CN114874302B - 大麦耐湿基因HvMADS1、蛋白及其在抗湿害胁迫中的应用 - Google Patents

大麦耐湿基因HvMADS1、蛋白及其在抗湿害胁迫中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种大麦耐湿基因HvMADS1、蛋白及其在抗湿害胁迫中的应用，所述的蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明通过利用关联分析方法筛选出与大麦耐湿性紧密关联的分子标记，然后利用转录组测序了解湿害胁迫后大麦基因表达变化，结合关联分析和转录组测序，预测大麦耐湿候选基因，并利用转基因拟南芥进行验证；该研究为大麦耐湿育种研究提供了优异种质材料，也为大麦耐湿性分子标记辅助育种提供了理论基础。

Description

大麦耐湿基因HvMADS1、蛋白及其在抗湿害胁迫中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种大麦耐湿基因HvMADS1、蛋白及其在抗湿害胁迫中的应用。
背景技术
湿害是土壤水分达到饱和时对作物正常生长发育所产生的危害。湿害在世界范围内均有发生，尤在北美、澳大利亚、中国、印度等国湿害时常发生。据***粮食及农业组织公布的数据显示，世界范围内约有10％的种植面积受到湿害的影响。大麦是湿害敏感作物之一，湿害严重大麦的生长发育，最终影响产量和品质。尤其是我国长江中下游麦区，湿害是影响该麦区麦类作物高产、稳产的主要限制因子。湿害可以使大麦减产20％-30％，严重的田块甚至绝收。
大麦(Hordeum vulgate L.)已有几千年的种植历史，是世界上最古老的作物之一。大麦种植总面积和总产量仅次于小麦、水稻和玉米，在禾谷类作物中位居第四位。大麦的主要用途包括食用(裸大麦)、酿酒，以及用作饲料。近几年我国大麦的进口量年均维持在500万吨以上。因此，研究耐湿大麦分子调控机理、通过分子设计育种快速选育耐湿大麦新品种，对保证我国粮食安全、促进乡村振兴具有非常重要的意义。
植物的耐湿性是一个复杂的调控过程，涉及到表型形态的适应、生理生化(渗透胁迫、离子平衡、氧化胁迫)的变化以及转运蛋白、转录因子等分子水平上的变化。目前，我国对大麦耐湿种质资源的研究大多集中在形态学、生理生化等方面，还没有相关基因克隆的报道。定位大麦抗逆基因的方法主要有连锁分析和全基因组关联分析，而连锁分析需要构建遗传群体，花费时间较长，而关联分析利用自然群体，随着测序技术的发展，利用关联分析进行基因定位的研究越来越多。因为大麦耐湿调控机理的复杂性，利用关联分析(正向遗传学)结合转录组测序(反向遗传学)的方法可以快速精准的确定大麦耐湿基因。通过拟南芥转基因技术，可以快速的验证大麦耐湿调控基因。
发明内容
针对大麦耐湿性分子遗传机制、基因克隆的研究在国内外相对较少这一现状，本发明通过利用关联分析方法筛选出与大麦耐湿性紧密关联的分子标记，然后利用转录组测序了解湿害胁迫后大麦基因表达变化，结合关联分析和转录组测序，预测大麦耐湿候选基因，并利用转基因拟南芥进行验证；从而提高大麦优良耐湿性种质资源的选择效率，为大麦传统杂交育种工作提供优异亲本材料，也对大麦耐湿性分子标记辅助育种(MAS)选择提供了一定参考。
本发明提供的技术方案如下：
一种大麦耐湿调控相关蛋白，所述的蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
一种大麦耐湿基因，所述基因编码上述大麦耐湿调控相关蛋白。
进一步的，所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供含有上述基因的表达盒、重组载体、重组微生物。
上述蛋白或基因或含有上述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗大麦湿害胁迫中的应用。
上述蛋白或上述基因或含有上述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育大麦、拟南芥耐湿新品种中的应用。
一种培育植物耐湿品种的方法，将上述基因转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物的湿害胁迫抗性高于所述目的植物；所述植物为大麦或拟南芥。
进一步的，所述基因的扩增引物为：
P1正向引物:5’-ATGGAGGGGAGCAGCGGCGG-3’；
P2反向引物:5’-TAGCTGACAAGTATGAATGA-3’。
进一步的，将目的基因与pDONR221载体连接，构建入门载体，然后将入门载体与pB2GW7载体连接，构建含有目的基因的超表达载体。
进一步的，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化法，将权利要求2所述基因导入植物中表达。
本发明的目的通过以下技术手段获得：
一种通过关联分析快速准确鉴定大麦耐湿基因的方法，包括以下步骤：
