CN114891680A - 一种提高草食性及杂食性水产动物健康和生长的预消化饲料 - Google Patents

一种提高草食性及杂食性水产动物健康和生长的预消化饲料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种提高草食性及杂食性水产动物健康和生长的预消化饲料，属于水产饲料领域。本发明采用水产土著鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和索氏鲸杆菌组成的发酵剂对基础饲料进行发酵制备得到预消化饲料。该饲料可显著提高鱼的增重率，降低饲料系数，拥有较高的饲料转化率，从而降低饲料成本。

Description

一种提高草食性及杂食性水产动物健康和生长的预消化饲料
技术领域
本发明涉及水产饲料领域，具体涉及的是一种提高草食性及杂食性水产动物健康和生长的预消化饲料。
背景技术
水产品提供了我国1/3高品质动物蛋白，其中2/3由养殖提供。我国水产养殖规模位居全球首位，产量占到全世界2/3。其中，草食性及杂食性水产动物的养殖量又占总养殖量的3/5。目前普遍认为传统水产养殖饲料经微生物预消化后富含丰富的益生菌等生物活性物质，可改善水产动物肠道健康、提高免疫力。因此，开发预消化饲料成为行业热点。
草食性及杂食性水产动物的饲料配方多以植物性蛋白原料和能量原料为主，植物蛋白原料中非热敏性抗营养因子，通过粉碎、调质、膨化等加工工艺并不能消除其影响，且高的植物性蛋白原料添加比例导致草食性及杂食性鱼类消化道分泌的胰蛋白酶等消化酶活力下降，不能完全消化，排出后造成水环境污染。
发明内容
本发明提供了一种提高草食性及杂食性水产动物健康和生长的预消化饲料，该预消化饲料将原料扩充到糟渣等非常规饲料原料，采用水产土著乳杆菌、芽孢杆菌、酵母菌及鲸杆菌复合配伍为发酵剂发酵进行预处理，可降低抗营养因子对水产动物的不良影响。
本发明首先提供了一种微生物组合物，由鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和索氏鲸杆菌组成。
具体的，所述鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和索氏鲸杆菌的菌数之比为1:17.5:1:1.25。
第二，本发明提供了一种发酵剂，其活性成分包括鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和索氏鲸杆菌。
具体的，每千克所述发酵剂中，所述鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌数分别为8000±800亿cfu、140000±14000亿cfu和8000±800亿cfu；所述索氏鲸杆菌的菌数为10000±1000亿cells。
更为具体的，每千克所述发酵剂中，所述鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母的活菌数分别为8000亿cfu、140000亿cfu和8000亿cfu；所述索氏鲸杆菌的菌数为10000亿cells。
上述的发酵剂中，所述发酵剂还包括载体；
所述载体具体可为质量比为1:1的稻壳粉与沸石粉；
所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌GCC-3；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌HGCC-1；
所述酿酒酵母为酿酒酵母GCC-1；
所述索氏鲸杆菌为索氏鲸杆菌XMX-1。
上述的发酵剂中，所述载体的质量百分含量为26％～35％，具体可为28％。
第三，本发明提供了一种预消化饲料，包括基础饲料和所述发酵剂；所述基础饲料为如下质量百分含量的原料：小麦面粉15±1％；豆粕32±1％；棉粕10±1％；玉米蛋白粉10±1％；米糠11±1％；鸡肉粉15±1％；豆油3％；磷酸二氢钙2.5％；预混料1.5％；
所述发酵剂的质量为基础饲料质量的0.3％～0.7％；具体可为0.5％。
第四，本发明提供了上述预消化饲料的制备方法，为如下方法(1)或(2)：
所述方法(1)包括如下步骤：将所述基础饲料和发酵剂混合，调节水分含量至30wt％～35wt％，发酵，得到所述预消化饲料；
所述方法(2)包括如下步骤：将所述基础饲料和发酵剂制成颗粒料，然后调节水分含量至30wt％～35wt％，发酵，得到所述预消化饲料。
上述的方法(1)中，还包括发酵后将物料制成颗粒和烘干的步骤；具体的，所述烘干的温度为90±5℃。
上述的方法(2)中，所述发酵后还包括烘干的步骤；具体的，所述烘干的温度为 90±5℃。
上述的制备方法中，所述发酵的温度为20～37℃；具体可为37℃；所述发酵的时间为48h～72h；具体可为72h。
所述发酵为先好氧后厌氧发酵，具体可在密闭容器中进行。
上述预消化饲料在养殖草食性及杂食性水产动物中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明具有如下优点：
(1)本发明所用发酵剂来自水产土著菌，更适宜水产动物的生长健康；通过原料筛选、发酵工艺设计筛选、得到了更适合水产动物肠道的预消化饲料配方；
(2)本发明的预消化饲料具有较好的诱食性，可显著提高鱼的增重率，降低饲料系数，拥有较高的饲料转化率，从而降低饲料成本；
(3)本发明所用的土著益生菌及其代谢产物或固有成分更易适应草食及杂食性鱼虾肠道环境，能够调节肠道菌群、增强肝肾功能，维持鱼虾健康稳态。
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
生物材料的菌株编号：GCC-1
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2021年3月9日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21819
