菌丝，接种于PDA平板上继续培养，纯化后保存于4℃冰箱中备用。长期保存于-80℃含有40％甘油的PDA培养基。
2、菌株鉴定
(1)形态学鉴定
将纯化后保存的菌种接于PDA平板上，25℃下，培养3～5d，至菌落刚开始产孢时，挑取适量的菌丝，重悬于0.05％的吐温-80溶液中，取少量于血球计数板上，置于显微镜下观察菌株的产孢结构及分生孢子形态特征，并拍照记录。
球孢白僵菌HAr19菌株的菌丝具隔膜，透明无色；其分生孢子梗的分梗或小枝可以多次直角分叉，并聚集成团，分生孢子梗的主枝或侧枝的着生部位多成直角；分生孢子呈球形，直径在2.00-2.15μm之间，着生在产孢细胞延伸而成的之字形结构上，产孢细胞为瓶状，且多变化，由腹端向上逐渐变细。
菌株在PDA培养基上的形态：菌落平坦，呈粉状或如碎粉笔状，表面白色至淡乳色。
(2)分子鉴定
DNA-ITS测序：利用DNA提取试剂盒提取HAr19菌株的基因组DNA后，对DNA-ITS基因片段进行扩增，送到生物公司进行测序。用Blast搜索程序从GenBank数据库中调出相似性较高的相关菌株的DAN-ITS基因序列，经过序列多重比对和***发育进化分析，发现菌株HAr19与NCBI上球孢白僵菌序列相似性高达99％，并且***发育分析结果显示该菌与球孢白僵菌自然聚为一支，说明该菌株是球孢白僵菌的成员。
实施例2：组合物的制备
取球孢白僵菌HAr19菌株，接种于高温灭菌的PDA斜面培养基上，26±2℃培养24h。
将纯化后的菌株加入高温灭菌的20mL MS摇瓶培养基中(K2HPO44.36g/L,KH2PO41.7g/L,NH4Cl 2.1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO40.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2·2H2O0.03g/L,葡萄糖20g/L,dH2O补足至1000mL)，26±2℃，150rmp下培养24小时得到种子液。
按1:9的接种量将种子液接种于高温灭菌的MS培养基中(K2HPO44.36g/L,KH2PO41.7g/L,NH4Cl 2.1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO40.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2·2H2O0.03g/L,葡萄糖20g/L,dH2O补足至1000mL)，26±2℃，150rmp下培养24小时，获得菌悬液。
将菌悬液离心，收集分生孢子，与辅料混合，干燥，粉碎，得到孢子粉，含量为50-100亿孢子/克。
实施例3：球孢白僵菌HAr19菌株降解4-壬基苯酚的参数优化
1.外接碳源
将纯化后的菌株加入20mL MS摇瓶培养基中(K2HPO44.36g/L,KH2PO41.7g/L,NH4Cl2.1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO40.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2·2H2O0.03g/L,葡萄糖20g/L,dH2O补足至1000mL)，26±2℃，150rmp下培养24小时。
将4-壬基苯酚贮备液加入MS(A)、MS(B)培养基中，培养基中4-壬基苯酚的浓度为50mg/L。将24小时后的菌液分别加入两种MS(A)、MS(B)(体积比为1:9)，MS(A)培养基内含20g/L葡萄糖，MS(B)葡萄糖缺乏。26±2℃，150rmp下培养7天，每24小时测定4-壬基苯酚的含量。
在计划的采样时间内，将含有4-壬基苯酚的MS培养基取出，用二氯甲烷-乙酸乙酯萃取(1:1)回流提取6h，冷却后将提取液移入旋转蒸发器中浓缩。将浓缩液定容后进行气相色谱-质谱分析并对结果进行定量计算。
色谱条件：色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm；载气：(He)；流量：1.2mL/min；电离方式：EI；柱温：70℃(2min)(30℃/min)→160℃(1min)(8℃/min)→300℃(11min)；离子化电压：70eV；进样口温度：280℃；质谱接口温度：280℃；质量扫描范围：35～550/amu；进样方式：不分流；进样量：1μL。
结果如图1所示，在培养基中补充外源碳原会影响球孢白僵菌HAr19对4-壬基苯酚的降解，随着时间的推移，两种培养基中4-壬基苯酚的分解量差异不大。
2.pH值
用1mol/LNaOH或H2SO4将pH值分别调整为3.05.07.09.011.0。接种量、MS培养基成分、4-壬基苯酚含量的测定方法同实施例3。
结果如图2所示，中性环境(pH7.0)最有益于球孢白僵菌HAr19降解4-壬基苯酚，随着pH增大或减小，降解率均会降低，碱性环境尤其不利于球孢白僵菌HAr19降解4-壬基苯酚。
3.温度
培养温度分别设定为15253545℃。接种量、MS培养基成分、4-壬基苯酚含量的测定方法同实施例3。
结果如图3所示，在设定的温度范围内，随着温度升高，4-壬基苯酚的降解率增大，实验后7天，在253545℃处理下，4-壬基苯酚的降解率的差异不大。
实施例4：球孢白僵菌HAr19降解能力的验证
取实施例2中的球孢白僵菌HAr19种子液以1：9的体积比加入含有4-壬基苯酚(50mg/L)，的MS培养基中，调节pH值为7.0，放入25±2℃，150rmp摇床中的进行降解实验，每24小时测定4-壬基苯酚的含量。48小时和7d后测定4-壬基苯酚的分解物。
设置对照组，为不加入球孢白僵菌HAr19菌株的空白试验。其他处理步骤同实验组。
结果如图4所示，相比空白试验组，上述培养条件下本发明所提供的球孢白僵菌HAr19可快速降解4-壬基苯酚，4天后降解率达到90％以上，7天后4-壬基苯酚的降解率达到97％。
通过对4-壬基苯酚降解物的分析(表1图5)，进一步阐明球孢白僵菌HAr19可快速降解4-壬基苯酚，并且在48h的主要降解物有9种，但是在7天后，在上述检测条件下检测不到降解物。
表1 48h 4-壬基苯酚的降解物
Figure BDA0001286048420000061
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一株球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株，其特征在于，所述球孢白僵菌HAr19菌株保藏编号为GDMCC No:60166。
2.一种含有权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株的组合物，其特征在于，以有效量球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株的发酵培养物为有效成分，加入辅料制成的。
3.权利要求1所述的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)HAr19菌株，权利要求2所述的组合物在降解环境中残存的4-壬基苯酚污染物中的应用。
4.根据权利要求 3所述的应用，其特征在于，所述应用按如下方法进行：
(1)将所述球孢白僵菌HAr19菌株加入到MS培养基中，于26±2℃摇床中150rmp培养24小时，得到种子液；
(2)将含有烷基酚的待处理样品加入到MS培养基中，得到含有烷基酚的培养基，再在所述含有烷基酚的培养基中加入所述步骤(1)的种子液，调节pH值3-9，150rmp下培养降解。
5.根据权利要求 4所述的应用，其特征在于所述MS培养基的组分为：K2HPO4 4.36g/L,KH2PO4 1.7g/L,NH4Cl 2.1g/L,MgSO4·7H2O 0.2g/L,MnSO4 0.05g/L,FeSO4·7H2O 0.01g/L,CaCl2·2H2O 0.03g/L,葡萄糖20g/L,dH2O补足至1000mL。
6.根据权利要求 4所述的应用，其特征在于所述步骤(2)中培养条件为温度20-45℃，培养天数为4-7天。
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