(1)耐湿性鉴定：选取250份不同来源且无直接亲缘关系的大麦品种(国内外栽培品种、地方品种等)，分别连续两年进行耐湿性鉴定，试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，处理组分蘖期进行湿害处理，对照组植株正常管理；淹水14d后记录萎蔫指数；萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展，无黄化现象；2级：植株基本挺直，最下层叶片出现黄化；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现黄化；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的黄化；5级：植株死亡。
(2)大麦核心种质群体结构和亲缘关系分析：
对国内外栽培品种、地方品种、野生大麦构成的250份大麦核心种质进行简化基因组测序，总测序数据量为303.746Gb，平均每个样本1.215Gb。通过数据分析，共获得6536895各SNP位点，过滤后获得了106131个高质量的SNP位点。采用frappe软件进行群体结构分析。首先创建PLINK的输入文件—Ped文件，然后利用admixture软件构建群体遗传结构和群体世系信息。
(3)与大麦耐湿性紧密关联的分子标记的确定：
利用GEMMA软件，采用混合线性模型(Mixed Linear Model,MLM)对两年重复试验得到的表型数据结合分子标记数据分别进行关联分析。以两年数据的关联分析都能检测到的显著标记位点(P<0.01)为与大麦耐湿性紧密关联的分子标记。2020年，通过萎蔫指数检测到11个大麦耐湿SNP位点，2021年检测到6个SNP位点，其中位于第3号染色体上658.1Mb附近的位点在两年同时检测到，为大麦耐湿相关基因位点。
另一种通过转录组测序分析，挖掘大麦耐湿差异表达基因的方法，包括以下步骤：
(1)在对250份大麦核心种质进行耐湿性鉴定的基础上，筛选出极端耐湿材料TX9425和极端敏感材料Franklin进行湿害处理，分别取湿害处理0h，24h，72h的根系进行转录组测序分析。湿害处理24h后，TX9425和Franklin分别检测到3064和2297个差异表达基因，湿害处理48h后，TX9425和Franklin分别检测到5693和8462个差异表达基因。
(2)差异表达基因的GO功能分析和KEGG富集分析
通过对差异基因的GO功能分析发现，差异表达基因主要集中于氧化还原、催化活性等生物过程；KEGG富集分析发现，差异基因在228个KEGG通路显著富集，主要集中于能量代谢途径、转录因子调控途径、植物激素信号转移途径等。
(3)转录因子差异表达分析
转录因子在植物逆境胁迫中发挥重要作用，对差异基因中的转录因子进行总结分析发现，湿害胁迫24h后的差异基因中检测的97个转录因子，72h后检测到273个转录因子。其中湿害后上调表达的转录因子主要包括AP2/ERF，bZIP，MYB和MADS等。
另一种大麦耐湿基因的确定及育种应用，包括以下步骤：
(1)耐湿基因的确定和获得
全基因组关联分析将大麦耐湿基因定位于第3号染色体上658.1Mb附近，比较大麦参考基因组并结合转录组测序分析，发现在第3号染色体上658.1Mb附近的MADS1基因湿害处理后在TX9425中明显上调表达，而在敏感材料Franklin中差异表达不明显，确定为大麦耐湿候选基因。以TX9425根系为材料，提取植物的总RNA，利用RT-PCR扩增到HvMADS1的基因序列，然后将扩增产物连接到pGEM-Teasy载体上，经测序获得具有目的基因的克隆。
(2)植物表达载体构建与遗传转化：利用Invitrogen公司的Gateway技术构建大麦HvMADS1基因超表达载体。利用BP ClonaseTM enzyme，将目的基因与pDONR221载体连接，构建入门载体，然后利用LR ClonaseTM enzyme，将入门载体与pB2GW7载体连接，构建含有目的基因的超表达载体。通过液氮冻融法将含有目的基因的超表达载体导入农杆菌Gv3101中。利用农杆菌介导的遗传转化法，将HvMADS1编码序列导入拟南芥等植物中表达。通过抗生素筛选、RT-PCR等筛选阳性转基因植株。
(3)转基因植株耐湿性分析：将正常生长35天的转基因和野生型株系进行淹水处理。淹水处理2周后，观察湿害胁迫下转基因植株和野生型植株的表型，从而筛选出对湿害有明显抗性的转基因植株。
本发明的有益效果：
利用全基因组关联分析(GWAS)法筛选与大麦耐湿性状显著相关的SNP位点，再结合转录组测序(RNA-seq)技术，可以快速预测大麦耐湿候选基因，对候选基因进行转拟南芥分析，最终可以确定大麦耐湿调控基因。对大麦耐湿基因开发分子标记，结合常规杂交、回交等技术，聚合大麦耐湿优异等位变异，进而可以快速精准的培育出农艺性状优良、耐湿性强的大麦新品种(系)。