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
生物材料的菌株编号：GCC-3
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2021年2月23日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21821
生物材料保藏说明
生物材料的分类命名：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
生物材料的菌株编号：HGCC-1
生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
生物材料的保藏单位简称：CGMCC
生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101
生物材料的保藏日期：2021年2月23日
生物材料的保藏中心登记入册编号：CGMCC No.21820
附图说明
图1为发酵剂无忧伴侣B对棉粕、豆粕、菜粕、玉米蛋白粉、喷浆玉米胚芽粕及谷氨酸渣的发酵程度。
图2为发酵剂无忧伴侣B对小麦面粉的发酵程度。
图3为发酵剂无忧伴侣B对米糠、麸皮的发酵程度。
图4为发酵剂无忧伴侣B对木薯淀粉、糊精的发酵程度。
图5为发酵剂无忧伴侣B对红糖和谷氨酸渣、红糖和玉米蛋白粉组合的发酵程度。
图6为发酵剂无忧伴侣B对谷氨酸渣和麸皮、谷氨酸渣和玉米蛋白粉组合的发酵程度。
图7为发酵剂无忧伴侣B对豆粕和猪肉粉组合的发酵程度。
图8为发酵剂无忧伴侣B对豆粕和鸡肉粉组合的发酵程度。
图9为发酵剂无忧伴侣B对不同水分发酵程度。
图10为发酵剂无忧伴侣B 20℃发酵程度。
图11为发酵剂无忧伴侣B低温条件下发酵程度。
图12为实施例7中预消化饲料水中12h后颗粒度表观。
图13为预消化饲料饲喂2周鱼存活率(SR)、增重率(WG)和饲料系数(FCR)的变化；A为存活率，B为增重率，C为饲料系数。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的索氏鲸杆菌Cetobacteriasomerae XMX-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNo.18908，记载在中国专利申请CN111321093A中。
下述实施例中，如无特殊说明，百分含量均指质量百分含量。
下述实施例中，发酵时调节的水分含量指的是原材料水分和添加水分质量之和占总质量的百分比。
下述实施例所用发酵原料棉粕、豆粕、菜粕、玉米蛋白粉、喷浆玉米胚芽粕、谷氨酸渣、小麦面粉、米糠、麸皮、木薯淀粉、糊精、猪肉粉和鸡肉粉等均购自北京新希望农牧科技有限公司。
下述实施例中的米糠是水稻脱壳后，糙米磨白的副产物；麸皮是小麦表皮。
实施例1酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae GCC-1的获得和鉴定
1、GCC-1的分离纯化
材料：
富集培养基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，0.01％青霉素，余量为水。分离培养基：土豆先洗净去皮，称取200g切成小块，加水煮烂，取八层纱布过滤，加热，添加20g琼脂，待琼脂溶解完后，加入20g葡萄糖，充分搅拌，稍冷却后定容至 1000mL，分装至锥形瓶，115℃高温高压灭菌30min。
取虾养殖池中5～15cm池底污泥，取0.5g于富集培养基中，28℃培养2天；将富集液梯度稀释至10-5，取100μL稀释液于分离培养基中涂布，28℃静置培养；依据菌落形态挑取单克隆，使用YPD培养基28℃，200r/min培养48h，得到单菌落，命名为GCC-1。
2、GCC-1的鉴定
(1)形态鉴定
选取菌种，于YPD培养基划线，30℃静置培养48h，观察菌落形态；
形态鉴定结果：菌落大小约1～2mm，菌落质地均匀为乳白色颜色均一，边缘整齐，菌落表面湿润光滑，易挑起。
(2)分子鉴定
菌种测序工作由北京睿博兴科公司完成，所测基因为16S rDNA；测序结果为序列1所示，经过NCBI blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，该菌属于酿酒酵母。该菌株于2021年3月9日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.21819，该菌株的分类命名为酿酒酵母 Saccharomycescerevisiae。
实施例2鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GCC-3的获得和鉴定
1、GCC-3的分离纯化
材料：MRS培养基购买自海博生物。
分离培养基：向MRS培养基中加入2％的琼脂，2％碳酸钙。
菌种分离自牙鲆肠道，牙鲆为市场购买。对牙鲆进行活体解剖，剪下肠道，挤出肠道内容物，用无菌海水冲洗，在无菌海水中匀浆，匀浆液为样品。取50μL匀浆样品稀释100倍，取100μL稀释样品于分离培养基中涂布，36℃静置培养直至长出菌落。依据菌落形态挑取有溶钙圈的单克隆，使用MRS培养基36℃，200r/min培养48h，得到单菌落，命名为GCC-3。
2、GCC-3的鉴定
(1)形态鉴定
实验室保藏菌种于MRS培养基划线，36℃静置培养48h，观察菌落形态；
形态鉴定显示：菌落大小约2mm，菌落质地均匀，为微白色，湿润，颜色均一，边缘整齐，菌落表面湿润光滑，呈圆形。
(2)分子鉴定