本发明选用来源广泛且无直接亲缘关系的250份大麦品种自然群体为材料，利用简化基因组测序获得106131个高质量的SNP标记对该群体进行群体结构，结合该群体连续两年的耐湿性鉴定数据，运用关联分析方法获得了与大麦耐湿性紧密关联的分子标记位点；利用转录组测序对湿害敏感材料和耐湿材料的根系进行转录组测序分析，发掘与耐湿相关的差异表达基因，关联分析结合转录组分析最终确定大麦耐湿基因HvMADS1，并利用拟南芥转基因对该基因的功能进行验证，该基因在耐湿方面的研究目前未见报道。该研究为大麦耐湿育种研究提供了优异种质材料，也为大麦耐湿性分子标记辅助育种提供了理论基础。
附图说明
图1大麦耐湿性鉴定及萎蔫指数频率分布图；A:自然群体水池中耐湿表现；B：2019年自然群体耐湿指数次数分布图；C：2020年自然群体耐湿指数次数分布图。
图2利用萎蔫指数进行全基因组关联分析的曼哈顿图；A:2019年关联分析图；B:2020年关联分析图。
图3耐湿和湿害敏感材料在湿害胁迫处理下差异表达基因火山图；
A:TX9425湿害胁迫24h；B:TX9425湿害胁迫72h；C:Franklin湿害胁迫24h；D:Franklin湿害胁迫72h。
图4湿害胁迫下差异转录因子统计分析；A:湿害处理24h；B:湿害处理72h。
图5大麦HvMADS1基因序列RT-PCR扩增产物；
图6拟南芥转基因株系和非转基因株系耐湿性表型分析。A:对照条件下；B:湿害处理2周后。
具体实施方式
实施例1大麦耐湿性全基因组关联分析
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
(1)试验材料及其耐湿性鉴定表型数据的获得：
试验材料：不同来源且无直接亲缘关系的250份大麦品种，主要包括国内外栽培品种、地方品种以及野生大麦等。
湿害处理方法：分别于2019年和2020年秋季将实验材料播种于南洋试验场的水池中，行长1m，行距为30cm。试验采用完全随机区组设计，设处理和对照，3次重复，正常生长至分蘖期时进行淹水处理。
指标的观察与测定：淹水14d后记录萎蔫指数，以萎蔫指数(或黄叶数)来指示植株耐湿性；萎蔫指数分级标准为：1级：植株挺直，叶片自然伸展，无黄化现象；2级：植株基本挺直，最下层叶片出现黄化；3级：植株顶端稍有萎蔫弯曲，中下层叶片出现黄化；4级：植株顶端萎蔫弯曲，所有叶片均出现不同程度的黄化；5级：植株死亡。
利用Microsoft Excel 2013软件对两年耐湿性鉴定数据分别进行基本描述性统计分析(表1)，可以看出，两年所有品种的耐湿值平均值分别为2.81和3.13，变异系数分别为21.7％和21.1％，峰度和偏度的绝对值均小于1，说明该群体耐湿表型基本符合正态分布(如图1为耐湿表型及次数分布图)。
表1 250份大麦品种耐湿性的统计分析
(2)大麦耐湿性全基因组关联分析：
对250份大麦自然群体进行简化基因组测序，总的测序数据量为303.746Gb，平均每个样本1.215Gb；高质量的clean data数据量为303.729Gb，平均每个样本1.215Gb。Samtools软件检测共获得了6536895个SNP位点，经过条件为dp3、Miss0.2、Maf0.01的过滤后，最后共获得了106131个高质量的SNP位点用于后续分析，在各条染色体上的分布如图3A。SNP位点结合2年的湿害表型鉴定，利用混合线性模型(MLM)进行全基因组关联分析。2019年利用萎蔫指数共检测到10个SNP位点，2020年共检测到6个SNP位点(表2，图3)。其中在第3号染色体658.1Mb附近在两年都检测到，在两年耐湿性鉴定数据的关联分析中都检测到的分子标记位点即可确定为与大麦耐湿性紧密关联的分子标记位点。
表2两年检测到的与大麦耐湿性显著关联的标记位点
实施例2通过转录组测序分析，挖掘大麦耐湿差异表达基因的方法，包括以下步骤：
(1)在对250份大麦核心种质进行耐湿性鉴定的基础上，筛选出极端耐湿材料TX9425和极端敏感材料Franklin进行湿害处理，分别取湿害处理0h，24h，72h的根系进行转录组测序分析。湿害处理24h后，TX9425和Franklin分别检测到3064和2297个差异表达基因，湿害处理48h后，TX9425和Franklin分别检测到5693和8462个差异表达基因。不同材料不同湿害处理的差异表达基因具体数目如图3所示
(2)差异表达基因的GO功能分析和KEGG富集分析
通过对差异基因的GO功能分析发现，差异表达基因主要集中于氧化还原、催化活性等生物过程；KEGG富集分析发现，差异基因在228个KEGG通路显著富集，主要集中于能量代谢途径、转录因子调控途径、植物激素信号转移途径等。
(3)转录因子差异表达分析
转录因子在植物逆境胁迫中发挥重要作用，对差异基因中的转录因子进行总结分析发现，湿害胁迫24h后的差异基因中检测的97个转录因子，72h后检测到273个转录因子。其中湿害后上调表达的转录因子主要包括AP2/ERF，bZIP，MYB和MADS等(如图4所示)。
实施例3大麦耐湿基因的确定及育种应用
(1)大麦耐湿基因HvMADS1的克隆