菌种测序工作由北京睿博兴科公司完成，所测基因为16S rDNA；测序结果为序列2所示，经过NCBI blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，该菌属于鼠李糖乳杆菌。该菌株于2021年2月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCCNo.21821，该菌株的分类命名为鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus。
实施例3枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HGCC-1的获得和鉴定
1、HGCC-1的分离纯化
材料：
富集培养基：2％葡萄糖，2％蛋白胨，1％酵母粉，余量为水；
分离培养基：蛋白胨1％，氯化钠0.5％；可溶性淀粉1％；琼脂2％，余量为水。配制时把可溶性淀粉用少量水调成糊状，加入到融化好的培养基中。
取虾养殖池中5～15cm池底污泥，取0.5g于富集培养基中，37℃培养2天；将富集液梯度稀释至10-5，取100μL稀释液于分离培养基中涂布，37℃静置培养；依据菌落形态挑取单克隆，使用LB培养基37℃，200r/min过夜培养得到分离菌，命名为 HGCC-1。
2、HGCC-1的鉴定
(1)形态鉴定
将挑取单克隆，在LB平板上划线，37℃静置培养24h，观察菌落形态。
形态鉴定结果：菌落直径约1cm，边缘不规则表面干燥粗糙有褶皱。
(2)分子鉴定
菌种测序工作由北京睿博兴科公司完成，所测基因为16S rDNA；测序结果为序列3所示，经过NCBI blast(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对，该菌属于枯草芽孢杆菌。该菌种于2021年2月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.21820，该菌株的分类命名为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis。
实施例4发酵剂无忧伴侣B的制备
1、发酵剂无忧伴侣B为5kg菌种包，配方为(以干基计)：鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GCC-3菌剂(活菌含量50亿cfu/g)0.80kg、枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HGCC-1菌剂(活菌含量500亿cfu/g)1.40kg、酿酒酵母Saccharomycescerevisiae GCC-1菌剂(活菌含量100亿cfu/g)0.40kg、索氏鲸杆菌Cetobacteria someraeXMX-1菌剂(菌含量50亿cells/g)1.00kg、载体(稻壳粉，沸石粉质量比1:1混合) 1.40kg。
2、各菌剂的制备方法如下：均采用液体发酵；(1)GCC-3挑取单菌落于MRS 培养基，36℃、180r/min培养24h，按1％(体积百分数)接种量接种于MRS培养基中，36℃、180r/min培养24h，按5％(体积百分数)接种量，接种于MRS培养基中，36℃、180r/min摇瓶发酵48h，收集培养液，低温干燥获得鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GCC-3菌剂；鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GCC-3菌剂中鼠李糖乳杆菌的活菌含量为50亿cfu/g；(2)HGCC-1挑取单菌落于LB培养基，37℃、180r/min 培养24h，按1％(体积百分数)接种量接种于LB培养基中，37℃、180r/min培养 12h，收集培养液，低温干燥获得枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis HGCC-1菌剂；枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HGCC-1菌剂中芽孢杆菌的活菌含量为500亿cfu/g；(3)GCC-1 挑取单菌落于YPD培养基，30℃、180r/min培养48h，按1％(体积百分数)接种量接种于YPD培养基中，30℃、180r/min培养24h，收集培养液，低温干燥获得酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae GCC-1菌剂；酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeGCC-1 菌剂中酿酒酵母菌的活菌含量为100亿cfu/g；(4)XMX-1挑取单菌落于GAM培养基，28℃静置厌氧培养24h，按5％(体积百分数)接种量接种于GAM培养基中，28℃静置厌氧培养12h，将二级种子液按5％(体积百分数)接种量，接种GAM培养基中，在28℃厌氧培养箱中静置发酵48h，收集培养液，低温干燥获得索氏鲸杆菌 Cetobacteria somerae XMX-1菌剂；索氏鲸杆菌Cetobacteria somerae XMX-1菌剂中索氏鲸杆菌的菌含量为50亿cells/g。
3、发酵剂无忧伴侣B的制备方法为将各原料混合均匀即可。
实施例5预消化饲料配方组合筛选
1、发酵剂无忧伴侣B对单一原料的发酵筛选
(1)发酵剂无忧伴侣B对单一植物性蛋白原料棉粕、豆粕、菜粕、玉米蛋白粉、喷浆玉米胚芽粕及谷氨酸渣的发酵实验。
分别称取棉粕200g、43％豆粕(豆粕中粗蛋白质量百分含量为43％)100g、菜粕100g、玉米蛋白粉100g、喷浆玉米胚芽粕200g、谷氨酸渣100g，装入6个发酵袋中；分别称取实施例4中的发酵剂无忧伴侣B1g、0.5g、0.5g、0.5g、1g、0.5g，对应加水100mL、50mL、50mL、50mL、100mL、50mL，混合均匀；将水溶发酵剂无忧伴侣B分别倒入上述发酵袋中，搅拌混合均匀，放入37℃恒温箱发酵。结果如图1所示，发酵24h后④棉粕有中量气体产生，⑤豆粕、⑥菜粕、⑦玉米蛋白粉都有少量气体产生，⑧喷浆玉米胚芽粕、⑨谷氨酸渣无气体产生；发酵48h后④棉粕产气结束，有发酵酸香味，⑤豆粕、⑥菜粕、⑦玉米蛋白粉继续产生气体，有发酵酸香味，⑧喷浆玉米胚芽粕、⑨谷氨酸渣无气体产生。由此可见，棉粕、豆粕、菜粕和玉米蛋白粉均可以使用发酵剂无忧伴侣B发酵，棉粕优于豆粕、菜粕和玉米蛋白粉，但单独发酵效果欠佳，喷浆玉米胚芽粕和谷氨酸渣不能单独发酵。
图1中，④棉粕、⑤豆粕、⑥菜粕、⑦玉米蛋白粉、⑧喷浆玉米胚芽粕、⑨谷氨酸渣，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气；++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气；++++ 表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
称取小麦面粉100g，装入发酵袋中；称取实施例4中的发酵剂无忧伴侣B 0.5g，加水50mL混合均匀；将水溶发酵剂无忧伴侣B倒入发酵袋中，搅拌混合均匀，放入 37℃恒温箱发酵。结果如图2所示，发酵18h后，面粉可见产气增多，气袋胀满3/4，效果较好，可以单独发酵。
图2中，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气； ++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气； ++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
(2)发酵剂无忧伴侣B对单一能量原料米糠、麸皮的发酵实验
分别称取米糠200g、麸皮200g，装入发酵袋中；称取实施例4中的发酵剂无忧伴侣B各1g，对应加水100mL，混合均匀；将水溶发酵剂无忧伴侣B倒入发酵袋中，搅拌混合均匀，放入37℃恒温箱发酵。结果如图3所示，发酵24h后，②米糠和③麸皮都有不同程度的产气；发酵48h后，产气结束，都有酸香味产生。可见，米糠和麸皮都可以单独发酵。
图3中，②米糠、③麸皮，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气；++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气；++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
分别称取木薯淀粉100g、糊精100g，装入发酵袋中；分别称取实施例4中的发酵剂无忧伴侣B各0.5g，对应各加水50mL，混合均匀；将水溶发酵剂无忧伴侣B倒入发酵袋中，搅拌混合均匀，放入37℃恒温箱发酵。结果如图4所示，发酵24h后，木薯淀粉和糊精即产气，但产气量很少，气味微酸；发酵72h后，产气增多，酸味明显，但速度仍然很慢。可见，木薯淀粉和糊精均不适合单独发酵。
图4中，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气； ++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气； ++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
2、发酵剂无忧伴侣B对组合原料的发酵筛选
(1)发酵剂无忧伴侣B对红糖和谷氨酸渣、红糖和玉米蛋白粉组合的发酵实验
称取红糖和谷氨酸渣各100g，混合均匀装入一个发酵袋中；称取红糖150g、玉米蛋白粉50g，混合均匀装入另一个发酵袋中；分别称取实施例4中的发酵剂无忧伴侣B1g，加水100mL，混合均匀；将水溶发酵剂无忧伴侣B分别倒入上述两个发酵袋中，搅拌混合均匀，放入37℃恒温箱发酵。结果如图5所示，发酵24h后，⑧红糖 +谷氨酸渣和⑩红糖+玉米蛋白粉均无明显发酵现象；发酵48h后，⑧无发酵现象，⑩产气明显。可见，红糖和谷氨酸渣组合不能发酵，红糖和玉米蛋白粉组合发酵效果良好。
图5中，⑧红糖+谷氨酸渣、⑩红糖+玉米蛋白粉，-表示不能发酵，没有产气现象； +表示可以发酵，有酸香味，少量产气；++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++ 表示可以发酵，有酸香味，较大量产气；++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
(2)发酵剂无忧伴侣B对谷氨酸渣和麸皮、谷氨酸渣和玉米蛋白粉组合的发酵实验
称取谷氨酸渣400g和麸皮100g，混合均匀装入一个发酵袋中；称取谷氨酸渣400 g和玉米蛋白粉100g，混合均匀装入另一个发酵袋中；分别称取实施例4中的发酵剂无忧伴侣B 2.5g，加水250mL，混合均匀；将水溶发酵剂无忧伴侣B分别倒入上述两个发酵袋中，搅拌混合均匀，放入37℃恒温箱发酵。结果如图6所示，发酵12h 后，①谷氨酸渣+麸皮和②谷氨酸渣+玉米蛋白粉均无明显发酵现象；发酵24h后，①仅有少量气体产生，②无明显变化；发酵48h后，①少量气体产生，无发酵气味，②无变化。可见，谷氨酸渣和麸皮组合、谷氨酸渣和玉米蛋白粉组合均不能发酵。
图6中，①谷氨酸渣+麸皮、②谷氨酸渣+玉米蛋白粉，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气；++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气；++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
(3)发酵剂无忧伴侣B对豆粕和猪肉粉、豆粕和鸡肉粉组合的发酵实验