全基因组关联分析将大麦耐湿基因定位于第3号染色体上658.1Mb附近，比较大麦参考基因组并结合转录组测序分析，发现在第3号染色体上658.1Mb附近的MADS1基因湿害处理后在TX9425中明显上调表达，而在敏感材料Franklin中差异表达不明显，确定为大麦耐湿候选基因。设计特异引物P1正向引物:5’-ATGGAGGGGAGCAGCGGCGG-3’(SEQ ID NO:3)和P 2反向引物:5’-TAGCTGACAAGTATGAATGA-3’(SEQ ID NO:4)，采用常用的CTAB法从TX9425中提取根系总RNA，并反转录合成cDNA，利用上述引物P1和P2从RNA反转录得到的cDNA中扩增出如SEQ ID NO:1所示的大麦耐湿基因的CDS序列，基因HvMADS1的CDS序列全长798bp(图4)。
具体步骤如下：
①向离心管中加入CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取缓冲液[2％(W/V)CTAB，NaCl 1.4mol/L，EDTA(乙二胺四乙酸)20mmol/L，Tris·HCl100mmol/L，2％(W/V)PVP]和10％β-巯基乙醇，在水浴锅中预热；
②将大麦根系液氮冷却研磨，加入提取液中，混匀，65℃水浴10分钟；
③加入等体积的氯仿：异戊醇(体积比24：1)混合液，颠倒混匀，静置10min，4℃12000g离心10min；
④取上清，重复步骤③；
⑤取上清，加入终浓度为2mol/L的LiCl，冰浴10-12小时，11000rpm，4℃离心15min，弃上清，用75％乙醇清洗沉淀两次，溶于适量的DEPC(焦碳酸二乙酯)处理水中待用；
⑥从大麦品种TX9425中提取根系总RNA为模板，利用反转录酶(购自ThermoFisher Scientific公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为：65℃5min，42℃50min，70℃10min；
⑦利用上述引物P1和P2从RNA反转录得到的cDNA中扩增出大麦MADS1基因的CDS序列；
反应条件：94℃预变性4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，33个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pMD18-T载体(购自宝生物工程大连有限公司)，转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因。从阳性克隆中提取携带有HvMADS1基因CDS序列的质粒。
(2)植物表达载体构建与遗传转化
利用Invitrogen公司的Gateway技术构建大麦HvMADS1基因超表达载体。利用BPClonaseTM enzyme，将目的基因与pDONR221载体连接，构建入门载体，然后利用LRClonaseTM enzyme，将入门载体与pB2GW7载体连接，构建含有目的基因的超表达载体。通过液氮冻融法将含有目的基因的超表达载体导入农杆菌Gv3101中。利用农杆菌介导的遗传转化法，将HvMADS1编码序列导入拟南芥等植物中表达。通过抗生素筛选、RT-PCR等筛选阳性转基因植株。
本试验使用的遗传转化方法如下：
①农杆菌的培养
首先，在带有对应抗性选择的固体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan 100mg/L、琼脂1.5g/L)上预培养携带有目的基因HvGS2的农杆菌48小时，培养温度28℃；挑取预培养农杆菌单菌落，接种于对应抗性选择的液体LB培养基(10g/L蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L氯化钠、Kan 100mg/L)中，于28℃200rpm摇床培养过夜，至菌液浓度OD600值约为0.8～1.0。
②花序法侵染拟南芥
采用改良的花序侵染法转化拟南芥。挑取含有目的基因质粒的农杆菌单菌落，转入100mL LB液体培养基中，置入28℃摇床中200r/min过夜培养，使农杆菌菌液浓度达到OD600在0.8～1.0时，4000r/min离心10min，弃上清后，用100mL含有蔗糖5g、SilwetL-77 50μL的LB液体培养基重新悬浮农杆菌菌液。将拟南芥花盆倒扣于含有菌悬液的烧杯中，将拟南芥的花序浸在菌液中10～20s，黑暗下培养24h后，置于温度25℃、湿度为60％、光照强度3000～4000lx和16h/8h光周期的光照培养箱中培养，隔天浇水和培养植株，待开花后收获种子。将收获的拟南芥种子用8％NaClO酒精溶液(95％酒精配制)中消毒5min后，在选择培养基(MS+50mg/L卡那霉素+7g/L琼脂+30g/L蔗糖)上进行筛选。
(3)转基因植株耐湿性分析
为了能进一步分析大麦耐湿基因HvMADS1的生物学功能，我们将该基因在拟南芥中实现了过量表达，并拟从转基因植株耐湿性的表型特征来验证基因HvMADS1在湿害胁迫调控上的生物学功能。具体实验步骤如下：在前期筛选获得的HvMADS1基因转化拟南芥获得的T3代阳性转基因株系中，随机挑选3个株系的种子，对照用拟南芥野生型种子(WT)，在1/2MS培养基上培养至4叶期，将幼苗移栽到装有营养土的盆钵中，在人工气候室中培养35天。将转基因株系和野生型放入水箱中，进行淹水处理，淹水2周后，观察转基因材料与野生型材料耐湿性的差异。结果表明，湿害胁迫后，转基因株系的耐湿性明显强于非转基因材料(图6)。