称取猪肉粉和豆粕各100g，混合均匀装入发酵袋中；称取实施例4中的发酵剂无忧伴侣B1g，加水100mL混合均匀；将水溶发酵剂无忧伴侣B倒入发酵袋中，搅拌混合均匀，放入37℃恒温箱发酵。结果如图7所示，发酵24h后，产生气体；发酵 48h后，结束产气。可见，豆粕和猪肉粉组合可以发酵。
图7中，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气； ++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气； ++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
按照20％沸石粉+80％(鸡肉粉+豆粕)+发酵剂/水的比例，设计以下鸡肉粉和豆粕组合发酵的比例：①20％沸石粉50g+50％鸡肉粉125g+30％豆粕75g+实施例4 中的发酵剂无忧伴侣B1.25g/水127.5g；②20％沸石粉50g+40％鸡肉粉100g+40％豆粕100g+发酵剂无忧伴侣B1.25g/水127.5g；③20％沸石粉50g+30％鸡肉粉75g +50％豆粕125g+发酵剂无忧伴侣B1.25g/水127.5g；④20％沸石粉50g+20％鸡肉粉 50g+60％豆粕150g+发酵剂无忧伴侣B1.25g/水127.5g；⑤20％沸石粉50g+10％鸡肉粉25g+70％豆粕175g+发酵剂无忧伴侣B1.25g/水127.5g。分别放入5个发酵袋，37℃恒温箱发酵。结果如图8所示，发酵19h后，植物基含量分别为50％、60％的③④两个组合样品发酵产气效果较佳，含植物基70％的⑤组合发酵产气效果最佳；胀气速度依次是⑤＞④＞③＞②＝①。可见，20％沸石粉+10％鸡肉粉+70％豆粕组合原料可以发酵，且效果最佳。
图8中，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气； ++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气； ++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
由以上数据可知，对于草食性及杂食性水产动物的预消化颗粒饲料配方，使用实施例4的发酵剂无忧伴侣B，只有米糠、面粉、麸皮等原料可以单一进行发酵，大部分原料都可以进行组合发酵，且产气效果组合原料大于单一原料。因此，以发酵剂无忧伴侣B作为发酵剂，预消化饲料的原料应选择米糠、麸皮、面粉为主要原料，结合按适当比例组合的玉米蛋白粉、豆粕等。
实施例6预消化饲料的发酵工艺条件研究
制备预消化饲料所用原料如下：基础饲料以豆粕粉、棉粕粉、玉米蛋白粉、鸡肉粉作为主要蛋白源，豆油作为主要脂肪源制作而成。配方如下(以下为质量百分数)：小麦面粉15％；豆粕32％；棉粕10％；玉米蛋白粉10％；米糠11％；鸡肉粉15％；豆油3％；磷酸二氢钙2.5％；预混料(北京新路联合水产科技有限公司，1％水产动物用复合预混合饲料)1.5％；每1kg基础组饲料添加5g无忧伴侣B。
下述发酵方法为：将上述原料混合均匀，放入发酵袋，放置在一定温度下发酵。
1、发酵水分含量及时间的研究
温度设置36℃，水分27％、30％、32％、35％，时间24h、48h和72h。结果如图9所示，36℃温度，30％水分以上均可发酵成功，72h发酵基本结束，菌种计数无显著差异。27％水分不可以发酵。
图9中，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气；++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气； ++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
2、发酵温度的研究
温度设置20℃，水分30％，时间24h、48h。结果如图10，温度20℃，水分30％可发酵成功。
图10中，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气； ++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气； ++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
温度设置15℃或18℃，水分32％，时间48h、96h、108h、120h。结果如图11，实验室18℃温度恒温，30％水分发酵速度较慢。实践生产中因为堆积产热而散热慢，可能会好一些，为保证效果，建议低于20℃时采取保温措施。
图11中，-表示不能发酵，没有产气现象；+表示可以发酵，有酸香味，少量产气； ++表示可以发酵，有酸香味，中量产气；+++表示可以发酵，有酸香味，较大量产气； ++++表示可以发酵，有酸香味，大量产气，发酵袋胀满。
实施例7预消化饲料稳定性研究
(1)发酵料制备方法：按照实施例6所述配方中的原料配比混合原料，小型面条机制成颗粒，将颗粒料的水分含量调至30％装入发酵袋，37℃恒温箱中发酵72h。发酵后，采用小型面条机将其制成直径0.42mm颗粒，在90℃恒温烘箱内烘干。
(2)正常料制备方法：按照实施例6中的基础饲料的原料配方先混匀小量原料再接着混匀大量原料的顺序进行逐级扩大混匀，不添加实施例6中的发酵剂无忧伴侣B，饲料配好原料后加适量水混匀，小型面条机制成直径0.42mm颗粒，在90℃恒温烘箱内烘干；
(3)实验方法：设置水体静止组和水体运动组，每组两个500mL烧杯装500mL 水，分别撒入100g正常料和发酵料，运动组两个烧杯内放入小型氧气泵，运动组通气量为1.5L/min使水体产生气泡并流动。12h观察饲料状态。
结果如图12，正常料组在水体静止和水流扰动状态下，12h后饲料的颗粒度完整；发酵料组在颗粒度外观上略微欠缺，但依然保留有完整颗粒度，用其投喂南美白对虾，不影响虾正常进食。
实施例8预消化饲料的应用研究
1、材料
本试验以鲤鱼为实验对象，实验所需鲤鱼从鱼苗场获得，并在标准的水循环中暂养1周。饥饿24h后，选取健康、均匀的幼鱼120尾(85.9±0.6g)，分批称重，按每缸6尾鱼的密度，随机分配到20个养殖缸中，养殖缸规格：45×45×45cm。
基础饲料的制备(以下为质量百分数)：小麦面粉15％；豆粕32％；棉粕10％；玉米蛋白粉10％；米糠11％；鸡肉粉15％；豆油3％；磷酸二氢钙2.5％；预混料(北京新路联合水产科技有限公司，1％水产动物用复合预混合饲料)1.5％。
基础饲料采用实施例7正常料的制备方法制成颗粒料。
发酵饲料的制备：按照每1kg基础组饲料添加5g无忧伴侣B，并加水将饲料终水分含量调节至32％，轻轻混匀后移入呼吸袋，排干空气后密封，置于37℃发酵72h。发酵后，采用小型面条机将其制成直径0.42mm颗粒，在90℃恒温烘箱内烘干。
2、饲养方案(下述百分数均为质量百分数)
实验共分5组，每组4个平行。对照组饲喂基础饲料，处理组分别使用投喂量的5％、10％、15％、20％的发酵饲料替代基础饲料，本试验采用完全随机设计(CRD)，如下：
对照组，基础饲料添加100％，发酵饲料添加0％；处理组1，基础饲料添加95％，发酵饲料添加5％；处理组2基础饲料添加90％，发酵饲料添加10％；处理组3，基础饲料添加85％，发酵饲料添加15％；处理组4，基础饲料添加80％，发酵饲料添加20％。试验期每天投喂3次(7:00，12:00，18:00)。按初始体重的2％饲喂6天，按3％饲喂 7天，按初始体重的6％饲喂15天。
3、养殖环境及水质量检测
养殖***采用商品鱼循环水养殖***。养殖缸容量为90L，养殖水温为26.0℃，养殖周期为4周，期间不换水，每天检测水质。
实验结果：
养殖4周后，鱼缸水质如下：溶解氧(DO)为6mg/L，氨氮含量为0.5mg/L，亚硝酸盐浓度为0.05mg/L。
4、生长性能和饲料利用效率的测量
每两周对实验鱼进行称重处理，将各养殖缸的实验鱼饥饿24h后称重并计算其存活率(SR，％)、增重率(WG，％)、饲料系数(FCR，计算饲料系数时基础饲料和发酵饲料均按照12％的水分折算)，按照以评估饲料添加剂对饲养性能的影响。计算公式如下：
存活率(SR,％)＝100％×试验结束时鱼数量/试验开始时鱼数量；
增重率(WG,％)＝100％×(终末体重(g)-初始体重(g))/初始体重(g)；
饲料系数(FCR)＝[基础饲料摄食量/(100-5.52+12)+发酵饲料摄食量 /(100-31.93+12)]/鱼体增重。
实验结果：
如表1及图13所示，在养殖2周时，对照组与各处理组存活率无显著差异；处理组4的增重率显著高于对照组；相比于对照组，处理组3和处理组4的饲料系数显著降低。由此可见，该饲料对实验鱼存活率无影响，可显著提高鱼的增重率，降低饲料系数，拥有较高的饲料转化率。
表1饲喂2周生长性能参数
Figure BDA0003655442020000121
Figure BDA0003655442020000131
表中，IBW是平均初重；FBW是平均末重；组间上标的字母相同表示差异不显著(p＞0.05)，组间上标的字母不同表示差异显著(p＜0.05,p＜0.01或p＜0.001) 。
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 一种提高草食性及杂食性水产动物健康和生长的预消化饲料
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1020
<212> DNA
<213> 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae GCC-1
<400> 1
agtaatatca gtatagcaat ttatacagtg aaactgcgaa tggctcatta aatcagttat 60
cgtttatttg atagttcctt tactacatgg tataactgtg gtaattctag agctaataca 120
tgcttaaaat ctcgaccctt tggaagagat gtatttatta gataaaaaat caatgtcttc 180
ggactctttg atgattcata ataacttttc gaatcgcatg gccttgtgct ggcgatggtt 240
cattcaaatt tctgccctat caactttcga tggtaggata gtggcctacc atggtttcaa 300
cgggtaacgg ggaataaggg ttcgattccg gagagggagc ctgagaaacg gctaccacat 360
ccaaggaagg cagcaggcgc gcaaattacc caatcctaat tcagggaggt agtgacaata 420
aataacgata cagggcccat tcgggtcttg taattggaat gagtacaatg taaatacctt 480
aacgaggaac aattggaggg caagtctggt gccagcagcc gcggtaattc cagctccaat 540
agcgtatatt aaagttgttg cagttaaaaa gctcgtagtt gaactttggg cccggttggc 600
cggtccgatt ttttcgtgta ctggatttcc aacggggcct ttccttctgg ctaaccttga 660
gtccttgtgg ctcttggcga accgggactt ttactttgaa aaaattagag tgttcaaagc 720
aggcgtattg ctcgaatata ttagcatgga ataatagaat aggacgtttg gttctatttt 780