①HvMADS1基因转基因T3代苗RT-PCR检测具体试验步骤如下：
为了验证转基因拟南芥T3代株系耐湿能力的改变是否与转入的HvMADS1基因有关，采用RT-PCR方法对部分转基因拟南芥植株中HvMADS1基因表达进行了检测。具体步骤如下：
采用TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)从转基因拟南芥T3代3个株系中提取植株的总RNA(提取方法参照TRIZOL试剂说明书操作)，利用反转录酶(购自ThermoFisher Scientific公司)将其反转录合成cDNA第一条链，反应条件为65℃5min，42℃50min，70℃10min。先用报道的内参基因Actin对反转录得到的cDNA进行检测和浓度调整，进行PCR检测，确保内参基因均能在对照野生型拟南芥和转基因拟南芥植株中均能扩出。然后，根据HvGS2基因的序列，利用引物P1和P2，进行RT-PCR检测，反应条件为：94℃预变性4min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1.5min，33个循环；72℃延伸10min。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 盐城师范学院
<120> 大麦耐湿基因HvMADS1、蛋白及其在抗湿害胁迫中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 798
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggagggga gcagcggcgg caagcacttc atcctcgtcc acggcctttg ccacggcgcg 60
tggtgctggt acgagctcgt gccgatgctc tgcgccgcgg ggcaccgggt caccgcgctc 120
gacatggccg cgtgcggcgc gcacccggcg cgcatggacg aggtggcgtc cttcgaggac 180
tactcgcgac cgctgctcga cgccgtggcc gcggcgccag ccggcgagag gctggtcttg 240
gtcgggcaca gcctcggcgg gatcaacatc gcgctcgcca tggagaggtt cccgcgcaag 300
gtcgccgccg ccgtgttcct cgtcgcgtcc atgccgtgcg tcggcaggca catgggcgtc 360
aacacggagg agatcatgag acagatcaag ccggatttct tcatggacat gaagaggatg 420
cttctgaaca cgagcaagtg ccctcgacct gcactcgtgt ttggcccgaa attactggcc 480
gcaaaactgt acgatcgaag ctcagcagag gatcagacgc tggctacgat gctggtgaga 540
ccggggtgcc agttcttgga tgacccgacg atgaaggacg aggctctgct caccgacgac 600
aactacgggt cggtgaagaa ggtatatgtg gtggccatgg ctgacgcctc aaacaccaag 660
gagatgcagc gctggatggt cgatctgagc cctggcacgg aggtcgagga gatcgccgga 720
gctgaccaca tggtcatgtg ttcgaaaccg agggaactct gtggtgtact gcttcggata 780
gctgacaagt atgaatga 798
<210> 2
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Glu Gly Ser Ser Gly Gly Lys His Phe Ile Leu Val His Gly Leu
1 5 10 15
Cys His Gly Ala Trp Cys Trp Tyr Glu Leu Val Pro Met Leu Cys Ala
20 25 30
Ala Gly His Arg Val Thr Ala Leu Asp Met Ala Ala Cys Gly Ala His
35 40 45
Pro Ala Arg Met Asp Glu Val Ala Ser Phe Glu Asp Tyr Ser Arg Pro
50 55 60