gttggtttct aggaccatcg taatgattaa tagggacggt cgggggcatc agtattcaat 840
tgtcagaggt gaaattcttg gatttattga agactaacta ctgcgaaagc atttgccaag 900
gacgttttca ttaatcaaga acgaaagtta ggggatcgaa gatgatcaga taccgtcgta 960
gtcttaacat aaactatgcc gactagggat cgggtggggt tttttaatga ccaatcggca 1020
<210> 2
<211> 1436
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌Lactobacillus rhamnosus GCC-3
<400> 2
ccttagacgg ctcgctccct aaaagggtta cgccaccggc ttcgggtgtt acaaactctc 60
atggtgtgac gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgtat tcaccgcggc gtgctgatcc 120
gcgattacta gcgattccga cttcgtgtag gcgagttgca gcctacagtc cgaactgaga 180
atggctttaa gagattagct tgacctcgcg gtctcgcaac tcgttgtacc atccattgta 240
gcacgtgtgt agcccaggtc ataaggggca tgatgatttg acgtcatccc caccttcctc 300
cggtttgtca ccggcagtct tactagagtg cccaactaaa tgctggcaac tagtcataag 360
ggttgcgctc gttgcgggac ttaacccaac atctcacgac acgagctgac gacaaccatg 420
caccacctgt cattttgccc ccgaagggga aacctgatct ctcaggtgat caaaagatgt 480
caagacctgg taaggttctt cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg 540
cgggcccccg tcaattcctt tgagtttcaa ccttgcggtc gtactcccca ggcggaatgc 600
ttaatgcgtt agctgcggca ctgaagggcg gaaaccctcc aacacctagc attcatcgtt 660
tacggcatgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctac ccatgctttc gagcctcagc 720
gtcagttaca gaccagacag ccgccttcgc cactggtgtt cttccatata tctacgcatt 780
tcaccgctac acatggagtt ccactgtcct cttctgcact caagtttccc agtttccgat 840
gcacttcctc ggttaagccg agggctttca catcagactt aaaaaaccgc ctgcgctcgc 900
tttacgccca ataaatccgg ataacgcttg ccacctacgt attaccgcgg ctgctggcac 960
gtagttagcc gtggctttct ggttggatac cgtcacgccg acaacagtta ctctgccgac 1020
cattcttctc caacaacaga gttttacgac ccgaaagcct tcttcactca cgcggcgttg 1080
ctccatcaga cttgcgtcca ttgtggaaga ttccctactg ctgcctcccg taggagtttg 1140
ggccgtgtct cagtcccaat gtggccgatc aacctctcag ttcggctacg tatcattgcc 1200
ttggtgagcc gttacctcac caactagcta atacgccgcg ggtccatcca aaagcgatag 1260
cttacgccat ctttcagcca agaaccatgc ggttcttgga tttatgcggt attagcatct 1320
gtttccaaat gttatccccc acttaagggc aggttaccca cgtgttactc acccgtccgc 1380
cactcgttca aaattaaatc aagatgcaag cacctttcaa taatcagaac tcgttc 1436
<210> 3
<211> 1431
<212> DNA
<213> 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis HGCC-1
<400> 3
tgctataatg cagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg 60
gtgagtaaca cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta 120
ataccggatg gttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc ggctaccact 180
tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga 240
tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300
tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg 360
cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt 420
tcgaataggg cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480
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caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa 600
actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt 660
agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg 720
agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg 780
agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc 840
gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900
ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct 960
ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt 1020
gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc 1080
ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200
gacagaacaa agggcagcga aaccgcgagg ttaagccaat cccacaaatc tgttctcagt 1260
tcggatcgca gtctgcaact cgactgcgtg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320
catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt 1380
tgtaacaccc gaagtcggtg aggtaacctt ttaggagcca gccgccgaag g 1431

Claims (9)

1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HGCC-1，其保藏编号为CGMCC No.21820。
2.一种微生物组合物，由鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和索氏鲸杆菌组成；
具体的，所述鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和索氏鲸杆菌的菌数之比为1:17.5:1:1.25。
3.一种发酵剂，其活性成分包括鼠李糖乳杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和索氏鲸杆菌；
具体的，每千克所述发酵剂中，所述鼠李糖乳杆菌和枯草芽孢杆菌、酿酒酵母活菌数分别为8000±800亿cfu、140000±14000亿cfu和8000±800亿cfu；所述索氏鲸杆菌菌数为10000(±1000)亿cells。
4.根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于：所述发酵剂还包括载体；
所述载体具体可为质量比为1:1的稻壳粉与沸石粉；
所述发酵剂中，所述载体的质量百分含量可为26％～35％；
所述鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌GCC-3；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌HGCC-1；
所述酿酒酵母为酿酒酵母GCC-1；
所述索氏鲸杆菌为索氏鲸杆菌XMX-1。
5.一种预消化饲料，包括基础饲料和权利要求3或4所述的发酵剂；所述基础饲料为如下质量百分含量的原料：小麦面粉15±1％；豆粕32±1％；棉粕10％±1；玉米蛋白粉10±1％；米糠11±1％；鸡肉粉15±1％；豆油3％；磷酸二氢钙2.5％；预混料1.5％；
所述发酵剂的质量为基础饲料质量的0.3％～0.7％；具体可为0.5％。
6.权利要求6所述的预消化饲料的制备方法，为如下方法(1)或(2)：
所述方法(1)包括如下步骤：将权利要求5中所述基础饲料和发酵剂混合，调节水分含量至30wt％～35wt％，发酵，得到所述预消化饲料；
所述方法(2)包括如下步骤：将权利要求5中所述基础饲料和发酵剂制成颗粒料，然后调节水分含量至30wt％～35wt％，发酵，得到所述预消化饲料。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述方法(1)还包括发酵后将物料制成颗粒和烘干的步骤；
具体的，所述烘干的温度为90±5℃；
所述方法(2)中，所述发酵后还包括烘干的步骤；具体的，所述烘干的温度为90±5℃。
8.根据权利要求或7所述的制备方法，其特征在于：所述发酵的温度为20～37℃；所述发酵的时间为48h～72h。
9.权利要求5所述的预消化饲料在养殖草食性及杂食性水产动物中的应用。
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