Leu Leu Asp Ala Val Ala Ala Ala Pro Ala Gly Glu Arg Leu Val Leu
65 70 75 80
Val Gly His Ser Leu Gly Gly Ile Asn Ile Ala Leu Ala Met Glu Arg
85 90 95
Phe Pro Arg Lys Val Ala Ala Ala Val Phe Leu Val Ala Ser Met Pro
100 105 110
Cys Val Gly Arg His Met Gly Val Asn Thr Glu Glu Ile Met Arg Gln
115 120 125
Ile Lys Pro Asp Phe Phe Met Asp Met Lys Arg Met Leu Leu Asn Thr
130 135 140
Ser Lys Cys Pro Arg Pro Ala Leu Val Phe Gly Pro Lys Leu Leu Ala
145 150 155 160
Ala Lys Leu Tyr Asp Arg Ser Ser Ala Glu Asp Gln Thr Leu Ala Thr
165 170 175
Met Leu Val Arg Pro Gly Cys Gln Phe Leu Asp Asp Pro Thr Met Lys
180 185 190
Asp Glu Ala Leu Leu Thr Asp Asp Asn Tyr Gly Ser Val Lys Lys Val
195 200 205
Tyr Val Val Ala Met Ala Asp Ala Ser Asn Thr Lys Glu Met Gln Arg
210 215 220
Trp Met Val Asp Leu Ser Pro Gly Thr Glu Val Glu Glu Ile Ala Gly
225 230 235 240
Ala Asp His Met Val Met Cys Ser Lys Pro Arg Glu Leu Cys Gly Val
245 250 255
Leu Leu Arg Ile Ala Asp Lys Tyr Glu
260 265
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggagggga gcagcggcgg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tagctgacaa gtatgaatga 20

Claims (10)

1.一种大麦耐湿调控相关蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
2.一种大麦耐湿基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述大麦耐湿调控相关蛋白。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物。
5.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因或含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在抗大麦湿害胁迫中的应用。
6.权利要求1所述蛋白或权利要求2或3所述基因或含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育大麦、拟南芥耐湿新品种中的应用。
7.一种培育植物耐湿品种的方法，其特征在于，将权利要求2或3所述的基因转入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物的湿害胁迫抗性高于所述目的植物；所述植物为大麦或拟南芥。
8.根据权利要求7所述的育植物耐湿品种的方法，其特征在于，所述基因的扩增引物为：
P1正向引物:5’-ATGGAGGGGAGCAGCGGCGG-3’；
P2反向引物:5’-TAGCTGACAAGTATGAATGA-3’。
9.根据权利要求7所述的育植物耐湿品种的方法，其特征在于，将目的基因与pDONR221载体连接，构建入门载体，然后将入门载体与pB2GW7载体连接，构建含有目的基因的超表达载体。
10.根据权利要求7所述的一种培育植物耐湿品种的方法，其特征在于，利用农杆菌介导的遗传转化法，将权利要求2所述基因导入植物中表达。
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CN110128516A (zh) * 2019-04-16 2019-08-16 扬州大学 大麦耐湿调控基因HvERF2.11、蛋白及其在育种中的应用
CN110129291A (zh) * 2019-04-16 2019-08-16 扬州大学 大麦耐湿调控基因HvACO1、蛋白及其在育种中的应用

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